Résoudre la septicémie

Nature Biomedical Engineering (2023)Citer cet article

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L'immunoparalysie est une réponse anti-inflammatoire compensatoire et persistante à un traumatisme, une septicémie ou une autre atteinte grave, qui augmente le risque d'infections opportunistes, de morbidité et de mortalité. Ici, nous montrons que dans des monocytes humains primaires en culture, l'interleukine-4 (IL4) inhibe l'inflammation aiguë, tout en induisant simultanément une mémoire immunitaire innée de longue durée appelée immunité entraînée. Pour tirer parti de cette caractéristique paradoxale de l'IL4 in vivo, nous avons développé une protéine de fusion de l'apolipoprotéine A1 (apoA1) et de l'IL4, qui s'intègre dans une nanoparticule lipidique. Chez la souris et les primates non humains, une nanoparticule incorporant l'apoA1-IL4 injectée par voie intraveineuse cible les organes hématopoïétiques riches en cellules myéloïdes, en particulier la rate et la moelle osseuse. Nous démontrons ensuite que la nanothérapie IL4 a résolu l'immunoparalysie chez les souris présentant une hyperinflammation induite par les lipopolysaccharides, ainsi que dans des modèles de septicémie humaine ex vivo et dans l'endotoxémie expérimentale. Nos résultats appuient le développement translationnel de formulations de nanoparticules d'apoA1-IL4 pour le traitement des patients atteints de septicémie à risque de complications induites par l'immunoparalysie.

La septicémie est une affection médicale grave causée par une réponse dérégulée de l'hôte à l'infection qui entraîne fréquemment une défaillance des organes et la mort1. En raison de l'incapacité du système immunitaire à éliminer un agent pathogène, les patients atteints de septicémie peuvent présenter simultanément des caractéristiques hyper-inflammatoires et immunosuppressives, ce qui rend cette affection extrêmement difficile à gérer2,3,4. Jusqu'à 30 à 40 % des patients atteints de sepsis présentent un phénotype d'immunoparalysie dominant. L'immunoparalysie est caractérisée par une réponse immunitaire innée anti-inflammatoire persistante suite à une agression telle que la septicémie5, exposant les patients à un risque élevé d'infections récurrentes et secondaires, entraînant fréquemment un dysfonctionnement des organes et la mort6.

Les stratégies thérapeutiques visant à rééquilibrer les réponses immunitaires dans le sepsis et à améliorer les résultats des patients grâce à l'immunothérapie en sont à leurs balbutiements. Des travaux expérimentaux récents suggèrent que la reprogrammation à long terme des cellules immunitaires innées7,8, un processus appelé « immunité entraînée »9,10, pourrait être capable d'inverser la tolérance et l'immunoparalysie induites par une stimulation bactérienne exagérée11. Bien que l'immunité entraînée induite thérapeutiquement12 soit théoriquement une stratégie convaincante pour surmonter l'immunoparalysie, il existe un besoin critique d'approches qui peuvent être transposées en toute sécurité et efficacement en milieu clinique.

Dans notre quête pour résoudre simultanément l'hyper-inflammation et l'immunoparalysie, nous avons considéré l'interleukine-4 (IL4) pour la modulation de l'immunité et de la tolérance entraînées. Lors de la réévaluation des effets directs rapportés de cette cytokine sur les monocytes in vitro13,14,15, nous avons découvert que l'IL4 induit paradoxalement une immunité entraînée en plus de ses effets anti-inflammatoires connus. Nous avons émis l'hypothèse que les propriétés uniques de l'IL4 pourraient être déployées pour surmonter l'immunoparalysie dans les monocytes induite par la stimulation avec une endotoxine bactérienne (lipopolysaccharide (LPS)). Cependant, en raison de ses propriétés pharmacocinétiques défavorables et de la large expression du récepteur de l'IL4 (IL4R), l'IL4 naturelle est mal adaptée à la régulation thérapeutique des cellules myéloïdes in vivo. L'acheminement direct de l'IL4 vers le compartiment myéloïde est donc une voie thérapeutique intéressante. À l'appui de ce concept, nous avons développé une protéine de fusion de l'apolipoprotéine A1 (apoA1) - le principal constituant protéique de la lipoprotéine de haute densité - et de l'IL4 et avons appelé cette construction 'apoA1–IL4'16,17. La protéine de fusion apoA1 – IL4 s'est facilement intégrée dans des nanoparticules lipidiques pour générer des nanoparticules IL4 avides de cellules myéloïdes. Nous avons ensuite évalué le comportement des nanoparticules d'IL4 chez des souris et des primates non humains à l'aide d'une imagerie par tomographie par émission de positrons (TEP) in vivo et d'un comptage gamma quantitatif ex vivo. Enfin, nous avons étudié le potentiel thérapeutique des nanoparticules d'IL4 dans l'inflammation translationnelle multiple et des modèles in vivo et ex vivo de sepsis.

