Divers taxons microbiens rares ont réagi à la profondeur de Deepwater Horizon

The ISME Journal volume 10, pages 400–415 (2016)Citer cet article

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L'éruption du puits de pétrole Deepwater Horizon (DWH) a généré un énorme panache d'hydrocarbures dispersés qui a considérablement modifié la communauté microbienne des eaux profondes du golfe du Mexique. Un enrichissement significatif de populations microbiennes distinctes a été observé, mais on sait peu de choses sur l'abondance et la richesse des écotypes microbiens spécifiques impliqués dans la biodégradation des gaz, des hydrocarbures et des dispersants à la suite des déversements d'hydrocarbures. Ici, nous documentons une diversité auparavant non reconnue de taxons étroitement apparentés affiliés à Cycloclasticus, Colwellia et Oceanospirillaceae et décrivons leur distribution spatio-temporelle dans les eaux profondes du Golfe, à proximité du site de rejet et à une distance croissante de celui-ci, avant, pendant et après la décharge. Une méthode de calcul hautement sensible (oligotypage) appliquée à un ensemble de données généré à partir d'un pyroséquençage de 454 étiquettes des régions V4-V6 du gène ribosomal 16S bactérien, a permis la détection de la dynamique de la population au niveau de l'unité taxonomique sous-opérationnelle (0,2 % de similarité de séquence ). La signature biogéochimique des échantillons d'eaux profondes a été évaluée par le nombre total de cellules, les concentrations d'alcanes à chaîne courte (C1-C5), les nutriments, le carbone organique et inorganique dissous (coloré), ainsi que les taux d'oxydation du méthane. L'analyse statistique a élucidé les facteurs environnementaux qui ont façonné la dynamique écologiquement pertinente des oligotypes, qui représentent probablement des écotypes distincts. Les principaux dégradeurs d'hydrocarbures, adaptés au suintement d'hydrocarbures naturels à diffusion lente dans le golfe du Mexique, se sont révélés incapables de faire face aux conditions rencontrées lors du déversement de DWH ou ont été dépassés. En revanche, divers taxons rares ont rapidement augmenté en abondance, soulignant l'importance de sous-populations spécialisées et d'écotypes potentiels lors de déversements massifs de pétrole en haute mer et peut-être d'autres perturbations à grande échelle.

Le plus grand rejet d'hydrocarbures en haute mer de l'histoire a libéré des quantités sans précédent de gaz et de pétrole dans les profondeurs de l'océan du nord du golfe du Mexique (ci-après dénommé le golfe) à la suite de l'explosion et du naufrage de la plate-forme de forage offshore Deepwater Horizon (DWH) en 2010. Au début de l'incident DWH, avant que la colonne montante endommagée ne soit coupée, l'injection d'hydrocarbures dans la colonne d'eau s'est produite sous la forme d'un jet prononcé qui a émergé de la colonne montante cassée, modifiant la chimie des eaux profondes à proximité de la tête de puits de Macondo. Le jet de pétrole et de gaz montant dans la colonne d'eau a entraîné de l'eau de mer froide (Johansen et al., 2001; Socolofsky et al., 2011) et a généré un panache d'eau profonde riche en hydrocarbures prolifique qui a été détecté au sud-ouest du puits par sa fluorescence. (Camilli et al., 2010 ; Diercks et al., 2010 ; Hazen et al., 2010) et le profil de diffusion de la lumière (Diercks et al., 2010), ainsi que par des concentrations élevées d'hydrocarbures spécifiques (Camilli et al. ., 2010 ; Diercks et al., 2010 ; Valentine et al., 2010 ; Joye et al., 2011 ; Kessler et al., 2011b ; Reddy et al., 2012) et du dispersant Corexit (Kujawinski et al., 2011). Le panache d'eau profonde s'étendait sur des profondeurs comprises entre 1000 et 1300 m, dans une région d'au moins 35 km de long sur 2 km de large (Camilli et al., 2010).

Au début de la décharge DWH, les eaux profondes impactées par les hydrocarbures abritaient des populations bactériennes considérablement enrichies liées à Oceanospirillum, Cycloclasticus, Colwellia, Pseudoalteromonas, Rhodobacterales et methylotrophs (Mason et al., 2012 ; Reddy et al., 2012 ; Redmond et Valentine , 2012 ; Valentine et al., 2012). Les observations in situ et les découvertes en laboratoire indiquent que ces bactéries ont joué un rôle clé dans la biodégradation du pétrole dans le panache. Les changements de composition dans l'abondance des hydrocarbures impliquaient une utilisation microbienne préférentielle des alcanes à chaîne courte et de poids moléculaire plus élevé dérivés du pétrole (Valentine et al., 2010 ; Kessler et al., 2011b), tandis que des anomalies locales d'oxygène dissous (Joye et al., 2011 ; Kessler et al., 2011a, 2011b) ont indiqué une respiration aérobie importante des alcanes (Valentine et al., 2010 ; Crespo-Medina et al., 2014). De plus, le sondage des isotopes stables et la génomique unicellulaire ont identifié des populations microbiennes impliquées dans la dégradation des hydrocarbures ou l'enrichissement des gènes métaboliques qui orchestrent la dégradation des hydrocarbures dans le panache, Colwellia oxydant probablement l'éthane et le propane (Redmond et Valentine, 2012), Oceanospirillum dégradant le cyclohexane ( Mason et al., 2012) et Cycloclasticus utilisant des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) (Yakimov et al., 1998).

Les descriptions des communautés microbiennes à l'aide de grands ensembles de données de gènes marqueurs en combinaison avec des paramètres environnementaux bien caractérisés offrent une méthode puissante pour évaluer les réponses dynamiques des assemblages bactériens à des conditions écologiques modifiées. L'approche courante des attributions de taxons de séquence de gènes d'ARN ribosomique 16S (ARNr) repose généralement sur des seuils de similarité de séquence (par exemple, 97 %) pour identifier les unités taxonomiques opérationnelles (OTU), visant à minimiser l'influence des erreurs de séquençage aléatoires (Huse et al. , 2010 ; Kunin et al., 2010). Bien que les schémas de distribution des OTU parmi les échantillons environnementaux soient fréquemment utilisés pour déduire les fonctions écologiques des populations microbiennes, cette approche ne détecte pas de petites variations dans la séquence du gène de l'ARNr 16S qui reflète différents écotypes (Ward, 1998 ; Eren et al., 2013). Le concept d'écotype décrit une collection de souches avec des éléments génétiques subtilement différents, qui permettent d'occuper des niches écologiques légèrement différentes tout en préservant la signature génétique et le (presque) plein potentiel écophysiologique (Konstantinidis et Tiedje, 2005). La spécificité écologique de populations étroitement apparentées pourrait par exemple être indiquée par la croissance sur un nouveau substrat ou par la plasticité métabolique, par exemple, la réalisation de plusieurs métabolismes en fonction des conditions environnementales (Konstantinidis et al., 2006). Une telle flexibilité métabolique était presque certainement avantageuse pour divers taxons présents à la suite du déversement de DWH, car, par exemple, des écotypes étroitement apparentés de Colwellia pourraient avoir oxydé l'éthane, le propane et le benzène ou leurs sous-produits métaboliques (Redmond et Valentine, 2012).

Pour résoudre les différences environnementales pertinentes entre les séquences de taxons microbiens étroitement liés qui répondent aux conditions géochimiques fluctuantes (par exemple les écotypes), des approches bioinformatiques permettant une résolution sous-OTU sont nécessaires (Tikhonov et al., 2014). L'oligotypage distingue les variations subtiles de nucléotides dans les lectures d'amplicon du gène de l'ARNr 16S selon lesquelles les stratégies de regroupement de routine convergeraient en une seule OTU (Eren et al., 2013). L'indice écologiquement puissant de l'entropie de Shannon ignore la variation stochastique, par exemple, l'erreur de séquençage, et utilise des sites riches en informations pour désagréger des séquences similaires en oligotypes qui représentent des populations microbiennes discrètes dans des communautés échantillonnées dans différents contextes écologiques. Les seuils de dissemblance pour les oligotypes peuvent être aussi bas que 0,2 %, contre les 3 % couramment utilisés obtenus à l'aide du regroupement OTU.

