Quantification de la fixation biologique de l'azote par Mo

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 22011 (2022) Citer cet article

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La fixation biologique de l'azote (BNF) par le molybdène canonique et les isoformes complémentaires du vanadium et de la nitrogénase de fer uniquement est la principale source naturelle d'azote nouvellement fixé. La compréhension des contrôles sur le cycle global de l'azote nécessite la connaissance de l'isoforme responsable du BNF environnemental. L'essai de réduction isotopique de l'acétylène (ISARA), qui mesure le fractionnement des isotopes stables du carbone (13C/12C) entre l'éthylène et l'acétylène dans les essais de réduction de l'acétylène, est l'une des rares méthodes qui peuvent quantifier les flux de BNF spécifiques à l'isoforme. L'application de l'ISARA classique a été difficile car l'activité de BNF dans l'environnement est souvent trop faible pour générer suffisamment d'éthylène pour les analyses isotopiques. Nous décrivons ici une méthode de haute sensibilité pour mesurer l'éthylène δ13C par couplage en ligne de la préconcentration d'éthylène à la chromatographie en phase gazeuse-combustion-isotope ratio spectrométrie de masse (EPCon-GC-C-IRMS). Les besoins en éthylène dans les échantillons contenant 10 % v/v d'acétylène sont réduits de > 500 à ~ 20 ppmv (~ 2 ppmv avec élimination préalable de l'acétylène hors ligne). Pour augmenter la robustesse en réduisant l'erreur d'étalonnage, les mutants d'Azotobacter vinelandii à isoforme de nitrogénase unique et les analyses d'échantillons environnementaux reposent sur une source commune d'acétylène pour la production d'éthylène. L'application de la méthode ISARA (LISARA) à faible activité de BNF aux sols à faible activité fixatrice d'azote, à la litière de feuilles, au bois pourri, aux cryptogames et aux termites indique un BNF complémentaire dans la plupart des types d'échantillons, ce qui nécessite des études supplémentaires sur le BNF spécifique à l'isoforme.

L'azote (N) fixe fondamentalement les limites de la productivité biologique, limitant probablement les réponses des écosystèmes naturels aux changements environnementaux mondiaux1,2,3. La fixation biologique de l'azote (BNF), le processus procaryote qui convertit le diazote atmosphérique (N2) en ammoniac, est le principal apport biologique de nouveau N biodisponible aux bilans mondiaux et régionaux de N. Il joue ainsi une fonction biogéochimique clé dans divers écosystèmes, notamment les forêts tropicales, tempérées et de haute latitude, les herbages et les arbustes de montagne, ainsi que les environnements benthiques et océaniques ouverts4,5. La nitrogénase, la métalloenzyme responsable du BNF, existe sous trois isoformes primaires, caractérisées par le métal de transition présent sur le site actif : la nitrogénase canonique et les nitrogénases « alternatives », ou plus récemment appelées « complémentaires » de vanadium (V) uniquement et de fer (Fe) uniquement6,7. Les nitrogénases V et Fe uniquement sont indépendantes du Mo, contenant les métaux traces les plus abondants d'origine crustale V et Fe à la place de Mo8.

Déterminer la contribution des différentes isoformes de la nitrogénase au BNF environnemental est essentiel pour comprendre les contrôles mécanistes sur le BNF de l'écosystème, en particulier comment les cycles biogéochimiques couplés des macronutriments et des métaux traces biologiquement actifs répondent aux perturbations anthropiques. Étant donné que les calculs du taux de BNF basés sur les méthodes traditionnelles (c.-à-d., les essais de réduction de l'acétylène et les méthodes d'abondance naturelle 15N/14N) sont sensibles à l'isoforme de la nitrogénase9,10,11, une attribution incorrecte des isoformes de la nitrogénase actives dans le BNF peut modifier les estimations du budget de N jusqu'à 50 %12,13, influençant l'état et la gestion de l'azote de l'écosystème.

La spécificité des métaux des flux de BNF environnementaux peut désormais être évaluée grâce à l'application d'un suivi de flux spécifique à l'isoforme via les méthodes de dosage de réduction isotopique de l'acétylène (ISARA) et de rendement d'éthane combinées à des analyses de séquence de gènes de nitrogénase6,12,13,14. Ces approches ont identifié des contributions significatives des nitrogénases complémentaires V et Fe uniquement à la BNF non rhizobienne dans divers échantillons allant de la litière de feuilles de mangrove tempérée de l'Everglade, des sédiments de marais salés côtiers tempérés et des cyanolichens boréaux12,13,15,16. Plus récemment, une étude du cyanolichen BNF sur un gradient de nutriments de la forêt boréale de 600 km a fourni la première preuve à l'échelle de l'écosystème du rôle de la V-nitrogénase dans le maintien des apports de BNF dans des conditions limitées en Mo13, validant une hypothèse de longue date sur le rôle de «sauvegarde» des nitrogénases complémentaires suggéré à l'origine par des études en laboratoire17. De plus, de faibles rapports d'activité de réduction de l'acétylène à l'azote (c.-à-d. les rapports R), évocateurs de BNF complémentaires, ont été observés pour les sols tempérés9, la mousse boréale11,18 et le bois en décomposition19. De plus, des gènes de nitrogénase complémentaires et non caractérisés ont été détectés dans le paillis de bois20, les intestins postérieurs des termites21, le sol9, la mousse22 et les cyanolichens23,24. Ces études ainsi que l'accumulation d'exemples de BNF limités en Mo dans les biomes des forêts boréales18,25,26, tempérées et tropicales27,28,29,30,31,32,33 suggèrent que les BNF complémentaires et indépendants du Mo pourraient jouer un rôle mondial. Néanmoins, la quantification des taux de BNF indépendants du Mo dans les échantillons environnementaux, qui ont souvent une faible activité de BNF, a été difficile car la méthode la plus fiable pour l'attribution complémentaire de BNF, ISARA12, nécessite des rendements d'éthylène beaucoup plus élevés que ceux généralement observés (par exemple, le sol, la mousse, la litière de feuilles génèrent généralement <300 ppmv d'éthylène sur 1 à 2 jours d'incubations d'essai de réduction de l'acétylène). Une étude plus large de la BNF complémentaire et de ses contrôles au sein d'écosystèmes importants nécessite des améliorations méthodologiques de l'ISARA.