Dans le cadre de l'immunologie des cellules myéloïdes, l'IL4 est principalement connue pour ses propriétés anti-inflammatoires13,14,15. Par conséquent, nous avons d'abord validé plusieurs effets inhibiteurs connus de l'IL4 sur l'inflammation dans les monocytes humains primaires (Fig. 1a). Nous avons stimulé des monocytes enrichis en Percoll avec du LPS pendant 24 h, en présence ou en l'absence d'IL4 (25 ng ml-1). Comme prévu, l'IL4 a puissamment inhibé la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires facteur de nécrose tumorale (TNF) et IL6 (Fig. 1b). Fait intéressant, les cellules traitées à l'IL4 ont sécrété beaucoup plus d'IL-1Ra par rapport aux témoins (Fig. 1b). Comme la glycolyse est régulée positivement dans les cellules myéloïdes activées18, nous avons mesuré la production de lactate dans des monocytes autrement non stimulés traités avec de l'IL4 ou un contrôle moyen. Nous avons constaté que l'IL4 abaissait légèrement, mais significativement, la production initiale de lactate (données étendues, Fig. 1a), confirmant ses propriétés anti-inflammatoires aiguës.

a, Schéma des expériences d'inflammation directe in vitro. b, taux de TNF, IL6 et IL1Ra après 24 h de stimulation des monocytes primaires humains. c, Schéma des expériences d'immunité formées in vitro. d, niveaux de TNF et d'IL6 après restimulation des cellules formées au β-glucane. e, niveaux de TNF et d'IL6 après restimulation des cellules formées à l'IL4. f, analyse Seahorse du métabolisme glycolytique (à gauche) et mitochondrial (à droite) dans des cellules formées à l'IL4. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sd OCR, taux de consommation d'oxygène ; 2-DG, 2-désoxy-D-glucose.

Sur la base de ces propriétés anti-inflammatoires, nous avons émis l'hypothèse que l'IL4 pourrait également inhiber l'induction d'une immunité entraînée (Fig. 1c). Pour tester cette hypothèse, les monocytes ont été entraînés avec du β-glucane, un stimulus d'immunité entraîné prototypique, pendant 24 h, suivi d'un lavage du stimulus et d'une période de repos de 5 jours dans un milieu de culture. Au jour 6, nous avons restimulé les cellules avec du LPS pendant encore 24 h et mesuré le TNF et l'IL6 (Fig. 1d). Alors que le β-glucane a induit une immunité entraînée comme prévu, l'ajout d'IL4 au cours des 24 premières heures n'a pas inhibé l'effet d'entraînement (Fig. 1d). Contrairement à notre hypothèse initiale, l'exposition des monocytes à l'IL4 seule pendant 24 h a induit un phénotype d'immunité entraîné au jour 6 (Fig. 1e). Outre une production accrue de cytokines pro-inflammatoires, les cellules formées à l'IL4 produisaient plus de lactate au départ (données étendues Fig. 1b). De plus, les cellules entraînées à l'IL4 étaient légèrement moins efficaces pour phagocyter Candida albicans tué par la chaleur que les témoins non entraînés (données étendues, Fig. 1c). Ensemble, nos données montrent que l'IL4 inhibe l'inflammation et induit une immunité entraînée, aux niveaux métabolique et immunologique fonctionnel.