Dans ce travail, nous avons approfondi la diversité microbienne du panache d'hydrocarbures en eau profonde DWH dans une mesure jamais tentée auparavant. Nous rapportons un niveau de diversité non reconnu parmi les principaux micro-organismes impliqués dans la dégradation des hydrocarbures et décrivons leur réponse spatio-temporelle à l'infusion de pétrole, de gaz et de dispersant dans les eaux profondes du Golfe. Des échantillons ont été prélevés avant, pendant et après le rejet, à proximité immédiate du site de rejet et à une distance croissante de celui-ci (tableau 1). Nous avons étudié la dynamique des populations microbiennes de taxons étroitement apparentés par l'analyse d'oligotypes de gènes d'ARNr 16S bactériens. La signature géochimique des fluides du panache a caractérisé les facteurs environnementaux à l'origine des changements remarquables observés dans l'abondance relative de taxons microbiens étroitement apparentés, qui représentent probablement des écotypes distincts.

Des échantillons ont été obtenus du nord du golfe du Mexique (tableau 1, figure supplémentaire S1), lors des croisières R/V Pelican (PE 10-20, mars 2010), R/V Walton Smith (WS1010, mai/juin 2010), R/ V Oceanus (OC468-2, septembre 2010), N/R Atlantis (AT18-2, novembre 2010), N/R Endeavour (EN496, juillet 2011), N/R Endeavour (EN510, juin 2012) et N/R Falkor (FA006, novembre 2012). La tête de puits DWH est située dans le bloc 252 du Mississippi Canyon (latitude 28,7381, longitude -88,3659 ; ci-après MC252). Les prélèvements impactés par le rejet de DWH ont été effectués dans le panache (hauteur d'eau de 1000 à 1300 m), au dessus du panache ou en dessous du panache. De plus, nous avons échantillonné différents endroits sur une superficie d'environ 105 000 km2 pour évaluer l'impact du panache en eau profonde. Pour faciliter l'identification des échantillons, les échantillons ont été numérotés (1 à 20) et désignés par « PRE », « DUR » et « POST » pour indiquer le moment de l'échantillonnage par rapport au déversement (avant, pendant et après le rejet), suivi par le site d'échantillonnage (indiqué par le numéro de bloc de bail du site, tel que défini par le Bureau of Ocean Energy Management). Les désignations originales des échantillons de croisière sont données dans le tableau 1. Les échantillons ont été caractérisés par des différences dans l'ampleur des rejets de gaz et de pétrole en fonction du moment de l'échantillonnage (tableau supplémentaire S1). Un échantillon unique a été prélevé en novembre 2012 directement dans la zone impactée par le DWH (19-POST-MC252) ; à notre connaissance, il s'agit de l'échantillon le plus proche de la tête de puits récupéré à ce jour (la distance à la tête de puits était de 72 m). Un autre échantillon unique (20-POST-MC253) a été obtenu à partir d'un suintement récemment découvert situé légèrement à l'est de MC252. La source de ce suintement reste hypothétique, cependant, elle pourrait provenir du réservoir MC252. Les deux échantillons (19-POST-MC252 et 20-POST-MC253) reflètent probablement un mélange de communautés microbiennes pélagiques et benthiques, car l'eau de mer a été récupérée près de la surface des sédiments et, d'après l'observation visuelle lors de l'échantillonnage par véhicule télécommandé, contenait des sédiments. particules. L'échantillonnage des séries chronologiques entre mars 2010 et novembre 2012 nous a permis d'estimer l'étendue de la perturbation et du rétablissement de la population microbienne pélagique endémique par l'événement DWH. De plus, des sites de suintement d'hydrocarbures naturels dans le nord du golfe ont été échantillonnés pour élucider les communautés microbiennes de fond dégradant le gaz et le pétrole qui prévalent dans l'environnement en eau profonde du golfe.

Les sites de suintement situés au bloc 118 du Mississippi Canyon, ci-après dénommé MC118, sont situés à environ 150 km au sud de Pascagoula, MS, (latitude moyenne 28,8522, longitude moyenne -88,4928) et à 26 km au nord-nord-ouest de MC252 à une profondeur d'eau de 900 M. Les suintements à MC118 ont été impactés par le panache d'eau profonde, cependant, nous avons échantillonné sur ce site 1 mois avant le début du rejet d'huile DWH, en mars 2010 (1-PRE-MC118 et 2-PRE-MC118 ; Tableau 1). Ces échantillons de MC118 reflétaient la communauté de suintement de fond pélagique naturelle qui est endémique à cette zone où le panache d'hydrocarbures en eau profonde s'est dispersé environ 6 à 8 semaines plus tard. En général, les suintements de MC118 sont caractérisés par des rejets de gaz naturel et de pétrole, des communautés chimiosynthétiques, dont Beggiatoa (Lloyd et al., 2010), des vers de glace méthane et des moules et palourdes chimiosymbiotiques, indiquant des flux élevés d'hydrocarbures et des taux de fond élevés d'activité microbienne ( Bowles et al. 2011).

Comme MC118, les sites de suintement situés au bloc 600 de Green Canyon, ci-après GC600, sont caractérisés par un important suintement de gaz et de pétrole, une macrofaune de suintement (y compris des palourdes et des moules chimiosymbiotiques) ainsi que des tapis microbiens qui colonisent la surface des sédiments et d'abondants affleurements carbonatés (Roberts et al., 2010). La zone GC600 est à 260 km au sud-ouest de MC252 (latitude moyenne 27,3696, longitude moyenne -90,5693) et n'a pas été directement impactée par le panache d'eau profonde DWH. Les échantillons prélevés à GC600 (17-POST-GC600 et 18-POST-GC600 ; tableau 1) représentent les communautés naturelles de suintements pélagiques à la suite du déversement d'hydrocarbures DWH (juin et novembre 2012). GC600 est l'un des suintements de pétrole naturels les plus actifs du golfe du Mexique à une profondeur d'eau de 1250 m et a été décrit en détail précédemment (Joye et al., 2010 ; Roberts et al., 2010 ; Hu et al., 2012) .

Une rosette CTD instrumentée pour mesurer la conductivité (salinité), la température, la profondeur, la fluorescence de la chlorophylle, la transmission du faisceau, ainsi que la fluorescence de l'huile, équipée de douze 10 litres (R/Vs Walton Smith, Pelican) ou vingt-quatre 20 litres (R/ Vs Oceanus, Atlantis, Endeavour, Falkor) des bouteilles Niskin, ont été utilisées pour prélever des échantillons d'eau. Des échantillons d'eau supplémentaires ont été prélevés à l'aide de bouteilles Niskin de 1 litre fixées à un véhicule télécommandé ou à un carottier multiple. Après récupération de la rosette ou des bouteilles Niskin individuelles (véhicule télécommandé/carottier multiple), des échantillons d'eau ont été prélevés en fixant une section de tube en silicone propre (rincée à l'acide, rincée et séchée au Milli-Q) à l'orifice et en drainant l'eau dans un bouteille pré-nettoyée (imbibée de HCl, rincée et séchée au MQ). Les bouteilles ont été rincées trois fois avant le remplissage. Au laboratoire, des sous-échantillons pour le comptage cellulaire, les analyses moléculaires et la géochimie ont été prélevés. Les échantillons de numération cellulaire ont été fixés avec du formol (concentration finale 4%) et stockés à -20 ° C jusqu'à l'analyse. Pour l'analyse moléculaire, les cellules ont été concentrées en filtrant 1 litre d'eau de mer à travers un filtre sterivex à l'aide d'une pompe péristaltique. Les filtres ont été congelés rapidement dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à l'extraction de l'ADN. À l'exception des sous-échantillons de CH4/alcane à chaîne courte, les échantillons de géochimie ont été prélevés de la bouteille à l'aide d'une seringue, puis passés à travers un filtre de 0,2 μm (Gelman Acrodisk ou Target cellulose) et ensuite aliquotés et fixés pour diverses analyses (voir Géochimie section). Tous les flacons d'échantillons géochimiques ont été lavés à l'acide, rincés à l'eau ultra pure et brûlés à 500 ° C avant utilisation.