La méthode ISARA, basée sur le test de réduction de l'acétylène (ARA) largement utilisé pour l'activité BNF, repose sur le fractionnement isotopique stable du carbone 13C/12C de l'abondance naturelle de la réduction de l'acétylène en éthylène (13εAR = δ13Cacétylène - δ13Céthylène, où δ13C (‰) = ([(13C/12C)échantillon/(13C/12C)étalon) − 1] × 1 000 ) pour quantifier l'activité des différentes isozymes de la nitrogénase12. Les échantillons d'espace de tête des incubations ARA sont analysés par injection manuelle dans un spectromètre de masse à rapport isotopique-réacteur à combustion chromatographe en phase gazeuse (GC-C-IRMS, Fig. 1a). L'éthylène (C2H4) est séparé des autres constituants dans l'espace de tête [typiquement, le dioxyde de carbone (CO2), l'eau (H2O), le méthane (CH4) et l'acétylène (C2H2)] par chromatographie en phase gazeuse, le réacteur de combustion convertit ensuite l'éthylène en CO2, suivi d'une mesure IRMS du rapport 13C/12C du CO2 produit, qui équivaut au 13C/12C de l'éthylène. Un processus similaire donne le 13C/12C de l'acétylène. Plusieurs limitations et difficultés techniques sont associées aux méthodes telles qu'elles sont actuellement mises en œuvre. Premièrement, il existe un compromis entre la sensibilité analytique (c'est-à-dire l'ampleur du signal obtenu par unité de concentration d'éthylène) et une bonne séparation chromatographique de l'éthylène (c'est-à-dire, produisant des pics nets et bien définis qui ne se chevauchent pas avec d'autres constituants de l'espace de tête) requis pour des analyses précises et reproductibles. Ce phénomène résulte principalement des conditions d'injection de l'échantillon dans le système (par exemple, le volume d'injection, le débit, le taux de "split" de dilution dans l'injecteur GC). Les mesures précises du δ13Céthylène permettent des volumes d'injection maximum d'environ 1 ml et nécessitent donc des échantillons produisant des concentrations élevées d'éthylène dans les ARA (> 500 ppmv). Deuxièmement, les mesures d'acétylène (δ13Cacétylène) ont souvent de grandes incertitudes en raison des effets de traînée et de mémoire des pics, ce qui nécessite un conditionnement fréquent de la colonne GC (c'est-à-dire une brève augmentation de la température pour éliminer l'eau, l'acétylène et tout autre analyte accumulé sur la colonne) et les oxydations du réacteur de combustion dans lesquelles l'O2 pur est injecté dans le réacteur à haute température pour régénérer la capacité oxydative du réacteur. Enfin, les mesures des isotopes de l'éthylène et de l'acétylène sont calibrées sur l'échelle internationale de référence des isotopes du carbone VPDB à l'aide d'étalons d'isotopes du méthane, car il n'existe aucun étalon d'éthylène avec des valeurs de δ13C traçables au NIST. Les écarts de comportement chimique entre l'étalon de méthane et les analytes cibles, l'éthylène et l'acétylène, pendant la séparation chromatographique et la combustion peuvent entraîner des biais lors de la correction de la dérive le long et à travers plusieurs séries d'échantillons composées de mesures répétées. La méthode ISARA classique est donc relativement longue et limitée aux échantillons à forte activité BNF.

Méthodologie analytique pour la mesure du δ13C de l'éthylène dans une matrice de fond contenant 10 % v/v d'acétylène ou sans acétylène basée sur (a) les méthodes ISARA classiques impliquant l'injection directe12, (b) le système EPCon, qui ajoute des étapes de préconcentration d'éthylène et d'élimination de l'acétylène, et (c) une précipitation chimique facultative pour éliminer l'acétylène34 avant le chargement de l'échantillon sur EPCon. Le développement et le schéma d'EPCon sont adaptés de Weigand et al.35. Abréviations : Ac – acétylène.

Ici, nous décrivons une méthode ISARA très sensible ciblée sur des échantillons à faible activité de fixation d'azote (faible activité BNF ISARA, LISARA). Il comprend des améliorations instrumentales et méthodologiques de la méthode classique ISARA qui permettent une quantification précise des taux de BNF Mo-indépendants dans les échantillons de manière automatisée. La nouvelle conception analytique repose sur l'interfaçage d'un système GC-C-IRMS disponible dans le commerce utilisé dans les analyses ISARA traditionnelles avec un système de préconcentration d'éthylène gazeux en ligne entièrement automatisé (EPCon) fabriqué en interne et développé à partir de Weigand et al.35. L'EPCon élimine l'acétylène, un constituant de l'espace de tête avec la plus grande interférence maximale avec l'éthylène, et concentre l'éthylène dans les échantillons à des niveaux qui permettent des analyses isotopiques de haute précision au niveau de la partie par million avec peu d'interférence analytique des molécules non cibles. Dans cette méthode mise à jour, les exigences d'échantillonnage ISARA ont été réduites de ~ 500 ppmv d'éthylène à ~ 2 ppmv. Pour réduire les incertitudes basées sur l'étalonnage, nous proposons l'utilisation d'étalons d'éthylène internes disponibles dans le commerce et d'origine microbienne, éliminant ainsi le besoin de mesures d'acétylène et permettant de meilleures comparaisons au sein et entre les laboratoires. Pour démontrer l'applicabilité environnementale, nous utilisons LISARA pour étudier le BNF à faible activité dans les termites se nourrissant de bois ainsi que dans la litière de feuilles, le sol, la mousse, les lichens et les échantillons de bois pourri des forêts suburbaines du nord-est des États-Unis. Les résultats suggèrent une activité BNF complémentaire significative dans divers échantillons.

Suivant l'approche d'injection directe de l'ISARA12 classique avec quelques modifications, des échantillons d'ARA à haut rendement en éthylène (> 500 ppmv) dans de l'acétylène à 10 % v/v ont été injectés manuellement dans un Thermo Scientific Trace GC Ultra-Isolink avec une colonne Agilent HP-PLOT/Q capillaire GC (30 m, id = 0,32 mm, ft = 20 μm) et un réacteur de combustion connecté à un spectromètre de masse à rapport isotopique Thermo Scientific Delta V Plus (GC -C-IRMS ; figure 1a). Les modifications incluent le remplacement des viroles en argent dans le four GC par des viroles en polyamide Valcon (polymère renforcé de graphite) pour limiter les effets de mémoire de l'acétylène. Le réacteur de combustion a été oxydé avec de l'oxygène pur pendant 1 h avant chaque cycle et de brèves oxydations de graines (15 min) ont été effectuées entre les lots de mesure (c'est-à-dire nécessaires toutes les ~ 6 à 8 injections d'éthylène, ~ 4 à 6 injections d'acétylène) pour régénérer la capacité d'oxydation du réacteur et minimiser la dérive des valeurs de δ13C. Voir le tableau supplémentaire S1a en ligne pour des paramètres d'instrument supplémentaires.

Les échantillons d'ARA contenant < 500 ppmv d'éthylène ont été analysés à l'aide d'un système de préconcentration d'éthylène développé sur la base de Weigand et al.35 et fabriqué en interne (EPCon, Fig. 1b). L'EPCon est un système de préparation de gaz en ligne entièrement automatisé qui utilise une série de vannes chronométrées avec précision, des pièges cryogéniques et un chromatographe en phase gazeuse (GC) pour éliminer les composants de fond (en particulier l'eau et l'acétylène) et concentrer l'éthylène avant son introduction dans le GC-C-IRMS. L'EPCon a été développé grâce à la modification d'un système interne similaire conçu par Weigand et al.35 pour mesurer les isotopes d'azote et d'oxygène dans l'eau de mer et le nitrate d'eau douce35,36,37 et optimisé pour la mesure de l'éthylène δ13C à faible concentration. Les différences par rapport à son prédécesseur direct35 incluent une connexion directe entre la vanne 4 de l'EPCon ("V4" sur la Fig. 1) à la colonne GC dans le système GC-C-IRMS commercial, contournant la chambre d'injection pour éliminer les problèmes associés (par exemple, diminution de la sensibilité, élargissement du pic). Les débits, les pressions, les calages des vannes et des pièges ont été ajustés pour séparer efficacement l'éthylène et l'acétylène de sorte que l'acétylène puisse être éliminé du flux d'analyte et que l'éthylène puisse être focalisé cryogéniquement dans un petit volume avant son introduction dans le GC-C-IRMS. Voir les méthodes supplémentaires S1 et le tableau supplémentaire S1b-c en ligne pour des informations détaillées sur l'instrument et les paramètres.