Encouragés par ces observations, nous avons étudié de manière approfondie les altérations métaboliques consécutives à l'immunité entraînée induite par l'IL4. Dans ce but, nous avons utilisé des analyses de flux métaboliques Seahorse pour sonder le métabolisme glycolytique et oxydatif des cellules formées à l'IL4 et des témoins non stimulés. L'entraînement à l'IL4 au jour 0 a eu un effet marqué sur les paramètres métaboliques mesurés au jour 6 (Fig. 1f), avec une tendance à une glycolyse basale plus élevée et une augmentation significative de la capacité glycolytique maximale déclenchée par l'oligomycine (Fig. 1f, à gauche). De plus, les taux de respiration maximaux déclenchés par le cyanure de carbonyle et le cyanure de p-trifluorométhoxyphénylhydrazone ont été considérablement augmentés par l'entraînement à l'IL4 (Fig. 1f; à droite).

Nous avons ensuite utilisé la cytométrie en flux pour mesurer plusieurs paramètres couramment associés à l'activation de l'IL4 des monocytes et des macrophages (Extended Data Fig. 1d). L'entraînement d'IL4 a provoqué une forte régulation à la baisse de l'expression du cluster de différenciation (CD) 14 au jour 6. En revanche, CD200R et surtout CD206 ont été significativement améliorés au jour 6 après l'activation d'IL4 au jour 0. CD80 a été légèrement augmenté par l'entraînement d'IL4, mais dans l'ensemble l'expression était encore faible sur ces macrophages par ailleurs naïfs. On sait que les cellules dendritiques dérivées de monocytes (moDC, qui sont différenciées à l'aide de l'IL4 + facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF)) régulent également à la baisse CD14 tout en régulant fortement à la hausse CD1c. Les cellules formées à l'IL4 exprimaient légèrement plus de CD1c que les cellules non formées, mais beaucoup moins que les moDC (Extended Data Fig. 1e). Ces résultats indiquent que l'IL4 induit un programme d'immunité entraînée qui intègre des caractéristiques connues des fonctions immunologiques classiques de l'IL4.

Les mécanismes de signalisation de l'IL4 sont bien décrits : l'axe IRS-2–PI3K–mTOR (substrat du récepteur de l'insuline 2-phosphoinositide 3-kinases-cible mammifère de la rapamycine) et la voie de signalisation du transducteur de signal et de l'activateur de la transcription 6 (STAT6)19 (Fig. .2a). Nous avons effectué des expériences d'inhibition pharmacologique pour étudier le rôle de ces voies à la fois pour l'inhibition de l'inflammation aiguë et l'induction de l'immunité entraînée par IL4. L'inhibition de PI3K ou de mTOR (à l'aide de wortmannine ou de torine-1, respectivement) n'a pas abrogé l'effet de l'IL4 sur l'inflammation aiguë, mais a diminué les réponses immunitaires entraînées (Fig. 2b, c et Extended Data Fig. 2a). La formation d'IL4, mesurée par une augmentation de la production de TNF et d'IL6, était significativement émoussée en présence de torine-1 (Fig. 2c et Extended Data Fig. 2b). En revanche, l'inhibiteur de STAT6 AS1517499 a partiellement restauré la production de cytokines dans les réponses inflammatoires aiguës, mais n'a pas affecté l'induction de l'immunité entraînée par l'IL4 (Fig. 2b, c). Ainsi, chacune des voies de signalisation induites en aval de l'engagement de l'IL4 avec ses récepteurs a des fonctions distinctes : l'IL4 exerce sa fonction anti-inflammatoire aiguë connue via STAT6 mais induit simultanément une immunité entraînée via PI3K – mTOR, un effet pro-inflammatoire jusqu'alors inconnu.