Le pH de l'échantillon a été déterminé immédiatement à l'aide d'un électromètre à haute impédance étalonné avec des étalons certifiés. Pour l'analyse de la concentration en ammonium (NH4+), 1 ml d'échantillon filtré à 0,2 μm a été conservé avec 200 μl de réactif phénol ; l'échantillon fixé a été stocké à 4 °C et analysé en 1 à 2 jours à l'aide de la méthode colorimétrique à l'indophénol (Solorzano, 1969). Les échantillons de nutriments ((NOx−=nitrate (NO3−)+nitrite (NO2−), nitrite (NO2−) et phosphate (PO43−)) et de carbone organique dissous ont été passés à travers un filtre de 0,2 μm dans des flacons Nalgene propres et congelés à -20 °C jusqu'à l'analyse, comme décrit précédemment (Joye et al., 2004). Le carbone organique dissous a été mesuré à l'aide d'un analyseur de carbone organique total Shimadzu (TOC-V ; Shimadzu Corporation, Kyoto, Japon) sur acidifié (pH<2) échantillons après aspersion avec de l'air sans CO2 pendant 15 minutes Filtre (Gelman Acrodisk et filtres en cellulose Target) blancs (eau milliQ passée à travers les filtres) pour les matières organiques dissoutes ont été exécutés en parallèle et se sont avérés sans conséquence.

Pour la quantification du méthane ou des alcanes à chaîne courte (éthane, propane, butane et pentane), les gaz ont été récupérés soit par extraction dans l'espace de tête (N/R Pelican, croisières Walton Smith) soit à partir d'un échantillon d'eau de 750 ml par sonication sous vide (tous les autres croisières) (Crespo-Medina et al., 2014). Le volume de gaz récupéré a été enregistré et l'échantillon de gaz a été transféré quantitativement dans un flacon de sérum ; les alcanes ont ensuite été quantifiés par chromatographie en phase gazeuse. Pour l'analyse du carbone inorganique dissous, 1 ml d'échantillon filtré à 0, 2 μm a été injecté dans un flacon d'espace de tête de 6 ml purgé à l'He et scellé par sertissage, qui a ensuite été acidifié avec 0, 1 ml d'acide phosphorique concentré. Le méthane ou les alcanes à chaîne courte (méthane, éthane, propane, butane et pentane) et le carbone inorganique dissous ont été mesurés sur un chromatographe en phase gazeuse équipé d'un détecteur à ionisation de flamme (Shimadzu GC 14A avec une pré-colonne Haysep DB de 0,5 m et une colonne de 2 m Colonne Carbosphere (Alltech Instruments, Deerfield, IL, USA)) et un méthaniseur (Shimadzu) pour convertir le dioxyde de carbone en méthane pour une quantification précise. La composition isotopique du carbone inorganique dissous a été déterminée à l'aide d'un système de spectroscopie à cavité annulaire Picarro iCO2 avec une précision de 0,5 ‰. La matière organique dissoute colorée, un bon indicateur de l'huile dissoute (Diercks et al., 2010), a été quantifiée à l'aide d'un fluoromètre WetLabs ECO-FL (Philomath, OR, USA) monté sur le cadre de la rosette.

Les taux d'oxydation du méthane ont été mesurés à l'aide d'une technique de radiotraceur CH4 tritié (3H) (Carini et al., 2005, Crespo-Medina et al. 2014). Pour chaque profondeur échantillonnée, des échantillons d'eau de mer (échantillons vivants en triple (n = 3) et un témoin tué) ont été prélevés avec un tube Tygon attaché à une seringue et remplis, de bas en haut, sans bulles d'air dans des flacons à scintillation en verre de 7 ml permettant le débordement. de l'échantillon, pour remplir le flacon sans espace de tête. Pour les échantillons témoins, 500 µl d'éthanol (96%) ont été ajoutés immédiatement pour stopper l'activité microbienne. Les flacons ont été immédiatement scellés avec des septa en caoutchouc butyle exempts de bulles qui ont été fixés avec un bouchon à vis ; les échantillons ont été stockés à 4 ° C jusqu'à l'injection du traceur (généralement dans les 12 à 36 h). Dans certains cas, le stockage pendant de plus longues périodes avant la détermination du taux était nécessaire (par exemple, sur les croisières dépourvues de fourgon d'isolement des radio-isotopes); nous avons constaté que le stockage jusqu'à plusieurs semaines ne modifiait pas les taux d'oxydation du méthane (voir Addendum à Crespo-Medina et al. 2014). Une aliquote de 100 μl de solution de traceur C3H4 a été injectée dans chaque échantillon à travers les septa de butyle à l'aide d'une seringue étanche aux gaz, donnant une activité de traceur d'environ 75 000 dpm par ml-1 d'échantillon. Les échantillons ont été incubés pendant 48 h à température in situ dans l'obscurité. Les incubations ont été terminées en modifiant les échantillons avec 200 μl d'éthanol, ce qui a servi à arrêter l'activité biologique. Le C3H4 marqué a été éliminé en purgeant l'échantillon avec de l'air hydraté pendant au moins 25 min. Un cocktail de scintillation (Scintiverse BD, Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) a été ajouté et les échantillons ont été comptés pour l'activité 3H2O à l'aide d'un compteur à scintillation liquide Beckman 6500 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Les constantes de vitesse d'oxydation du méthane (k) ont été calculées selon

(où A=activité et t=temps) et multiplié par la concentration de CH4 in situ pour déterminer les taux d'oxydation du méthane.

Les comptages totaux des cellules individuelles ont été effectués par microscopie à épifluorescence après coloration à l'orange d'acridine (AODC) selon les méthodes standard (Hobbie et al., 1977). L'extraction de l'ADN a été réalisée à partir de l'ensemble du filtre sterivex (voir la section Collecte d'échantillons) à l'aide du kit Gentra Puregene (Qiagen, Valencia, CA, USA) comme décrit précédemment (Sinigalliano et al., 2007), en combinaison avec une solution d'enzyme lytique (Qiagen ; Zettler, 2013). Les extraits d'ADN ont été stockés à -80 ° C jusqu'à l'amplification par PCR. Les régions V3–V5 et V4–V6 du gène ARNr 16S ont été analysées par pyroséquençage (Thor Marteinsson et al., 2013). Nous avons effectué un contrôle de la qualité et un ajustement des lectures de séquences comme décrit précédemment (Huse et al., 2010) et attribué une taxonomie à l'aide de l'alignement global pour la taxonomie des séquences (GAST ; Huse et al., 2008) et un SILVA organisé par le Laboratoire de biologie marine (MBL). base de données version 108 (Quast et al., 2013). Les traces ont été soumises à l'archive de lecture de séquence et sont disponibles sous l'ID Bioproject PRJNA234441.

Toutes les séquences ont été tronquées pour minimiser les artefacts d'erreur de séquençage. Pour ce faire, les lectures V3V5 et V6V4 (tableau supplémentaire S2) ont été réduites à une région conservée (longueur de lecture de 371 ou 362 paires de bases, respectivement). Par la suite, nous avons utilisé UCLUST (Edgar, 2010) pour regrouper les séquences en OTU sur la base d'un seuil de similarité de 97 % (tableau supplémentaire S3). Des séquences représentatives de chaque groupe ont été sélectionnées et la taxonomie a été attribuée avec GAST (Huse et al., 2008).