Pour les échantillons ISARA contenant moins de ~ 20 ppmv d'éthylène, une séparation GC complète de l'acétylène et de l'éthylène dans le système EPCon était impossible dans nos conditions de travail en laboratoire en raison d'un déséquilibre de masse extrême dans les analytes. Avant l'analyse EPCon δ13Céthylène de ces échantillons, nous avons effectué une élimination hors ligne de l'acétylène de l'espace de tête de l'échantillon par précipitation chimique de l'acétylène avec du nitrate d'argent (AgNO3) dans l'ammoniac, produisant un sel de carbure d'argent34 (Précipitation chimique, Fig. 1c). Une solution ammoniacale d'AgNO3 (0,5 g d'AgNO3 dans 10 ml d'eau) a été ajoutée à chaque échantillon (0,5 ml d'AgNO3/espace de tête de 10 ml contenant 10 % v/v d'acétylène). Une fois la réaction terminée (~ 10 min), l'espace de tête de l'échantillon a été transféré dans un flacon d'échantillonneur automatique pour analyse EPCon (Fig. 1b) et la solution de sel de carbure restante a été neutralisée (1 ml de HCl 5 N). L'élimination complète de l'acétylène a été vérifiée en l'analysant sur un chromatographe en phase gazeuse avec un détecteur à ionisation de flamme (GC-FID). Nous avons estimé l'influence de la précipitation chimique de l'acétylène sur les valeurs de δ13Céthylène à l'aide d'échantillons de contrôle fabriqués avec 2000 ppmv d'éthylène (du réservoir EY-4) avec et sans l'ajout de 10 % v/v d'acétylène (n = 3, tableau 1). Étant donné la nature hautement réactive du sel de carbure d'argent produit de la précipitation lorsqu'il est sec, la précipitation à l'acétylène doit être manipulée avec beaucoup de soin34 et elle n'a été effectuée que si nécessaire dans cette étude (par exemple, échantillon d'éthylène < 20 ppmv).

Pour assurer la continuité entre nos analyses d'échantillons intra-séries et à long terme (entre les séries), nous avons utilisé des réservoirs d'éthylène et d'acétylène disponibles dans le commerce comme normes de réservoir internes (éthylène EY-4, EY-8, acétylène AY-1, AY-4, tableau 1) pour la correction de la dérive et les contrôles quotidiens d'assurance qualité. Les normes de contrôle qualité pour tester les performances de l'IRMS et de l'EPCon ont été analysées avant chaque lot d'échantillons analysés. Toutes les mesures de δ13Céthylène produites par l'EPCon-GC-C-IRMS pendant de longues périodes (~ 30 h) ont été corrigées pour la dérive de la réponse instrumentale au fil du temps par rapport à la norme de correction de dérive (EY-4) qui a été mesurée à intervalles uniformes tout au long des séries d'échantillons en utilisant une interpolation linéaire entre les normes de correction de dérive. Un deuxième étalon (EY-8 ou un lot séparé d'étalons EY-4) a été utilisé pour valider indépendamment le processus de correction de la dérive. Les données des injections directes ont été traitées selon la méthode classique décrite par Zhang et al., 201612, et n'ont pas nécessité de correction de dérive du fait des oxydations fréquentes des germes du réacteur. Voir le tableau supplémentaire S2 en ligne pour les détails de chargement des échantillons avec le placement des normes de contrôle de la qualité et les données supplémentaires S1 en ligne pour les calculs de traitement des données.

Pour chaque méthode de mesure (c'est-à-dire injection directe, EPCon et précipitation chimique + EPCon), nous avons déterminé la sensibilité, la limite de quantification, la plage de linéarité, la répétabilité intrajournalière et la reproductibilité intra-laboratoire (telle que définie dans Carter et Barwick, 201138) par une analyse répétée de l'étalon principal de réservoir d'éthylène interne (EY-4) dans diverses conditions (tableau 1). La sensibilité a été déterminée par régression linéaire du signal de masse 44 de réponse IRMS (aire en volts secondes [Vs]) par rapport à la quantité de carbone d'éthylène (C) chargé (en nmoles C). La plage de linéarité a été définie par les quantités les plus basses et les plus élevées d'éthylène C pouvant être directement injectées dans le GC ou chargées dans l'échantillonneur automatique EPCon pour obtenir une amplitude de pic de masse 44 de 1 à 6 V (plage analytique conservatrice typique). Les échantillons ont été chargés avec un objectif de ~ 2 V pour le signal de masse 44. La répétabilité (c'est-à-dire la variabilité intrajournalière) a été estimée comme la moyenne des écarts types pour chaque jour sur 26 jours pour l'EPCon et 6 jours pour l'injection directe. La reproductibilité intra-laboratoire a été calculée en utilisant l'écart type des mesures moyennes de δ13C pour chaque jour sur 26 jours pour l'EPCon et 6 jours pour l'injection directe.

La limite de quantification (LOQ) a été déterminée en fonction de la concentration minimale d'éthylène (en ppmv) pouvant être mesurée à l'aide de chaque méthode. La LOQ technique, basée sur les normes d'éthylène et les échantillons sans acétylène, est limitée par l'amplitude de pic minimale acceptée (1 V pour la masse 44) et les volumes de chargement maximaux pour chaque méthode (injection directe, 1 ml sous la contrainte de l'injecteur et du chargement de la colonne GC ; EPCon et méthodes de précipitation chimique, 20 ml sous la contrainte du volume du flacon de l'échantillonneur automatique). La LOQ méthodologique pour les échantillons avec une matrice à 10 %, fixée par le volume de chargement maximal qui évite de surcharger le système avec de l'acétylène, est de 0,5 mL pour l'acétylène et de 1,5 mL pour l'EPCon. La LOQ méthodologique lorsque la précipitation chimique a été utilisée est d'environ 2 ppmv, la concentration d'échantillon la plus faible avant que la concentration d'éthylène de fond reportée dans l'acétylène généré à partir de carbure de calcium soit supérieure à l'éthylène provenant de la réduction de l'acétylène de l'échantillon.

Des mutants d'Azotobacter vinelandii utilisant uniquement la Mo-nitrogénase (mutant "MoNase", souche CA70.139) ou uniquement la V-nitrogénase (mutant "VNase", souche CA11.7040) pour la fixation de l'azote ont été cultivés en aérobiose à 30 °C dans un milieu de Burks modifié12,41 avec 100 nM à 1 μM de NaMoO4 (souche CA70.1) ou de NaVO3 (souche CA1 1,70). CA70.1 est un mutant de délétion à double gène (ΔvnfDGK::spc, ΔanfHD70::kan) qui exprime uniquement les gènes nif (Mo-nitrogenase). CA11.70 est également un mutant de délétion double gène (ΔnifHDK, ΔanfHD70 :: kan) qui exprime uniquement les gènes vnf (V-nitrogénase). Des cellules en phase exponentielle (OD620nm ~ 0,3–0,8) ont été échantillonnées pour lancer des essais de réduction d'acétylène. Voir les méthodes supplémentaires S2 en ligne pour plus de détails.