a, Aperçu schématique des principales voies de signalisation IL4 précédemment décrites19. Généré avec Biorender. b, niveaux de TNF et d'IL6 après 24 h de stimulation des monocytes tout en bloquant les principales voies de signalisation de l'IL4. c, niveaux de TNF et d'IL6 après restimulation des cellules entraînées avec l'IL4 tout en bloquant les principales voies de signalisation de l'IL4. d, Carte thermique du transcriptome des cellules formées à l'IL4, avant et après re-stimulation. e, analyse de l'enrichissement du motif TF dans l'immunité entraînée par IL4 (la carte thermique indique les scores z). f, Analyses d'enrichissement des voies du transcriptome de l'immunité entraînée par IL4. g, taux de TNF et d'IL6 après re-stimulation des cellules entraînées avec l'IL4 en présence d'un inhibiteur de la méthyltransférase SET7. CPH, cyproheptadine. h, analyse ChIP-qPCR AUC du TNF dans les cellules formées à l'IL4. Les données dans les graphiques à barres sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type

Pour mieux comprendre le programme moléculaire induit par la formation d'IL4, nous avons effectué une analyse transcriptomique sur des macrophages naïfs et formés à l'IL4, à la fois avant et après la restimulation du LPS au jour 6. Macrophages formés à l'IL4, alors que 249 gènes étaient atténués (Fig. 2d). Parmi les gènes les plus régulés à la hausse se trouvaient des cytokines pro-inflammatoires telles que IL6 et IL12B, connues pour être impliquées dans l'immunité entraînée10. Parmi les principaux gènes atténués figuraient CCL19 et SOCS2, qui sont importants pour le trafic des lymphocytes et la suppression de la signalisation des cytokines, respectivement20,21.

Nous avons ensuite effectué une analyse d'enrichissement du motif du facteur de transcription (TF) (Fig. 2e) et des analyses d'ontologie et d'enrichissement des voies géniques (Fig. 2f) pour mieux comprendre les profils du transcriptome. Les promoteurs de gènes régulés positivement dans les macrophages formés à l'IL4 étaient hautement enrichis pour les motifs reconnus par les TF tels que l'activation du facteur de transcription (ATF) 2 / ATF7, le récepteur alpha activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPARα) et STAT5, tandis que les motifs du facteur régulateur de l'interféron (IRF) étaient particulièrement épuisé. Ce schéma était principalement inversé pour les gènes non affectés et atténués, à l'exception de la TATA-box, du facteur nucléaire kappa-amplificateur de la chaîne légère des cellules B activées (NFκB)-p65, NFκB-p65-Rel et de l'antigène 2 lié à fos : ces motifs étaient fortement enrichis en promoteurs de gènes atténués, mais diminués en gènes non affectés et régulés positivement (Fig. 2e). L'ontologie des gènes (processus biologique (BP) et fonction moléculaire (MF)) et l'enrichissement des voies de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto ont montré que des activités immunologiques étaient présentes dans les deux régulées positivement (par exemple, BP «réponse à l'organisme», Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes 'signalisation TNF') et des ensembles de gènes atténués (par exemple, BP 'réponse immunitaire', MF 'activité cytokine') (Fig. 2f). Nous avons effectué une analyse transcriptomique similaire sur des monocytes stimulés immédiatement après l'isolement avec IL4, LPS ou IL4 et LPS combinés, ce qui a confirmé une réponse transcriptomique anti-inflammatoire aiguë à IL4 (Extended Data Fig. 2c – e). Ensemble, ces données révèlent des programmes transcriptionnels spécifiques à la fois dans les effets anti-inflammatoires aigus et dans les réponses immunitaires formées à long terme invoquées par IL4.

Nous avons ensuite étudié l'importance et la présence de la reprogrammation épigénétique, en particulier les modifications des histones. L'ajout du médicament anti-allergique cyproheptadine, un su (var) 3-9, activateur du domaine du zeste et du trithorax contenant de la lysine méthyltransférase 7 (SET7) (également connue sous le nom de SET9) inhibiteur de l'histone méthyltransférase, a abrogé l'induction de l'immunité entraînée par IL4 (Fig. 2g). SET7 a été décrit plus tôt comme un médiateur épigénétique important de l'immunité entraînée22. En outre, nous avons évalué la répression médiée par l'histone-3-lysine-9-tri-méthylation (H3K9me3) du TNF à l'aide d'analyses d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)–PCR quantitative (qPCR) dans l'immunité entraînée induite par l'IL4. L'analyse de l'aire sous la courbe (AUC) de six paires d'amorces a montré une diminution de H3K9me3 dans l'immunité entraînée induite par l'IL4, bien que cela n'ait pas atteint une signification statistique (Fig. 2h et Extended Data Fig. 2f). Ensemble, ces données indiquent que la reprogrammation épigénétique est cruciale et caractéristique de l'immunité entraînée induite par l'IL4.