Pour déterminer les indices de diversité (couverture de Good, indice de Shannon, richesse, régularité, inverse de Simpson) et les indices de Morisita-Horn, nous avons utilisé R (R-Core-Team, 2012) et le package végétalien (Oksanen et al., 2013 ; tableau supplémentaire S4). Deux échantillons avaient un nombre de lectures sensiblement inférieur (6-DUR-MC335, 8217 lectures et 17-POST-GC600, 84 lectures) que tous les autres échantillons (>21 500 lectures) et n'ont donc pas été raréfiés. La raréfaction pour tous les autres échantillons a été calculée 100 fois, générant 100 tableaux OTU dont la moyenne a été calculée pour présenter l'observation raréfiée moyenne de chaque OTU dans chaque échantillon. Les analyses de Mann-Whitney-Wilcoxon ont vérifié que les données raréfiées n'étaient pas statistiquement différentes des données non raffinées (P = 0,8252). Les indices de diversité alpha ont été calculés pour la table OTU non raréfiée, une table OTU raréfiée aléatoire et la table OTU raréfiée moyenne (100 calculs). Les estimations de diversité (tableau supplémentaire S4) n'ont que légèrement changé entre les tables OTU non raréfiées et raréfiées. Pour conserver les informations pour l'oligotypage, nous avons procédé avec la table OTU non raréfiée. Nous avons converti les observations de séquence en données d'abondance relative, à l'échelle de 0 à 100 % de la communauté, et les indices de diversité bêta de Morisita-Horn ont été calculés pour toutes les OTU et tous les oligotypes (voir ci-dessous), ainsi que pour Colwellia, Oceaniserpentilla, Cycloclasticus et SAR11 oligotypes, séparément.

Pour les analyses phylogénétiques, nous avons utilisé le progiciel ARB (Ludwig et al., 2004) avec la base de données SSURef111 de ARB SILVA (Pruesse et al., 2007). Des arbres phylogénétiques de séquences de gènes d'ARNr 16S presque pleine longueur ont été calculés par analyse de vraisemblance maximale et des séquences d'oligotypes ont ensuite été insérées dans l'arbre selon des critères de parcimonie, sans permettre de changements dans la topologie globale de l'arbre.

Nous avons utilisé l'oligotypage (Eren et al., 2013) pour évaluer les séquences V6V4 attribuées aux genres Colwellia (26 217 séquences), Oceaniserpentilla (168 045 séquences) et Cycloclasticus (41 714 séquences) et sur le SAR11 (64 701 séquences) au niveau du nucléotide niveau. Ces groupes microbiens étaient omniprésents et largement distribués au cours de la série chronologique, et les Colwellia, Oceaniserpentilla et Cycloclasticus sont des membres clés de l'assemblage microbien dégradant le pétrole, ce qui en fait des candidats idéaux pour l'examen de la micro-diversité par oligotypage.

Toutes les séquences observées dans les échantillons qui se sont résolues pour chaque genre d'intérêt ont été extraites, alignées sur une matrice constituée des séquences d'ARNr 16S pleine longueur de ce genre cible et coupées à une position de début et de fin cohérente. L'entropie à chaque position de nucléotide a été calculée et entre 13 et 19 positions riches en informations ont contribué à l'oligotypage. Le séquençage s'est déroulé de la région V6 vers la région V4, avec une erreur croissante sur la longueur de la lecture (> 450 bp), nous avons donc limité les emplacements d'intérêt à haute entropie aux zones de bruit les plus faibles dans les régions V6, V5 et la fin des régions V4 . Nous avons retenu les oligotypes qui ont été observés dans au moins 10 % des échantillons dans lesquels le genre est apparu, étaient 0,1 % ou plus abondants dans au moins un échantillon, et dans lesquels la séquence unique la plus abondante était de 0,05 % de toutes les lectures dans ce genre. Un exemple détaillé de la procédure d'oligotypage est décrit dans les matériaux supplémentaires.

Comme pour l'ensemble de données OTU complet, nous avons comparé les effets de la raréfaction du tableau d'abondance des oligotypes résultant. La raréfaction du tableau au nombre de lectures le plus bas d'un échantillon (32, pour 17-POST-GC600) a généré un profil statistiquement différent (MWW, P <0, 01). La raréfaction à la profondeur la plus basse suivante (2856, 1-PRE-MC118) n'était pas statistiquement différente du profil complet de la communauté oligotype (MWW, P = 0, 5101) et a rejeté 80% des séquences oligotypes. Les tests de corrélation entre les paramètres environnementaux et les données raréfiées ont donné plus de deux fois plus de relations que les analyses avec des abondances d'oligotypes non raréfiés (données non présentées). Pour réduire le risque de faux positifs, nous n'avons pas utilisé les données raréfiées dans l'analyse d'oligotypage.

Nous avons évalué les relations entre les paramètres environnementaux mesurés et les abondances d'oligotypes à l'aide de R (R-Core-Team, 2012), de packages vegan (Oksanen et al., 2013) et de q-value (Klaus et Strimmer, 2012). Le coefficient de corrélation de rang non paramétrique de Spearman ρ a été calculé pour chaque distribution d'oligotype et paramètre environnemental. La correction du taux de fausses découvertes de Storey pour plusieurs tests à q<0,05 a été utilisée pour conserver des corrélations significatives (P<0,05).

Dans le golfe, le suintement naturel lent et diffus de gaz et de pétrole brut du fond marin (Behrens, 1988 ; Kennicutt II et al., 1988 ; Aharon, 1994) entretient des communautés microbiennes actives dégradant les hydrocarbures, telles que les sulfato-réducteurs et les méthane-réducteurs. bactéries oxydantes (Orcutt et al., 2010; Kleindienst et al., 2012). Contrairement à la lenteur des apports de gaz naturel et de pétrole, le rejet de pétrole DWH a rejeté 2,6–3,6 × 105 t de gaz et 5,9–8,4 × 105 t de pétrole (Joye et al., 2011 ; McNutt et al., 2012), exposant la populations microbiennes du Golfe à des charges d'hydrocarbures sans précédent localement. L'impact temporel du panache d'eau profonde sur les communautés bactériennes indigènes a été étudié entre mars 2010 et novembre 2012, dans des conditions ci-après appelées « pré-décharge » (PRE), « décharge » (DUR) et « post-décharge » (POST). Les données biogéochimiques et hydrographiques (tableau supplémentaire S1) ont défini le cœur du panache. Les «échantillons de panache» présentaient des concentrations de méthane> 10 μM et / ou des profondeurs d'eau comprises entre 1 000 et 1 300 m (pendant le rejet), tandis que les «échantillons sans panache» présentaient des concentrations de méthane plus faibles mais présentaient toujours des preuves de l'impact du rejet d'huile DWH (méthane concentrations >10 nM mais <10 μM et profondeurs d'eau supérieures à 1000 m ou inférieures à 1300 m). Pour comparer les populations de panaches avec les communautés bactériennes indigènes dégradant le pétrole, nous avons obtenu des échantillons d'eau profonde de deux suintements d'hydrocarbures naturels, MC118 et GC600 (Orcutt et al., 2005 ; Bowles et al., 2011).

Nos emplacements d'échantillonnage sont regroupés au sud-ouest de la tête de puits. La propagation du panache en eau profonde vers le sud-ouest est cohérente avec le courant anti-horaire qui contribue à la circulation moyenne du nord du golfe le long du talus continental. Cependant, des tourbillons cycloniques et anticycloniques jusqu'à 40 km de diamètre sont continuellement générés dans la région par des instabilités du courant moyen interagissant avec la bathymétrie complexe (Cardona et Bracco, 2015), et ils peuvent avoir déplacé le panache dans d'autres directions, à moins sporadiquement aussi. Des intégrations numériques avec un modèle océanique régional ont suggéré que le modèle et la direction du panache ont changé avec le temps, se déplaçant vers le sud-ouest après s'être propagés vers le nord-est pendant environ une semaine, de sorte que des particules d'eau dans le panache sont entrées en contact plusieurs fois avec la source d'hydrocarbures (Valentine et al., 2012). En raison de la nature chaotique de la circulation autour de la tête de puits, il n'est pas possible de calculer le temps qu'il a fallu pour que la communauté microbienne soit altérée, ni d'évaluer combien de fois l'eau à proximité immédiate de la tête de puits (c'est-à-dire dans un rayon de 5 km) était en contact avec le jet d'hydrocarbure en décharge. Cependant, il est clair que l'eau que nous avons échantillonnée en mai/juin 2010 a été directement impactée par le jet d'hydrocarbure et les effets secondaires de cette exposition étaient apparents dans les échantillons prélevés bien après le moment où le puits a été bouché (juillet 2010).