Vue d'ensemble des méthodes de mise à l'échelle directe du δ13Céthylène et du 13εAR (= δ13Csource acétylène - δ13Céthylène) pour convertir les valeurs de l'échantillon de δ13Céthylène en pourcentage de réduction de l'acétylène par la V-nitrogénase (%VNase). Dans la méthode de mise à l'échelle directe 1, le même lot d'acétylène source est utilisé dans les incubations ARA de mutants Azotobacter exprimant uniquement Mo ou VNase comme pour les échantillons environnementaux, excluant la nécessité de mesurer l'acétylène source δ13C et permettant de calculer %VNase uniquement sur la base de δ13Céthylène. Suivant les méthodes de mise à l'échelle 13εAR12, différents lots d'acétylène peuvent être utilisés pour l'échantillonnage et l'étalonnage d'une seule nitrogénase (par exemple, mutant) ARA ; les valeurs mesurées (méthode 2) ou estimées (méthode 3) de ẟ13Csource acétylène ainsi que le δ13Céthylène mesuré pour chaque lot d'ARA sont utilisées pour calculer les valeurs 13εAR, qui sont ensuite converties en %VNase par comparaison avec 13εMo et 13εv. Voir la section Méthode ci-dessus et les méthodes supplémentaires S5 en ligne pour les détails de l'équation.

Des échantillons de surface naturelle (mousse, cyanolichens, litière de feuilles, terre végétale, bois en décomposition) et des termites se nourrissant de bois avec une faible activité de BNF ont été évalués pour l'activité complémentaire de la nitrogénase. Des échantillons ont été prélevés sur des sites forestiers du centre du New Jersey (Institute of Advance Studies, Stony Ford Reserve, Pine Barrens, Watershed Institute) et du New Hampshire (Mount Moosilauke) de 2019 à 2021. Sur chaque site, des triplicats de chaque type d'échantillon ont été prélevés à une ou plusieurs stations (10 m × 10 m par station séparées de 500 à 1 000 m). Les échantillons, conservés à température ambiante, ont été évalués par les ARA dans les 5 jours suivant le prélèvement. Les termites se nourrissant de bois (genre Zootermopsis) ont été obtenus auprès de Ward Scientific (https://www.wardsci.com) et maintenus dans des habitats de laboratoire contrôlés pendant 2 à 16 jours avant l'ARA. Voir les méthodes supplémentaires S3 et le tableau supplémentaire S3 en ligne pour plus de détails.

Des essais de réduction de l'acétylène42 (ARA) ont été effectués sur des cultures d'Azotobacter et des échantillons environnementaux en utilisant 10 % v/v d'acétylène généré à partir de carbure de calcium. La concentration d'éthylène dans l'espace de tête a été surveillée par GC-FID. Voir les méthodes supplémentaires S2, S3 et le tableau supplémentaire S3 en ligne pour plus de détails sur l'ARA.

Les ARA d'Azotobacter ont été réalisés à 30 °C, sous agitation de 200 à 250 tr/min dans des flacons de sérum de 25 à 240 mL scellés avec des bouchons en butyle bleu de 20 mm (Bellco), contenant 10 % en volume de culture cellulaire et une composition d'espace de tête de départ de 90 % d'air v/v et 10 % d'acétylène v/v. Le gaz de l'espace de tête a été transféré dans des flacons de sérum sous vide (10 ml) avec des bouchons en butyle bleus de 20 mm (Bellco) à conserver pour une analyse ultérieure de l'IRMS une fois que les concentrations d'éthylène dans l'espace de tête ont atteint 100 à 2200 ppmv (souche MoNase, généralement dans les 4 h d'incubation) et 50 à 200 ppmv (souche VNase, dans les 6 h d'incubation), donnant des étalons d'éthylène internes EY-Mo-1 et EY-V- 1 (tableau 1, figure 2).

Des échantillons de terrain ARA ont été réalisés dans des bocaux en verre de 100 à 500 ml (Mason, Ball) avec des couvercles en métal munis de bouchons en butyle bleu de 20 mm (litière de feuilles, sol et bois, tableau supplémentaire S3); dans des flacons en verre de 30 ml avec des bouchons à vis munis de septums en PTFE/silicone (mousse, lichens, sol, tableau supplémentaire S3) ; ou dans des flacons de sérum de 15 ml scellés avec des bouchons en butyle de 20 mm (termites, tableau supplémentaire S3). Des incubations témoins (sans ajout d'acétylène) ont été réalisées avec de la litière de feuilles, de la terre, du bois en décomposition (Mt. Moosilauke, Pine Barrens), de la mousse et des lichens (Mt. Moosilauke) et des échantillons de termites pour évaluer la production endogène naturelle d'éthylène indépendamment de la réduction de l'acétylène. Les temps d'incubation de l'ARA pour les échantillons environnementaux variaient de ~ 2 à 300 h (tableau supplémentaire S3) en fonction du taux de production d'éthylène, dans le but d'obtenir au moins 20 ppmv d'éthylène. Les poids des échantillons pour les incubations ARA étaient variables en raison de la disponibilité des échantillons et du taux de production d'éthylène estimé, et sont répertoriés pour chaque emplacement et type d'échantillon dans le tableau supplémentaire S3. L'espace de tête d'ARA a été sous-échantillonné (≤ 3 ml) pour mesurer la concentration d'éthylène par GC-FID, et l'espace de tête restant a été transféré dans des flacons scellés sous vide (10 ml) pour une analyse isotopique ultérieure.

En raison de la faible activité BNF, le δ13Céthylène a été corrigé pour l'influence isotopique de l'éthylène de fond (~ 2 ppmv) transporté dans les ARA par 10 % v/v d'acétylène source (voir les méthodes supplémentaires S4, Eqn. S1 en ligne). Une correction de fond était nécessaire pour les échantillons d'ARA produisant < 20 ppmv d'éthylène ; aucune information quantitative sur la nitrogénase n'a pu être dérivée d'échantillons produisant < 5 ppmv d'éthylène en raison de l'influence isotopique de l'éthylène de fond. Pour les ARA produisant de l'éthylène> 5000 ppmv (c'est-à-dire 5% de la concentration d'acétylène), le δ13Céthylène a également été corrigé pour le fractionnement de Rayleigh12,43.

L'une des trois méthodes (Fig. 2) a été utilisée pour quantifier la contribution de la nitrogénase complémentaire à la réduction de l'acétylène (en %VNase ou %FeNase) dans les ARA en utilisant du δ13Céthylène et du δ13Cacétylène. La méthode de mise à l'échelle utilisée dépendait de la possibilité d'obtenir des mesures précises des valeurs de δ13Cacétylène de la source, compte tenu de la disponibilité des échantillons et des difficultés techniques de chromatographie et de combustion. EPCon-GC-IRMS a été utilisé pour mesurer le δ13Céthylène. Toutes les mesures de δ13Cacétylène ont été faites en utilisant l'approche d'injection directe. Voir les méthodes supplémentaires S5, le tableau supplémentaire S4 et les données supplémentaires S1 en ligne pour plus de détails sur les calculs.