Malgré sa capacité à inhiber l'inflammation aiguë tout en induisant simultanément une immunité entraînée, la traduction clinique de l'IL4 recombinante est entravée par ses propriétés pharmacocinétiques défavorables. Pour surmonter cette limitation, nous avons développé une protéine de fusion à base d'apoA1 qui s'intègre facilement dans les nanoparticules lipidiques pour produire des nanoparticules contenant de l'IL4 (IL4-aNPs). Les nanoparticules à base d'ApoA1 (aNP) s'accumulent de manière inhérente dans les organes hématopoïétiques et ciblent efficacement les cellules myéloïdes et leurs progéniteurs16,23 (Fig. 3a). Plus précisément, nous avons conçu une protéine de fusion composée d'apoA1 humaine et d'IL4 humaine (apoA1-IL4) connectées via un lieur flexible et flanquées de deux étiquettes de purification, une étiquette 6his située à l'extrémité N-terminale et une étiquette streptocoque à l'extrémité C-terminale ( figure 3b). Nous avons utilisé des techniques de caractérisation moléculaire pour confirmer la nature et la pureté de l'apoA1-IL4. En effectuant une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) sur chaque échantillon de protéine purifiée, nous avons confirmé la présence de protéines de poids moléculaires de 25 kDa (apoA1), 18 kDa (IL4) et 37 kDa (apoA1-IL4) ( Fig. 3c), tandis que les Western blots ont indiqué la présence d'apoA1 et d'IL4 (Fig. 3d). En raison de sa nature amphiphile, l'apoA1 et ses dérivés fonctionnent plus rapidement lors de l'électrophorèse sur gel par rapport aux protéines de taille similaire. Ces observations ont été corroborées par la spectrométrie de masse quadripolaire à temps de vol (Q-ToF) montrant un seul pic de masse à 47 576, 03 Da correspondant à un poids moléculaire de 47 582, 57 Da pour apoA1 – IL4 (Fig. 3e).

a, Aperçu schématique de la technologie des protéines de fusion à base d'apoA1. b, Schéma de la structure de la protéine de fusion apoA1 – IL4. c, d SDS – PAGE ( c ) et western blot ( d ) de protéines exprimées par recombinaison. Anticorps spécifiques de l'IL4 endogène et de l'apoA1. e, Chromatogramme et spectre Q-ToF-MS d'apoA1 – IL4. f, Cinétique de la liaison de l'apoA1 – IL4 à l'IL4Rα à l'aide de SPR. g, Activation des cellules HEK-Blue exprimant IL4Rα et IL13Rα1 par apoA1–IL4. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type DMPC, 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine ; GGS, glycine-glycine-sérine ; RU, unités de résonance.

Avant d'intégrer l'apoA1-IL4 dans les nanoparticules lipidiques, des analyses biophysiques et cellulaires - utilisant la résonance plasmonique de surface (SPR) et des cellules rapporteurs HEK-Blue IL4/IL13 (HEK-IL4) - ont été effectuées pour déterminer la préservation de l'activité biologique après l'extraction, la purification et processus de repliage. Nous avons déterminé que les constantes de dissociation à l'équilibre KD de l'apoA1 – IL4 contre le récepteur alpha de l'IL4 humain (IL4Rα) en utilisant SPR étaient de 4, 5 ± 1, 1 nM (Fig. 3f). Les cellules HEK-IL4 possèdent un gène rapporteur inductible par IL4Rα / STAT6 codant pour la phosphatase alcaline sécrétée (SEAP), qu'elles ont produit en évidence lors de l'introduction d'apoA1 – IL4 dans leurs puits de culture. Cela indique l'activité biologique de l'apoA1 – IL4 (Fig. 3g). Bien que la fusion avec l'apoA1 ait considérablement modifié les propriétés biophysiques de l'IL4, permettant son intégration dans les nanoparticules lipidiques, la liaison à son récepteur a été préservée avec un KD de 0, 28 ± 0, 1 nM (Extended Data Fig. 3a). Pour résumer, nous avons développé une protéine de fusion apoA1–IL4 qui préserve les activités biologiques de l'IL4 après extraction, purification et repliement et contient les caractéristiques physicochimiques souhaitables pour son intégration dans les nanoparticules lipidiques via apoA1.