La communauté microbienne a été analysée sur la base d'un pyroséquençage à 454 étiquettes des régions V3V5 et V6V4 du gène de l'ARNr 16S (tableau supplémentaire S2). Une comparaison des identifications taxonomiques utilisant ces deux régions a indiqué que la sélection de la région variable influençait le nombre d'OTU calculées, bien que les mêmes tendances générales pour les populations mineures et dominantes aient été observées pour V3V5 et V6V4, indépendamment du choix de la région séquencée (Supplémentaire Tableau S3). Comme le séquençage basé sur V6V4 a fourni un ensemble de données plus complet, il a ensuite été sélectionné pour une analyse approfondie.

Les indices Morisita-Horn basés sur les abondances relatives de toutes les OTU ont été utilisés pour mesurer les dissemblances de la communauté microbienne entre les échantillons. L'échantillon d'eau que nous avons récupéré du point le plus proche de la tête de puits pendant le rejet - à moins de 0,5 km - reflétait une communauté microbienne présentant des signes importants d'altération (11-DUR-MC252, 10-DUR-MC252, 12-DUR-MC25 et 9 -DUR-MC252 ; Figure 1) par rapport à la communauté de fond (1-PRE-MC118 et 2-PRE-MC118 ; indice de Morisita-Horn 0,2-1 ; Figure 1a). Trois des échantillons près du site DWH (11-DUR-MC252, 10-DUR-MC252 et 12-DUR-MC252) étaient également distincts de l'aval, c'est-à-dire des échantillons prélevés de 7 à 27 km de la tête de puits, communauté microbienne ( Indice de Morisita-Horn 0,1-0,9 ; Figure 1a). Une comparaison d'échantillons aux mêmes endroits mais à des profondeurs différentes a montré que le panache était confiné verticalement à une couche centrée juste en dessous de 1000 m près du site de rejet de DWH, et qu'il s'est dispersé sur une plus grande profondeur à mesure qu'il se déplaçait dans des eaux plus profondes au sud-ouest. En conséquence, la communauté microbienne au cœur du panache près de la tête de puits (9-DUR-MC252) est similaire aux populations dans d'autres échantillons de panache, malgré un minimum de 3 jours de séparation dans les eaux du bloc 335 (6-DUR- MC335) du puits de décharge en utilisant les estimations de vitesse horizontale de (Camilli et al., 2010), et que nos échantillons en aval et à proximité du puits ont été prélevés à 2 jours d'intervalle et en sens inverse - par rapport au sens d'écoulement - chronologie.

Cartes thermiques illustrant la dissemblance des communautés microbiennes des eaux profondes à partir d'échantillons obtenus avant, pendant et après le rejet de DWH sur la base des OTU (a) et des oligotypes (Oceaniserpentilla, Cycloclasticus, Colwellia et SAR11 ; b). Les sites impactés par le DWH ont été comparés aux suintements d'hydrocarbures naturels dans le golfe du Mexique, MC118 (1-PRE-MC118 et 2-PRE-MC118) et GC600 (17-POST-GC600 et 18-POST-GC600). Les mesures de dissemblance de 0 à 1 (code couleur bleu-blanc-rouge) ont été calculées à l'aide de l'indice Morisita-Horn.

Conformément aux études précédentes (Hazen et al., 2010 ; Redmond et Valentine, 2012 ; Valentine et al., 2012), en comparant toutes les UTO parmi les échantillons, nous avons observé des changements dans la composition de la communauté microbienne dans les échantillons de panache par rapport aux échantillons sans panache, et significativement diminution de la diversité au sein du panache. Par exemple, les séquences d'échantillons avant décharge se sont regroupées en 811 et 980 UTO bactériennes (1-PRE-MC118 et 2-PRE-MC118, respectivement), tandis que les zones touchées par le panache (7-DUR-MC295, 9-DUR-MC252, 8-DUR-MC295 et 6-DUR-MC335) avaient un nombre inférieur d'OTU bactériennes (199–548; tableau supplémentaire S3). Au détriment de la richesse globale de la communauté, le panache DWH a enrichi des populations microbiennes spécifiques et réduit la diversité microbienne. Bien que des organismes et/ou des populations spécifiques aient pu prospérer dans des conditions de panache, telles que des concentrations élevées d'alcanes à chaîne courte (Joye et al., 2011 ; tableau supplémentaire S1), des alcanes plus longs, des HAP (Reddy et al., 2012) et du dioctylsodium sulfosuccinate (Kujawinski et al., 2011), d'autres composants de la population microbienne ont présenté une abondance réduite, sont tombés en dessous de la détection ou sont potentiellement devenus inactifs et/ou sont morts à la fois à la tête de puits et en aval de celle-ci. En revanche, les nombres les plus élevés d'OTU bactériennes ont été observés dans les échantillons après décharge d'un panache de méthane naturel prolifique au suintement, GC600 (18-POST-GC600 ; 1 640 OTU). Les échantillons de 2012 récupérés dans la zone de la tête de puits étaient probablement influencés par des micro-organismes pélagiques et benthiques, car les sédiments ont été légèrement perturbés lors de l'échantillonnage des eaux de fond (19-POST-MC252 et 20-POST-MC253, 2997 et 6835 OTU, respectivement).

Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Deferribacteres, SAR11, SAR324 et SAR86 dominaient les échantillons avant décharge (1-PRE-MC118 et 2-PRE-MC118; Figure 2). Ces groupes sont généralement observés dans les eaux océaniques pélagiques (Swan et al., 2011). Au cours de la décharge d'huile DWH, en mai et juin 2010, le nombre de cellules dans les échantillons de panache a augmenté d'un ordre de grandeur par rapport à l'eau de fond profonde (jusqu'à 2 × 106 cellules ml-1 de 1 à 2 × 105 cellules ml-1 ; Tableau S1), qui suggère des taux de croissance accrus alimentés par l'infusion de gaz et de pétrole. À cette époque, les gammaprotéobactéries constituaient 43 à 98 % de toutes les séquences dans les échantillons de panache (Figure 2, tableau supplémentaire S3), contre 23 à 29 % plus modestes de toutes les séquences dans les échantillons de pré-décharge. Les gammaprotéobactéries affiliées aux dégradeurs d'hydrocarbures d'Oceaniserpentilla (précédemment appelée DWH Oceanospirillum, par exemple, Hazen et al., 2010 ; Redmond et Valentine, 2012), Colwellia ou Cycloclasticus, composées jusqu'à 94 % (Oceaniserpentilla ; 8-DUR-MC295), 35 % (Colwellia ; 6-DUR-MC335) et 47 % (Cycloclasticus ; 5-DUR-MC250 et 6-DUR-MC335) de toutes les séquences bactériennes dans les échantillons de décharge.

Abondances relatives des populations bactériennes tout au long de la série temporelle (avant le rejet, pendant le rejet de pétrole et après le rejet), le long d'un transect vertical à différentes profondeurs d'eau (603-1564 m) et à deux suintements d'hydrocarbures naturels, MC118 (1-PRE-MC118 et 2-PRE-MC118) et GC600 (17-POST-GC600 et 18-POST-GC600). Les communautés bactériennes ont été analysées à l'aide d'un pyroséquençage 454 de la région V6V4 du gène bactérien de l'ARNr 16S. Les dates d'échantillonnage, la profondeur d'eau spécifique et les emplacements sont indiqués dans le tableau 1.