Méthode 1 - L'approche de mise à l'échelle directe (Fig. 2), qui contourne la nécessité de mesurer le δ13Cacétylène, a été utilisée pour calculer la contribution de la nitrogénase complémentaire lorsque la même source de stock d'acétylène a été utilisée dans les échantillons environnementaux ARA en tant qu'ensemble d'ARA d'étalonnage réalisés avec les souches MoNase et VNase d'Azotobacter vinelandii. Le δ13Céthylène mesuré dans les ARA des échantillons environnementaux est converti en %VNase à l'aide des valeurs du membre final δ13Céthylène (par exemple, les normes de mise à l'échelle de l'éthylène, Tableau 1, Fig. 2) diagnostic de l'activité VNase de 0 % et 100 % générée, respectivement, par les ARA d'étalonnage MoNase et VNase Azotobacter (voir Méthodes supplémentaires, S4, Eqn. S3 en ligne). Voir les méthodes supplémentaires S2 en ligne pour plus de détails sur la configuration et les analyses des Azotobacter ARA.

Lorsque le stock d'acétylène source utilisé dans les échantillons d'ARA n'a pas été traité dans les ARA d'étalonnage d'Azotobacter, nous avons quantifié la contribution de la nitrogénase complémentaire à l'aide d'approches ISARA classiques12 (Fig. 2, méthodes 2 et 3), qui nécessitent la connaissance des échantillons δ13Cacétylène et δ13Céthylène pour tenir compte de la variation isotopique des différents stocks d'acétylène dans les calculs de 13εAR (= δ13Cacétylène - δ13Céthylène).

Méthode 2 - Le δ13Cacetylène de différents stocks d'acétylène utilisés dans l'échantillon et les Azotobacter ARA, mesurés avec la méthode d'injection directe, a été utilisé avec l'échantillon δ13Céthylène pour calculer 13εAR, suivi d'un étalonnage à l'échelle %VNase en utilisant 13εV et 13εMo d'Azotobacter et d'autres diazotrophes, Rhodopseudomonas palustris et Anabaena variabilis (Fig. 2, Méthodes supplémentaires S 5, tableau supplémentaire S4, données supplémentaires S1 ; calcul modifié de Zhang et al., 201612).

Méthode 3- Lorsqu'une mesure précise du δ13Cacétylène par injection directe pour le stock spécifique d'acétylène dans un ARA était impossible, nous avons utilisé la moyenne et l'écart type du δ13Cacétylène pour sept lots différents d'acétylène générés à partir de carbure de calcium au cours des 4 dernières années (δ13Cacétylène = 14,9 ± 0,9 ‰, n = 8; Fig. Supplémentaire S1; Eqn. S5) dans 13 Calculs εAR. %VNase a été calculé en utilisant les valeurs 13εV et 13εMo d'Azotobacter et d'autres diazotrophes comme dans la méthode 2 (Fig. 2, Méthodes supplémentaires S5, Tableau supplémentaire S4, Données supplémentaires S1).

La croissance instable de la souche de nitrogénase A. vinelandii Fe uniquement (RP1.1144, mutant « FeNase ») a exclu les calculs de % FeNase basés sur Azotobacter. Les calculs %FeNase (Fig. 2, méthode supplémentaire S5, tableau S4, données S1) ont utilisé EPCon dérivé 13εFe = 5,2 ± 0,7‰ (sd) de Rhodopseudomonas palustris en utilisant uniquement FeNase12 dans les ARA. Étant donné que 13εFe < 13εV < 13εMo12, une activité FeNase significative peut conduire à des valeurs %VNase > 100 % (c'est-à-dire que 100 % FeNase équivaut à ~ 140 % VNase ; tableau supplémentaire S4). L'incertitude estimée sur l'échelle %FeNase est d'au plus ~ 20 %.

Les contributions complémentaires de la nitrogénase à la fixation de N2 et les taux de fixation de N2 totaux ajustés à l'isoforme peuvent être calculés en utilisant la contribution %VNase ou %FeNase à l'AR (voir ci-dessus) et les rapports R spécifiant le taux de fixation de l'AR à la N2 pour chaque nitrogénase (par exemple, RMoNase = 4, RVNase = 2, RFeNase = 0,5)12.

La sensibilité de mesure du δ13Céthylène par GC-C-IRMS est ~ 40 fois plus élevée avec l'ajout du périphérique EPCon que par injection directe (4,3 contre 0,1 Vs nmolC-1, Tableau 1).

En éliminant l'acétylène et en condensant l'éthylène avant l'introduction sur la colonne dans le GC-C-IRMS, le système EPCon-GC-C-IRMS produit des mesures fiables de δ13Céthylène avec aussi peu que 1,1 nmol C d'éthylène, alors que la méthode d'injection directe nécessite > 23,6 nmol C. permet la mesure de gaz avec ≥ 0,7 ppmv d'éthylène en l'absence d'acétylène de fond. La concentration minimale d'éthylène pour les échantillons avec un arrière-plan de 10 % v/v d'acétylène (échantillons ARA typiques) est de 9 ppmv, ou de 2 ppmv si l'acétylène de fond est éliminé par précipitation chimique avant les analyses EPCon. De manière prudente, les concentrations minimales d'éthylène de travail pour les échantillons d'ARA sont de 500 ppmv (injection directe), 20 ppmv (EPCon-GC-C-IRMS) et 5 ppmv (précipitation chimique + EPCon-GC-C-IRMS). La sensibilité plus faible de la méthode GC-C-IRMS à injection directe est en partie due à l'utilisation nécessaire d'un rapport de division élevé dans le port de l'injecteur d'échantillon (40: 1 - la proportion d'échantillon et de flux de gaz porteur He qui est évacuée du port d'injection par rapport à la proportion qui pénètre dans la colonne GC) pour résoudre complètement les pics d'éthylène (~ quelques à plusieurs centaines de ppmv) et d'acétylène (~ 100 000 ppmv) avec notre colonne capillaire GC.

Nous avons utilisé de l'éthylène de réservoir avec des compositions constantes en δ13C comme étalons internes au cours d'essais de ~ 30 h (~ 75 échantillons et ~ 45 contrôles de qualité, configuration d'essai typique dans le tableau supplémentaire S2 en ligne) pour les corrections de dérive intra-journalière (plage de 2 à 4 ‰; Fig. supplémentaire S3) causée par le vieillissement du réacteur au fil du temps (sans oxydations fréquentes des graines), garantissant la comparabilité des résultats sur plusieurs jours (long terme sd = 0, 2 ‰, tableau 1). La répétabilité et la reproductibilité intra-laboratoire du δ13Céthylène du réservoir EY-4 sont similaires pour les méthodes d'injection directe et EPCon-GC-C-IRMS (répétabilité 0,11‰ et 0,20‰ ; reproductibilité 0,27‰ et 0,17‰, respectivement). En plus de la reproductibilité élevée du δ13Céthylène du système EPCon, les valeurs de δ13Céthylène obtenues par EPCon et les méthodes d'injection directe pour toutes les normes d'éthylène étaient en bon accord (tableau 1). Nous concluons que le système EPCon n'introduit pas de biais substantiel dans l'exactitude des résultats, et les données EPCon sont directement comparables aux résultats publiés obtenus à l'aide de méthodes d'injection directe12,13,15,16.