Pour améliorer les propriétés pharmacocinétiques de l'IL4 et sa biodisponibilité pour les cellules myéloïdes, nous avons intégré la protéine de fusion apoA1-IL4 dans des nanoparticules lipidiques pour produire IL4-aNPs16. Des nanoparticules de différentes tailles et morphologies ont été obtenues en faisant varier les compositions des formulations (Fig. 4a). La formation de nanoparticules discoïdes et sphériques a été confirmée par microscopie électronique à transmission cryogénique (cryo-TEM) (Fig. 4b). De plus, nous avons analysé la taille et la stabilité des nanoparticules dans du PBS pendant 14 jours à l'aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS) (Fig. 4c, d). Les IL4-aNP restent stables pendant 14 jours et ont une taille et une stabilité similaires à celles de nos aNP conventionnels rapportés précédemment (Extended Data Fig. 4a, b).

a,b, Représentation schématique (a) et images cryo-TEM (b) des IL4-aNP discoïdes (panneau supérieur) et sphériques (panneau inférieur). c, d, distribution de la taille de l'IL4-aNP (c) et stabilité (d) de l'IL4-aNP dans le temps, comme déterminé par DLS. La taille de l'IL4-aNP est indiquée comme la moyenne numérique. e, Images de microscopie à fluorescence à super-résolution (dSTORM) de monocytes humains incubés avec apoA1(-IL4) ou (IL4-)aNPs marqués par fluorescence (rouge) et colorés avec un anticorps anti-IL4Rα (vert). La co-localisation entre les protéines et IL4Rα peut être appréciée en jaune. Les retours sur investissement blancs sont agrandis dans les images suivantes à droite. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sd

Ensuite, nous avons étudié l'interaction des IL4-aNPs avec les monocytes humains primaires. L'analyse par microscopie de reconstruction optique stochastique directe (dSTORM) a révélé l'expression d'IL4Rα (vert) sur la membrane. De plus, la liaison de l'apoA1 nue, de l'apoA1-IL4 nue, des aNP et de l'IL4-aNP (rouge) a été confirmée par le rebord recouvrant la surface cellulaire. En nous concentrant sur une section agrandie de la membrane, nous avons constaté que les apoA1-IL4 et IL4-aNPs nus étaient associés à l'IL4Rα, formant des co-clusters enrichis à la surface de la cellule, ce que nous n'avons pas observé pour l'apoA1 nue et les aNPs conventionnels. (Fig. 4e). Ensemble, les tests de stabilité de taille DLS, les analyses cryo-TEM et dSTORM ont révélé que l'intégration de la protéine de fusion apoA1 – IL4 dans les nanoparticules lipidiques donne des IL4-aNP biologiquement fonctionnels.