En septembre 2010, les signatures biogéochimiques du panache en eau profonde étaient largement atténuées (par exemple, les concentrations de méthane étaient d'environ 1 nM près de la tête de puits ; Tableau supplémentaire S1 ; Crespo-Medina et al., 2014). À ce moment, les bactéries méthylotrophes du genre Methylophaga, qui étaient en dessous de la détection dans l'échantillon de pré-décharge, ont été enrichies, représentant 7 % de toutes les séquences (14-POST-MC422 ; Figure 2). Fait intéressant, Methylophaga a également été détecté dans un échantillon de GC600 (1 à 2 % de toutes les séquences, 17-POST-GC600 ; figure 2) et dans deux échantillons récupérés dans la zone touchée par DWH en novembre 2012, y compris un échantillon prélevé directement au-dessus de la tête de puits (20-POST-MC253 et 19-POST-MC252). Les méthylophaga sont des méthylotrophes connus - des sous-produits potentiellement dégradants de la biodégradation complexe de l'huile - mais peuvent également oxyder l'hexadécane, donnant à ces micro-organismes un rôle potentiellement important dans le cycle des hydrocarbures au niveau des suintements naturels. De plus, les Bacteroidetes étaient fortement enrichis en échantillons post-décharge (23 % de toutes les séquences, 14-POST-MC422 ; Figure 2, Tableau supplémentaire S3) par rapport aux échantillons pré-décharge et décharge (4 % et 14 % de toutes les séquences, respectivement). Comme Methylophaga, les Bacteroidetes peuvent potentiellement consommer des métabolites secondaires de la biodégradation du méthane ou des composés dérivés du pétrole.

Les membres du genre Alteromonas ont fleuri dans l'environnement post-décharge (29 % de toutes les séquences, 14-POST-MC422 ; Figure 2). Ces taxons, qui sont également présents dans des échantillons de suintement naturels, mais avec une abondance réduite (1-PRE-MC118 ; 2 %, 17-POST-GC600 ; 9 % et 18-POST-GC600 ; 11 %), peuvent fonctionner comme des dégradeurs indigènes de HAP ( Jin et al., 2012 ; Math et al., 2012). L'échantillon de GC600, un suintement prolifique d'hydrocarbures naturels, abritait également d'abondantes populations de Pseudoalteromonas (40 % de toutes les séquences, 18-POST-GC600) ; ces microbes peuvent également dégrader les HAP (Hedlund et Staley, 2006). Nous avons détecté des Pseudoalteromonas uniquement dans les échantillons de suintement naturel et post-décharge (2 à 7 % de toutes les séquences), et non dans les échantillons collectés pendant la décharge. Il est possible que ce groupe microbien n'ait pas pu faire face aux conditions environnementales lors du rejet ; alternativement, ces organismes auraient pu réagir si rapidement pour avoir fleuri et s'être écrasés entre nos efforts d'échantillonnage et, par conséquent, avoir été manqués.

L'oligotypage fait progresser de manière significative le domaine de l'écologie microbienne (Eren et al., 2013) en fournissant un aperçu de la variation de séquence subtile entre les micro-organismes virulents et non pathogènes (Eren et al., 2011), les bactéries indicatrices fécales spécifiques à l'hôte (McLellan et al. ., 2013), oligotypes marins SAR11 (Eren et al., 2013) et spécificité d'hôte dans les communautés microbiennes hébergées par des éponges (Reveillaud et al., 2014). Fait important, la méthode est à l'abri des complications provenant de l'apparition de multiples copies du gène ARNr 16S. Par exemple, si deux oligotypes différents provenaient du même génome, ils devraient toujours coexister dans des ensembles de données incluant ce génome. Cela n'a jamais été détecté dans l'ensemble de données actuel. Au lieu de cela, les oligotypes avaient des modèles d'apparence différentiels, qui ne peuvent pas être expliqués par la présence de multiples copies de gènes. Ainsi, l'oligotypage améliore l'interprétation de la diversité des séquences génétiques de l'ARNr 16S, permettant la quantification des changements écologiquement pertinents dans les populations microbiennes au niveau d'écotypes spécifiques (Ward, 1998 ; Eren et al., 2013). Nous avons résolu 21 oligotypes Oceaniserpentilla (représentant 97,4 % de toutes les lectures dans ce genre), 31 oligotypes Cycloclasticus (92,4 %) et 26 oligotypes Colwellia (94 %). Chaque oligotype avait un minimum de 96 % de similarité avec les séquences de la base de données NCBI nr. Les oligotypes d'Oceaniserpentilla étaient entre 97 et 99 % similaires aux représentants séquencés d'Oceaniserpentilla haliotis (NR_042641.1) ; Les oligotypes de Cycloclasticus avaient une correspondance de 96 à 100 % avec Cycloclasticus zancles (NC_021917.1) et Cycloclasticus sp. P1 (NC_018697.1); et, les oligotypes de Colwellia étaient similaires à 96 à 100 % à Colwellia psychrerythraea (NC_003910.7).

Nous avons également effectué un oligotypage sur 64 701 séquences classées SAR11 pour évaluer si la procédure sur un autre membre omniprésent de la communauté microbienne générerait des schémas de distribution sans signal écologique clair et significatif. De la même manière, nous avons sélectionné 14 positions de nucléotides à haute entropie qui ont généré 98 oligotypes. Tous les oligotypes SAR11 générés étaient similaires à au moins 98 % aux représentants de la base de données NCBI nr. Contrairement à la procédure avec les autres taxons oligotypés, l'augmentation du nombre de positions de nucléotides par itération d'oligotypage n'a pas permis de distinguer les modèles d'abondance différentiels des oligotypes SAR11 dans les échantillons.

Lors de l'exploration de cet ensemble complet de données spatialement et temporellement diversifiées via l'oligotypage, les indices de Morisita-Horn ont révélé des modèles très similaires par rapport aux résultats que nous avons obtenus pour toutes les OTU (figures 1a et b), ce qui implique que l'altération de la communauté microbienne s'explique principalement par des variations. dans les oligotypes Oceaniserpentilla, Cycloclasticus et Colwellia. Les compositions d'oligotypes dans les échantillons de décharge étaient différentes des échantillons avant et après la décharge (indices Morisita – Horn de 0, 5 à 1, respectivement; figure 1b), montrant que des écotypes uniques se produisaient à des moments précis avant, pendant et après la décharge.

L'examen des abondances relatives au niveau de la sous-OTU a révélé des taxons distincts auparavant non reconnus au sein d'Oceaniserpentilla, Cycloclasticus et Colwellia qui reflétaient une variation écologique significative. Les oligotypes enrichis dans les échantillons prélevés lors du rejet, lorsque la disponibilité en hydrocarbures était très importante dans le panache en eau profonde, représentaient des populations uniques par rapport à ceux dominant les suintements naturels ou hors panache, où la disponibilité en hydrocarbures était beaucoup plus faible. En écologie, le concept de stratèges r et K fait référence au taux de croissance d'une population et à la capacité de charge d'un environnement spécifique (Andrews et Harris, 1986). Nous proposons que les taxons enrichis lors du déversement de pétrole dans le panache d'eau profonde enrichi en hydrocarbures étaient des stratèges r à croissance rapide capables de réagir rapidement aux conditions changeantes, par rapport aux stratèges K à croissance lente qui habitent des environnements aux conditions plus stables. Bien que les suintements naturels puissent être caractérisés par un suintement d'hydrocarbures lent-diffus ou rapide pulsé (stratèges K vs r), la décharge DWH offrait apparemment une niche environnementale avantageuse pour les stratèges r.

Des changements profonds dans les distributions d'Oceaniserpentilla, des oxydants potentiels de cycloalcanes (Mason et al., 2012), ont été détectés en réponse à la décharge d'huile DWH par rapport aux conditions de pré-décharge. En explorant la distribution des oligotypes d'Oceaniserpentilla, les échantillons avant décharge (1-PRE-MC118 et 2-PRE-MC118; indice Morisita – Horn 1,0; Figure supplémentaire S2a) étaient différents de tous les autres échantillons. Les oligotypes abondants avant la décharge (type_18, type_19 ; Figure 3) n'ont pas été détectés pendant ou après la décharge DWH. Sur la base de l'analyse phylogénétique de séquences de gènes d'ARNr 16S presque complètes ainsi que de séquences d'oligotypes, les oligotypes de pré-décharge (type_18, type_19) sont étroitement affiliés à des taxons non associés à la décharge d'huile DWH, reflétant probablement la communauté de fond naturelle. En revanche, lors de la décharge, différents oligotypes d'Oceaniserpentilla (type_01, type_02, type_10 ; Figure 3) ont été observés qui sont apparentés aux spp. détecté dans des échantillons de panache d'huile DWH lors d'études antérieures (par exemple, selon les numéros JN015209, HM587888-90; Figure supplémentaire S3; Hazen et al., 2010). Après la décharge, d'abondants oligotypes d'Oceaniserpentilla (type_10, ⩽6 %, type_16, ⩽5 %, type_21, ⩽92 % de tous les oligotypes, respectivement ; Figure 3), étaient étroitement liés aux spp. détecté lors de la décharge d'huile DWH (par exemple, selon nos. HM587889, JN015210; Figure supplémentaire S3; Hazen et al., 2010) ainsi qu'à spp. identifié lors d'expériences de sondage d'isotopes stables d'éthane 13C et de propane 13C avec l'eau de mer du Golfe (par exemple, n° d'accès JN018486, JN018459 ; Redmond et Valentine, 2012) et à spp. non associé au rejet DWH. On ne sait toujours pas si les changements dans les oligotypes d'Oceaniserpentilla abondants pendant et après le déversement (type_10, type_21) ainsi qu'un oligotype qui s'est enrichi après le rejet d'huile DWH (type_16, 25 % de tous les oligotypes, 18-POST-GC600) reflètent une longue à long terme du déversement.