Plusieurs sources d'incertitude et de biais pour les mesures de δ13C d'éthylène et d'acétylène ont été identifiées à l'aide d'étalons de réservoir. Parfois, l'intégration automatique proposée par le logiciel a sous-estimé la valeur δ13C attendue de la norme, probablement en raison d'une importante traînée de 13C par rapport au 12C liée au réacteur de combustion (Fig. S3 supplémentaire). Ce phénomène était plus prononcé avec les analyses de δ13Cacétylène, peut-être en raison d'interactions plus fortes entre l'acétylène et les métaux du réacteur de combustion (CuO, NiO, Pt) ainsi que la colonne GC elle-même. L'excès d'acétylène (c'est-à-dire l'amplitude maximale de la masse 44 > 5 V) apparent pendant les analyses de δ13Céthylène a exacerbé les problèmes de traînée de pic, provoquant une diminution de la précision du δ13Céthylène (jusqu'à 5 ‰). Le reconditionnement de la colonne GC et du réacteur de combustion était nécessaire lorsqu'un excès d'acétylène était introduit par inadvertance dans le GC-C-IRMS (par exemple, une ventilation incomplète dans l'EPCon).

Nous avons testé les interférences de différents gaz couramment présents dans les échantillons environnementaux et des gaz de fond générés lors de l'ARA. Le système EPCon élimine avec succès la plupart des gaz de fond (Air/N2, CH4, CO2, acétylène) et minimise leurs interférences maximales avec l'éthylène (tableau 1). Seul l'éthane, produit à < 3 % du taux d'éthylène par la nitrogénase dans les ARA12,14, est retenu par l'EPCon, mais son interférence isotopique avec l'éthylène est minime car les pics d'éthane et d'éthylène sont bien séparés dans le GC-C-IRMS.

La mesure du δ13Céthylène par EPCon-GC-C-IRMS et du δ13Cacétylène par injection directe GC-C-IRMS pour les échantillons d'ARA constitue la base de la méthode de dosage isotopique de réduction de l'acétylène à faible activité BNF (LISARA). Nous avons appliqué LISARA à divers échantillons environnementaux (sol, litière de feuilles, bois pourri, mousse et cyanolichens provenant de sites du nord-est des États-Unis et termites se nourrissant de bois élevés en laboratoire) avec une large gamme de rendements d'éthylène dans les ARA (5 à 1 000 ppmv). Une (ou plusieurs) des trois méthodes de calcul (Fig. 2) a été utilisée pour obtenir les contributions %VNase (ou %FeNase) à la réduction de l'acétylène (AR ; méthodes 1, 2, 3, Figs. 2 et 3).

La méthode ISARA classique12 utilise 13εAR, le fractionnement des isotopes stables du carbone dû à la réduction de l'acétylène dans les ARA (c'est-à-dire δ13Cacétylène– δ13Céthylène) et les valeurs diagnostiques de 13εAR pour l'AR par chaque isoforme de nitrogénase (13εMo, 13εV et 13εFe, tableau supplémentaire S4) pour déterminer %VNase ou %FeNase (Figs. 2 et 3 ). Pour contourner la mesure de l'acétylène δ13C, qui présente des incertitudes typiques 3 à 4 fois supérieures à celles de l'éthylène (tableau 1) et est souvent retenue dans le système pour nécessiter un reconditionnement fréquent du GC-C, nous avons développé une approche de mise à l'échelle directe pour calculer la contribution de la nitrogénase complémentaire basée uniquement sur le δ13Céthylène (Fig. 2, méthode 1). Ceci est réalisé en comparant le δ13Céthylène généré à partir d'une source commune de stock d'acétylène utilisé dans les ARA d'échantillons environnementaux (δ13Csample) et les ensembles d'ARA d'étalonnage isotopique réalisés avec les souches MoNase et VNase d'Azotobacter vinelandii (δ13CMo et δ13CV, Fig. 2, Méthodes supplémentaires S5). Nous n'avons pas pu déterminer les valeurs de δ13CFe pour les calculs %FeNase avec A. vinelandii par des approches de mise à l'échelle directe car la croissance de la souche FeNase RP1.1144 était instable.

Idéalement, toutes les valeurs isotopiques des échantillons seraient mises à l'échelle en % de nitrogénase complémentaire à l'aide de la méthode 1, l'approche de mise à l'échelle directe, car elle est associée à la moindre incertitude. Les méthodes 2 et 3, appliquées aux échantillons qui ont été analysés avant l'élaboration des normes de mise à l'échelle directe et des protocoles associés, peuvent également être utilisées dans les cas où les procédures de mise à l'échelle directe n'ont pas pu être complétées (par exemple, acétylène insuffisant, échec des expériences Azotobacter ARA). Bien que la méthode 3 soit associée à l'incertitude la plus élevée, elle fournit le moyen le plus rapide d'estimer la contribution des nitrogénases complémentaires au BNF.

À l'exception des cyanolichens, tous les types d'échantillons présentaient un signal isotopique compatible avec l'activité complémentaire de la nitrogénase (Fig. 3, statistiques récapitulatives dans la légende, notez que 140 % de VNase équivaut à 100 % de FeNase, voir Méthodes ci-dessus). Les contributions potentielles de la nitrogénase complémentaire à la RA dans les échantillons de litière de feuilles et de mousse variaient de 0 à 100 % de VNase, à l'exception d'un échantillon de litière de feuilles contenant 195 % de VNase. Les contributions potentielles dans le bois en décomposition et les termites variaient de 40 à 160 % de VNase. Les données de sol sont également très variables, allant de 30 à 180 % de VNase. Quelques-uns des 114 échantillons analysés sont des valeurs aberrantes avec plus de ~ 200% de VNase (1 mousse, 2 échantillons de sol, données non présentées sur la figure 3), que nous attribuons au fractionnement isotopique du gaz dû à la fuite du bouchon.

L'incertitude estimée pour les contributions %VNase à l'AR pour les échantillons environnementaux quantifiés par mise à l'échelle directe des valeurs de δ13Céthylène est inférieure aux incertitudes des méthodes basées sur 13εAR : ~ 9 % pour la méthode de mise à l'échelle directe 1, ~ 15 % pour la méthode 13εAR 2, ~ 20 % pour la méthode 13εAR 3 (Fig. 3, méthode supplémentaire S5 ; données supplémentaires S1). La précision accrue obtenue en mettant directement à l'échelle δ13Céthylène à %VNase (méthode 1) évite l'incertitude associée aux mesures de δ13Cacétylène. Cela est évident sur la Fig. 3, où les valeurs %VNase pour les mutants de nitrogénase unique (c'est-à-dire les valeurs pour Av MoNase et Av VNase sur la Fig. 3) sont plus étroitement regroupées pour la méthode 1 (utilise la mise à l'échelle directe de l'échantillon et du mutant δ13Céthylène valeurs) que celles des méthodes 2 et 3 (utilise des valeurs explicites de 13εAR). La plupart des attributions complémentaires de nitrogénase pour les ARA à culture unique de nitrogénase se regroupent à moins de 15 % de leurs valeurs attendues (c. . vinelandii VNase, ~ - 20 % VNase pour la souche A. vinelandii MoNase). Les incertitudes pour %FeNase quantifiées à l'aide de 13εAR et 13εFe de Rhodopseudomonas palustris FeNase sont d'environ 15 à 20 % (méthode supplémentaire S6, données supplémentaires S1). Ainsi, les échantillons nécessitant la plus grande précision (très faible activité BNF) pour les quantifications de la contribution de la nitrogénase complémentaire doivent utiliser la méthode de mise à l'échelle directe à base de δ13Céthylène (méthode 1).