Abondances relatives des oligotypes Oceaniserpentilla (a), des oligotypes Cycloclasticus (b) et des oligotypes Colwellia (c) qui ont joué un rôle clé lors de la marée noire de DWH. L'oligotypage a permis l'interprétation de la diversité des séquences génétiques de l'ARNr 16S au niveau d'écotypes spécifiques. La dynamique des oligotypes a été surveillée dans des échantillons de pré-décharge, de décharge et de post-décharge.

Pour les dégradeurs potentiels de HAP affiliés à Cycloclasticus (Dyksterhouse et al., 1995), la distribution de l'écotype était similaire avant et pendant le rejet (indice Morisita – Horn <0, 1–0, 5; Figure supplémentaire S2b). Après la décharge, trois échantillons ont révélé des écotypes Cycloclasticus similaires (14-POST-MC422, 15-POST-MC298 et 16-POST-MC297 ; indice Morisita-Horn <0,1-0,3), tandis que trois autres échantillons étaient uniques (18-POST -GC600, 19-POST-MC252 et 20-POST-MC253 ; indice de Morisita-Horn 0,9-1). L'oligotype dominant détecté avant l'incident DWH (type_01, 74 à 94 % de tous les oligotypes, 1-PRE-MC118 et 2-PRE-MC118 ; Figure 3) était présent en grande abondance pendant (29 à 81 % de tous les oligotypes) et après la décharge (jusqu'à 34 % de tous les oligotypes, 19-POST-MC252). Cet oligotype_01 est phylogénétiquement affilié aux spp. détecté dans les échantillons de panache en eau profonde lors d'études précédentes (numéros d'accès JN018748, JN018827, JN018869, JN018988 et HQ222992 ; Figure supplémentaire S4 ; Redmond et Valentine, 2012 ; Valentine et al., 2012). De plus, les oligotypes Cycloclasticus (type_02, type_07) abondants dans les échantillons post-décharge (jusqu'à 100 % et 44 %, 15-POST-MC298 et 16-POST-MC297 ; Figure 3) regroupés avec spp. détecté dans des échantillons d'études DWH précédentes (HQ433397, JN019017, HQ222993; Valentine et al., 2010; Kessler et al., 2011b; Redmond et Valentine, 2012). Les distributions de ces oligotypes montrent que les Cycloclasticus habitant les suintements naturels d'hydrocarbures dans le Golfe ont apparemment pu résister aux perturbations environnementales résultant du rejet de DWH et ont probablement participé à la biodégradation du pétrole lors de l'incident.

Pour les Colwellia, qui contiennent des dégradeurs d'alcanes à chaîne courte putatifs (Redmond et Valentine, 2012), la distribution des oligotypes a révélé des schémas similaires avant la décharge (indice Morisita – Horn <0, 1; Figure supplémentaire S2c) et pendant la décharge (indice Morisita – Horn 0, 1 –0,8), respectivement. Nous avons détecté un oligotype (type_04) tout au long de la série chronologique. L'analyse phylogénétique a montré que cet oligotype était étroitement lié aux organismes détectés à la fois dans les échantillons de suintement naturels et dans les échantillons impactés par DWH (Figure 4 ; n° d'accès JN018846 ; Redmond et Valentine, 2012), montrant que certaines Colwellia spp. présents au niveau des suintements d'hydrocarbures naturels ont pu faire face aux fortes concentrations de gaz, d'huile et de dispersant présentes en eau profonde lors du rejet de DWH. Cependant, l'abondance relative de cet oligotype a diminué de manière significative pendant la décharge par rapport aux échantillons de pré-décharge (de 72 à 86 % à 0 à 13 % de tous les oligotypes ; Figure 3), ce qui implique que les micro-organismes indigènes non suintants dominaient la population de Colwellia pendant le déversement. Dans cette optique, les oligotypes de Colwellia les plus abondants lors de la décharge DWH (type_01, ⩽43%, type_02, ⩽56%, type_03, ⩽25%, type_05, ⩽22%, type_06, ⩽24%, type_07, ⩽13% et type_08, ⩽ 8 % de tous les oligotypes, respectivement ; Figure 3) étaient étroitement liés aux microbes détectés dans des échantillons de panache en eau profonde dans des études précédentes (par exemple, nos. JN018749, JN018846 et JN019018 ; Redmond et Valentine, 2012) ou à organismes identifiés dans des expériences de sondage d'isotopes stables avec du 13C-méthane, du 13C-éthane et du 13C-propane (numéros d'accès JN018467, JN018427, JN018472 et JN019018 ; Redmond et Valentine, 2012 ; figure 4). Les oligotypes de Colwellia dominant les échantillons lors de la décharge (> 5% d'abondance relative lors de la marée noire DWH; Figure 4) sont apparus d'une diversité frappante dans l'arbre génétique de l'ARNr 16S et les séquences dispersées dans les Colwelliaceae opposées à la formation de grappes phylogénétiquement distinctes. La diversité phylogénétique détectée de Colwellia lors de la marée noire de DWH reflète probablement la diversité physiologique de ce groupe et leur capacité à réagir à une gamme de conditions environnementales. Fait intéressant, Colwellia sp. RC25 isolé avec de l'huile MC252 provenant d'eaux contaminées par DWH (Bælum et al., 2012) n'est étroitement lié à aucun des taxons détectés lors du rejet d'huile DWH dans des rapports précédents ou à l'un des oligotypes de Colwellia signalés ici (Figure 4). Bien que le cultivar Colwellia sp. RC25 (Bælum et al., 2012) sert d'organisme modèle précieux, sa physiologie (par exemple, les préférences de substrat, les conditions de croissance optimales et l'activité) peut ne pas refléter celle des écotypes de Colwellia qui ont dominé pendant la décharge DWH.

Relations phylogénétiques des oligotypes de Colwellia (gras) avec des espèces étroitement apparentées. y compris des représentants cultivés. L'arbre a été calculé par analyse du maximum de vraisemblance. Les oligotypes qui étaient potentiellement plus actifs lors de la décharge d'huile DWH sont indiqués en police de couleur rouge. Le codage couleur des sphères correspond à l'étiquetage oligotype de la figure 3. De plus, les oligotypes qui sont significativement corrélés au méthane et/ou à l'oxydation du méthane sont marqués avec [CH4] et/ou [MOx]. Le nombre de lectures regroupées dans le même oligotype est indiqué dans le nom complet. La barre représente une divergence de séquence estimée à 10 %.