Contribution complémentaire de la nitrogénase à la réduction de l'acétylène (en %VNase ou %FeNase) dans les ARA sur des échantillons environnementaux avec une faible activité BNF et une seule nitrogénase utilisant des cultures diazotrophes. Statistiques récapitulatives des échantillons (moyenne ± écart-type %VNase, plage %VNase, nombre d'échantillons) : litière de feuilles (32,4 % ± 45,4 %, − 19,9 à 195,4 %, 30), lichens (− 0,8 % ± 4,7 %, − 8,9 à 5,6 %, 6), mousse (65,3 % ± 37,9 %, − 14,5 à 123). 0 %, 31), Sol (123,9 % ± 37,2 %, 25,4 à 177,8 %, 21), Termites (130,1 % ± 22,0 %, 104,8 à 156,6 %, 7) et Bois en décomposition (125,9 % ± 32,6 %, 40,6 à 167,6 %, 43). Les abréviations sont les suivantes : Av MoNase – souche Azotobacter vinelandii MoNase, Av VNase – souche A. vinelandii VNase et Rp FeNase – souche Rhodopseudomonas palustris FeNase. Voir les méthodes supplémentaires S5 et S6 et les données supplémentaires S1 en ligne pour plus de détails sur les calculs de mise à l'échelle et d'incertitude.

Compte tenu des incertitudes, les échantillons d'ARA avec > 160 % sur l'échelle %VNase et > 120 % sur l'échelle %FeNase doivent être fortement influencés par des processus non liés au BNF (par exemple, cycle endogène naturel d'éthylène - production ou consommation, fuite de gaz des bouchons). Le fractionnement non lié au BNF peut expliquer les valeurs > 160 % de VNase observées pour certains échantillons de litière (n = 1), de mousse (n = 1), de sol (n = 4), de bois en décomposition (n = 2).

Une sensibilité accrue dans le système EPCon-GC-C-IRMS par rapport à GC-C-IRMS (tableau 1) entraîne des besoins en éthylène de l'échantillon ~ 120 à 450 fois inférieurs (selon que l'acétylène est également présent dans l'échantillon, tableau 1). Il est important de noter que les analyses EPCon des échantillons ARA entraînent une exposition limitée de la colonne GC et du réacteur de combustion à l'acétylène dans les échantillons ARA, ce qui entraîne une dérive substantielle des résultats analytiques en raison de la dégradation par l'acétylène de la colonne GC et des performances du réacteur. Combiné avec des corrections de dérive intra-journalière basées sur le gaz du réservoir avec un δ13C constant, l'utilisation du système EPCon donne des résultats plus reproductibles, limite le nombre d'oxydations du réacteur et prolonge la durée de vie du réacteur et de la colonne capillaire GC, réduisant ainsi le temps et le coût à long terme par analyse IRMS. De plus, toutes ces améliorations instrumentales et analytiques garantissent des résultats comparables avec des concentrations d'éthylène beaucoup plus faibles dans les analyses et les expériences, sans compromettre la reproductibilité. En conséquence, 120 mesures de δ13Céthylène peuvent être réalisées de manière automatisée sur une période de 30 heures dans le système EPCon, contre 7 à 10 jours de travail à temps plein pour une personne utilisant l'injection directe dans le GC-C-IRMS.

La méthode LISARA est une amélioration analytique clé nécessaire aux études de la fixation de l'azote par les nitrogénases complémentaires dans l'environnement global. La mise à niveau analytique EPCon-GC-C-IRMS permet la caractérisation isotopique fiable et reproductible de l'éthylène dans les échantillons d'ARA à pratiquement n'importe quelle concentration d'éthylène. En pratique, des échantillons contenant aussi peu que 20 ppmv d'éthylène peuvent être mesurés en routine avant que la capacité d'élimination de l'acétylène par l'EPCon ne soit atteinte (Fig. 1). Des échantillons d'ARA à très faible rendement (5 à 20 ppmv d'éthylène) peuvent également être mesurés par le système EPCon après l'élimination complète de l'acétylène de l'espace de tête par précipitation chimique (voir la section Méthodes). Cependant, la présence d'éthylène de fond transporté dans l'acétylène utilisé pour les ARA et la production potentielle d'éthylène endogène naturel (c'est-à-dire non associé au BNF) peuvent affecter les valeurs de δ13Céthylène, compliquant les interprétations de la contribution de la nitrogénase complémentaire dans les échantillons à très faible activité BNF évalués à l'aide de LISARA.

Le développement d'une approche de mise à l'échelle directe pour calculer les contributions complémentaires de nitrogénase basée uniquement sur le δ13Céthylène à partir des analyses LISARA contourne plusieurs limitations associées à ISARA traditionnel, telles que la nécessité de concentrations d'éthylène > 500 ppmv et l'exigence de mesures de δ13Cacétylène. De plus, l'étape de précipitation hors ligne pour éliminer complètement l'acétylène de l'espace de tête de l'échantillon ARA permettrait à tout laboratoire de microbiologie ou de chimie humide d'externaliser les analyses ISARA de l'éthylène à partir d'échantillons et d'ARA d'étalonnage de nitrogénase unique exécutés avec la même source d'acétylène vers d'autres laboratoires d'analyse d'isotopes stables pour les mesures de δ13Céthylène. Nous notons que la comparabilité des valeurs absolues de δ13C entre les groupes de recherche peut varier et être difficile à évaluer car plusieurs facteurs (par exemple, le type de colonne GC et l'état du réacteur d'oxydation) peuvent influencer les valeurs absolues de δ13C. Cela rend les analyses simultanées d'ARA d'étalonnage de nitrogénase unique et d'échantillons environnementaux particulièrement importantes.

Outre les études sur la nitrogénase complémentaire, le système EPCon a également des applications dans d'autres domaines, notamment la biologie végétale. Par exemple, l'analyse EPCon de la composition isotopique de l'éthylène produit de manière endogène (par exemple, par les bactéries et les plantes du sol), une phytohormone impliquée dans la réponse au stress et la germination des graines45, pourrait aider à identifier ses sources et à suivre son cycle dans des environnements pédologiques complexes.

Parmi les divers échantillons terrestres caractérisés à l'aide de LISARA, 5 des 6 types d'échantillons présentaient des valeurs de δ13Céthylène compatibles avec une certaine contribution de la nitrogénase complémentaire à l'activité BNF (Fig. 3). Ces résultats s'ajoutent aux preuves croissantes suggérant une activité nitrogénase complémentaire généralisée dans les écosystèmes terrestres. Contrairement à une étude précédente sur l'espèce de cyanolichen Peltigera dans les forêts boréales, qui a révélé des niveaux élevés d'activité nitrogénase complémentaire13, nous n'avons trouvé aucune preuve d'activité VNase dans des échantillons du même genre collectés dans le nord-est tempéré des États-Unis (Fig. 3, lichens). L'activité complémentaire de la nitrogénase dans ce genre de cyanolichen s'est avérée être principalement contrôlée par la quantité de molybdène dans les thalles de lichen (teneur en Mo thalles < 300 µgMo.gdry_lichen−1)13, ce qui reflète le dépôt atmosphérique. Le taux de dépôt atmosphérique plus élevé de Mo dans le nord-est tempéré de l'US46 peut fournir suffisamment de Mo à ces échantillons de lichen pour éviter le besoin de nitrogénase complémentaire BNF.