Nous avons en outre évalué les relations entre les paramètres environnementaux et les distributions des oligotypes Colwellia, Cycloclasticus, Oceaniserpentilla à travers des échantillons en utilisant R (R-Core-Team, 2012), packages vegan (Oksanen et al., 2013) et qvalue (Klaus et Strimmer, 2012) . Le coefficient de corrélation de rang de Spearman ρ pour chaque distribution d'oligotype et paramètre environnemental, et la correction du taux de fausses découvertes de Storey pour plusieurs tests à q<0,05 ont montré des corrélations significatives (P<0,05). Comme l'oligotypage résout les variations subtiles des gènes d'ARNr 16S qui représentent des écotypes distincts (Ward, 1998; Eren et al., 2013), nous soutenons que les oligotypes qui sont en corrélation significative avec les paramètres environnementaux représentent probablement des écotypes distincts. Les abondances relatives de six oligotypes de Colwellia (types_01, 02, 03, 04, 06, 09), de trois oligotypes de Cycloclasticus (types_04, 06, 30) et d'un oligotype d'Oceaniserpentilla (type_17) ont fortement suivi les concentrations élevées de méthane dans le panache d'hydrocarbures en eau profonde ; ces mêmes échantillons présentaient également des concentrations élevées de matière organique dissoute colorée, un bon indicateur de l'huile dissoute (Wade et al., 2013 ; tableau supplémentaire S5). Les efflorescences successives de divers oligotypes de Colwellia reflètent probablement des transitions entre des niches écologiques distinctes, telles que différentes préférences de substrat d'alcanes à chaîne courte spécifiques, de dispersants ou d'autres composés organiques. De plus, des mesures de taux d'oxydation du méthane plus élevés étaient corrélées à des abondances plus élevées de trois oligotypes de Colwellia (types_01, 04 et 06) et de trois oligotypes de Cycloclasticus (types_01, 06 et 30). À ce jour, ni Colwellia ni Cycloclasticus ne sont connus pour être des oxydants du méthane, c'est-à-dire que leurs génomes ne révèlent aucune capacité métabolique à oxyder le méthane (Lai et al., 2012 ; Mason et al., 2014). Cependant, la corrélation positive de ces oligotypes avec les taux d'oxydation du méthane implique soit leur implication indirecte dans ce processus (par exemple, par l'oxydation de co-métabolites ou de sous-produits de réaction), soit leur coexistence avec des oxydants du méthane (par exemple, dans des échantillons de panache, où coexistaient méthane, alcanes et HAP) ou éventuellement un potentiel non reconnu d'oxydation du méthane.

Pour vérifier sur le terrain les modèles observés dans la succession communautaire de bactéries putatives oxydant l'huile, nous avons oligotypé un membre omniprésent de la communauté, SAR11, pour confirmer que la procédure n'a pas généré de modèles dépourvus de signification écologique claire (Figures supplémentaires S2d et S5, Tableau supplémentaire S3). Nous avons également évalué les relations de la population SAR11 avec les paramètres environnementaux. Les abondances relatives de 27 oligotypes SAR11 étaient corrélées négativement avec le nombre de cellules, les concentrations de méthane (types_42, 66 et 90) et les taux d'oxydation du méthane (types_37, 42, 43, 66 et 90 ; tableau supplémentaire S5). Ainsi, l'oligotypage n'a suggéré aucun rôle pour SAR11 dans la dynamique des hydrocarbures, comme prévu d'après les stratégies écologiques et métaboliques connues de SAR11. Les génomes de Pelagibacter spp. sont optimisés pour des besoins énergétiques plus faibles et une privation de carbone dans des conditions océaniques oligotrophes (Steindler et al., 2011). En profondeur dans le nord du golfe du Mexique, la représentation de SAR11 diminue, tandis que les membres gammaprotéobactériens associés aux hydrocarbures tels que Colwellia, Cycloclasticus et Oceaniserpentilla prédominent (Giovannoni et al., 2005). Fait intéressant, deux oligotypes SAR11 (types_68 et 73) ont montré de fortes corrélations positives avec les concentrations de NOx (nitrite plus nitrate). Bien que le SAR11 soit globalement abondant dans les environnements d'eau de mer marine (Morris et al., 2002), des corrélations négatives (Eiler et al., 2009) et positives (Teira et al., 2009) du SAR11 marin à la concentration d'ammonium et de nitrate ont été signalées. . Ainsi, les membres de SAR11 peuvent être spécialisés pour des niches écologiques définies par la disponibilité des nutriments.

L'évaluation de l'abondance relative des oligotypes Oceaniserpentilla, Cycloclasticus et Colwellia au niveau sous-OTU dans un ensemble de données spatialement et temporellement diversifiées obtenues à partir de suintements naturels et de zones touchées par le déversement de pétrole DWH dans le Golfe a révélé un niveau de diversité jusque-là non reconnu de ces hydrocarbures. dégradeurs et une évolution claire de la répartition des taxons dans le temps lors de l'incident DWH. Certains écotypes habitant les suintements naturels étaient potentiellement capables de faire face aux conditions du panache en eau profonde. Cependant, la croissance d'Oceaniserpentilla, de Cycloclasticus et de Colwellia était dominée par des taxons habituellement non observés dans les suintements d'hydrocarbures naturels. Les futures caractérisations de ces écotypes potentiellement spécialisés, par le biais de cultures et d'expériences physiologiques, ainsi que des analyses supplémentaires des gènes fonctionnels et marqueurs, feront progresser la connaissance de leur pertinence écologique dans le milieu marin. De plus, de telles analyses fourniront plus d'informations sur les facteurs environnementaux qui ont conduit à leur domination accrue lors de la marée noire.

L'oligotypage a fourni un moyen de quantifier, avec une grande précision, la réponse des taxons microbiens représentant probablement des écotypes distincts lors de cette perturbation environnementale aiguë. De même, cette approche convient pour évaluer l'évolution des taxons en réponse à d'autres perturbations environnementales aiguës et chroniques, telles que l'eutrophisation, les ouragans, les tsunamis ou le changement climatique. Divers taxons peu abondants, probablement spécialisés, ont répondu à l'infusion d'hydrocarbures DWH en quelques semaines. La capacité de ces membres de la biosphère rare à stimuler l'activité et l'abondance suite à une perturbation massive illustre le potentiel métabolique diversifié et important de la population microbienne naturelle du Golfe.

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Cette recherche a été financée par les programmes d'océanographie biologique et chimique de la National Science Foundation des États-Unis (OCE-1043225 à SBJ), le National Institute for Undersea Science and Technology de la NOAA (numéros de prix 0710028 et 0810031 à SBJ), une subvention de BP/The Gulf of Initiative de recherche mexicaine pour soutenir le consortium « Ecosystem Impacts of Oil and Gas Inputs to the Gulf (ECOGIG) » et les programmes Deep Carbon Observatory et Census of Marine Life de la Sloan Foundation (à MS). Il s'agit de la contribution ECOGIG 203 et les données sont déposées sous le numéro d'acquisition GRIIDC (UDI : R1.x132.134:0079).

Sarah Kleindienst

Adresse actuelle : 4Adresse actuelle : Center for Applied Geosciences, Eberhard-Karls-University Tuebingen, 72074 Tuebingen, Germany.,

Sharon Grim

Adresse actuelle : 5Adresse actuelle : Department of Earth and Environmental Sciences, University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA.,

Melitza Crespo-Medina

Adresse actuelle : 6Adresse actuelle : Center for Environmental Education, Conservation and Research, Université interaméricaine de Porto Rico, San Juan, Porto Rico.,

Département des sciences marines, Université de Géorgie, Athènes, Géorgie, États-Unis

Sara Kleindienst, Melitza Crespo-Medina et Samantha B Joye

Josephine Bay Paul Center, Laboratoire de biologie marine, Woods Hole, MA, États-Unis

Sharon Grim et Mitchell Sogin

École des sciences de la Terre et de l'atmosphère, Georgia Institute of Technology, Atlanta, Géorgie, États-Unis

Annalisa Bracco

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Correspondance à Samantha B Joye.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

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Réimpressions et autorisations

Kleindienst, S., Grim, S., Sogin, M. et al. Divers taxons microbiens rares ont réagi au panache d'hydrocarbures en eaux profondes de Deepwater Horizon. ISME J 10, 400–415 (2016). https://doi.org/10.1038/ismej.2015.121

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Reçu : 31 octobre 2014

Révisé : 21 mai 2015

Accepté : 03 juin 2015

Publié: 31 juillet 2015

Date d'émission : Février 2016

DOI : https://doi.org/10.1038/ismej.2015.121

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