L'activité de nitrogénase complémentaire constante observée ici pour la litière de feuilles du nord-est, le sol, les échantillons de bois en décomposition et pour les termites se nourrissant de bois reflète probablement des contrôles de Mo différents et plus complexes sur le BNF que dans les cyanolichens et la mousse, qui sont plus directement liés aux dépôts atmosphériques riches en Mo. Des différences existent probablement dans les besoins en Mo parmi les diazotrophes, reflétant peut-être des variations dans les stratégies de gestion des métaux au niveau de l'organisme47 et dans les propriétés physicochimiques des environnements autour des cellules diazotrophes, qui peuvent moduler la biodisponibilité du Mo. Par exemple, des niveaux plus élevés de certaines formes de matière organique à forte capacité de liaison au Mo (fragments catéchols) dans les échantillons48 pourraient entraîner des besoins totaux en Mo plus élevés pour le Mo BNF, influençant les relations entre le Mo et la nitrogénase complémentaire dans les échantillons49. Collectivement, nos résultats mettent en évidence la nécessité d'études plus détaillées sur la BNF complémentaire et ses contrôles dans de nombreux types d'échantillons courants.

La présence d'éthylène de fond dans l'acétylène source (~ 2 ppmv d'éthylène pour 10 % v/v d'acétylène à partir de carbure de calcium) reste un défi lors de la quantification de la nitrogénase complémentaire dans des échantillons environnementaux à très faible activité (< 20 ppmv d'éthylène généré dans les ARA). Bien que le signal isotopique de l'éthylène de fond dans l'acétylène source puisse être déterminé facilement à l'aide des méthodes EPCon actuelles, il existe une variabilité significative (8,4 ± 1,9 ‰, n = 8 lots d'acétylène). Les corrections isotopiques pour l'éthylène de fond n'entraînent pas beaucoup de perte de précision et d'exactitude dans les ARA contenant un rendement d'éthylène de 10 à 20 ppmv, mais entraîneraient une forte augmentation de l'incertitude pour les échantillons contenant de l'éthylène < 10 ppmv. Par conséquent, la méthode LISARA ne peut fournir des informations qualitatives sur la nitrogénase complémentaire que pour les échantillons contenant 2 à 5 ppmv d'éthylène.

Lors du sondage d'échantillons environnementaux, le cycle naturel de l'éthylène endogène par les bactéries et les plantes du sol peut également interférer avec la quantification de la contribution de la nitrogénase complémentaire (voir Hendrickson 198950 et ses références). Étant donné que les conditions de faible teneur en oxygène favorisent la production d'éthylène et inhibent l'oxydation de l'éthylène50, de longues incubations sont susceptibles d'augmenter ce phénomène. Dans cette étude, nous avons observé une production endogène significative d'éthylène (c'est-à-dire > 5 % de la concentration d'éthylène produite par l'ARA pour un type d'échantillon et un emplacement donnés) dans 12 des 93 échantillons témoins « sans acétylène ajouté ». Les 12 échantillons contenant de l'éthylène endogène ont été incubés pendant 290 à 300 h (27 échantillons ont été incubés pendant cette durée). Un autre lot de 27 échantillons incubés pendant 165 à 175 h n'a pas montré de signes de production endogène d'éthylène. Il a été rapporté que l'acétylène inhibe l'oxydation de l'éthylène, ainsi les échantillons de contrôle "sans acétylène ajouté" pourraient ne pas être suffisants pour évaluer la production endogène d'éthylène dans les ARA avec un très faible rendement en éthylène (< 20 ppmv)50. Ainsi, nous recommandons d'incuber les échantillons pendant idéalement moins de 60 h lors de la réalisation d'enquêtes ISARA ou LISARA. Dans l'ensemble, le faible taux de production d'éthylène endogène de nos échantillons pendant les incubations (tableau supplémentaire S3) et la similitude entre les signatures isotopiques obtenues pour chaque type d'échantillon sur quatre sites, 2 ans et divers temps d'incubation (2 à 300 h) indiquent que le cycle naturel de l'éthylène a une influence minimale sur nos résultats rapportés.

Notre procédure et notre méthodologie analytiques mises à jour permettent désormais d'étudier la contribution et les contrôles environnementaux sur la nitrogénase complémentaire dans la plupart des échantillons de fixation de N2, malgré les limitations restantes de l'analyse LISARA des échantillons d'éthylène à très faible rendement d'ARA. La méthode LISARA diminue l'incertitude et le biais associés aux mesures d'acétylène et permet une utilisation plus large de la méthodologie ISARA avec des cultures pures et des organismes à haut rendement. Enfin, notre étude des types d'échantillons communs dans plusieurs écosystèmes tempérés du nord-est des États-Unis fournit une preuve supplémentaire de l'importance écologique de la nitrogénase complémentaire pour le cycle de l'azote et des métaux traces dans les écosystèmes terrestres. Les différences de contribution spécifiques à l'échantillon, comme le suggèrent nos résultats, appellent à une enquête plus approfondie sur les contrôles de la nitrogénase spécifique à l'isozyme dans les environnements naturels.

Toutes les données présentées ici peuvent être consultées en ligne dans les informations supplémentaires 1 (comprend les méthodes S1 à S6 ; les figures S1 à S3 ; les tableaux S1 à S5) et les données supplémentaires S1.

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Nous tenons à remercier le soutien financier du Watershed Institute (https://thewatershed.org), de la Carbon Mitigation Initiative (Princeton High Meadows Environmental Institute à XZ), du Tuttle Fund (Princeton Geoscience Department à XZ), de la subvention NSF EAR 1631814 (à XZ) et d'une bourse postdoctorale de recherche en sciences de la vie de la Fondation Simons (à RD). Nous remercions les collaborateurs du Watershed Institute, de la Rutgers Pineland Field Station, du Stony Ford Center for Ecological Studies de l'Université de Princeton, de l'Institute of Advanced Studies et du Dartmouth College-Mt. Comité consultatif de Moosilauke pour la permission et l'accès aux échantillons de terrain ; Katja Luxem et Linta Reji pour l'aide au travail de terrain, Anne Kraepiel, F. Morel, JP Bellenger, et tous les membres du laboratoire Zhang pour les discussions.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Shannon J. Haynes et Romain Darnajoux.

Département de géosciences, Université de Princeton, Guyot Hall, Princeton, NJ, 08544, États-Unis

Shannon J. Haynes, Romain Darnajoux, Eunah Han, Sergey Oleynik & Xinning Zhang

High Meadow Environmental Institute, Université de Princeton, Guyot Hall, Princeton, NJ, 08544, États-Unis

Ezra Zimble et Xinning Zhang

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SJH, RD et XZ ont rédigé le texte du manuscrit. SJH et RD ont préparé les chiffres. SO a construit l'instrument EPCon utilisé dans cette étude. SH a dirigé le développement méthodologique avec les contributions de RD, SO et XZ, SJH, RD, EH et EZ ont collecté des échantillons de terrain et contribué à l'acquisition de données. SJH, RD et EH ont effectué une analyse des données. XZ a fourni une expertise technique, des conseils de projet et un soutien financier. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance avec Shannon J. Haynes ou Xinning Zhang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Haynes, SJ, Darnajoux, R., Han, E. et al. Quantification de la fixation biologique de l'azote par des nitrogénases complémentaires Mo-indépendantes dans des échantillons environnementaux à faible activité de fixation de l'azote. Sci Rep 12, 22011 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24860-9

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Reçu : 22 août 2022

Accepté : 22 novembre 2022

Publié: 20 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-24860-9

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