Pour étudier la pharmacocinétique et la biodistribution chez les souris C57BL/6, nous avons radiomarqué le composant protéique de quatre agents thérapeutiques IL4 différents, à savoir l'IL4 nue, la protéine de fusion apoA1-IL4 nue et les IL4-aNP discoïdes et sphériques, avec du zirconium-89 (89Zr). Notez que ces expériences ont été réalisées avec la variante humaine de l'IL4 qui ne montre pas d'activité biologique chez la souris. L'imagerie TEP avec tomodensitométrie (PET-CT) 24 h après l'administration intraveineuse a montré que 89Zr-IL4 et 89Zr-apoA1–IL4 s'accumulaient principalement dans les reins et le foie. En revanche, en plus de s'accumuler dans le foie et les reins, les 89Zr-IL4-aNP se sont accumulés en quantités relativement plus élevées dans les organes riches en cellules immunitaires, y compris la rate et la moelle osseuse (Fig. 5a). Nous avons effectué un comptage gamma ex vivo pour déterminer les demi-vies sanguines et l'absorption des nanomatériaux dans les principaux organes (Fig. 5b, c), ce que nous avons corroboré par autoradiographie (Extended Data Fig. 5a). La comparaison des taux d'absorption par les organes cibles (moelle osseuse + rate) divisés par les organes de clairance (rein + foie) a montré une augmentation significative du taux d'absorption pour les formulations IL4-aNP par rapport à la protéine de fusion non formulée et à l'IL4 nue (données étendues Fig. 5c). Ensuite, nous avons utilisé la cytométrie en flux pour mesurer la biodistribution spécifique au type de cellule dans les organes cibles. Les IL4-aNP discoïdes marqués au perchlorate de 3,3′-dioctadécyloxacarbocyanine (DiO) s'accumulent dans les cellules myéloïdes, notamment les monocytes et les neutrophiles, à la fois dans la rate et la moelle osseuse, alors qu'ils n'interagissent pas (ou seulement de manière marginale) avec les lymphocytes (Fig. 5d ). Sur la base de son absorption favorable (et spécifique de la myéloïde) dans les organes hématopoïétiques, nous avons sélectionné la formulation discoïde d'IL4-aNP pour des études ultérieures chez des primates non humains et des modèles translationnels d'inflammation et de septicémie.

a, rendu PET-CT 24h après injection de constructions marquées au 89Zr. b, demi-vie sanguine de la construction marquée au 89Zr (n = 5, telle qu'équipée d'une fonction de décroissance à deux phases). DI, dose injectée. c, Comptage gamma ex vivo des tissus 24 h après l'injection de la construction marquée au 89Zr (n = 5), le nombre représente le rapport entre la cible et les organes de clairance. d, biodistribution spécifique au type cellulaire des IL4-aNP discoïdes marqués par DiO dans la rate et la moelle osseuse, telle que mesurée par cytométrie en flux. e, demi-vie sanguine de 89Zr-IL4-aNP chez des primates non humains. f, SUV moyen des organes au fil du temps chez les primates non humains ayant reçu une injection de 89Zr-IL4-aNPs (n = 2). g, SUV spécifique à l'organe moyen 48 h après l'injection de 89Zr-IL4-aNPs chez les primates non humains (n ​​= 2). h, TEP-IRM d'un primate non humain 48 h après l'injection de 89Zr-IL4-aNPs. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type, le cas échéant. DIO, perchlorate de 3,3′-dioctadécyloxacarbocyanine; MFI, intensité moyenne de fluorescence ; NHP, primate non humain.

Pour évaluer la traduisibilité clinique des immunothérapies IL4-aNP, nous avons déterminé leur biodistribution et leur profil d'innocuité chez les primates non humains. Deux primates non humains ont reçu une injection intraveineuse de 89Zr-IL4-aNP. Leur comportement in vivo a été étudié à l'aide d'une PET tridimensionnelle entièrement intégrée combinée à l'imagerie par résonance magnétique (PET-MRI). Après injection, la TEP-IRM dynamique (données étendues Fig. 5d) a montré une accumulation rapide d'IL4-aNP dans le foie, les reins (données étendues Fig. 5e), la rate et la moelle osseuse (Fig. 5e – h). Conformément aux données sur la souris, aucune absorption indésirable d'IL4-aNP n'a été observée dans les organes non cibles, y compris le cerveau et le cœur (données étendues, Fig. 5b). Ensemble, ces résultats montrent que le profil favorable de biodistribution et d'innocuité de l'IL4-aNP est conservé d'une espèce à l'autre, corroborant le potentiel translationnel de cette immunothérapie.

Après avoir établi que l'IL4 naturelle atténue simultanément les réponses inflammatoires aiguës et induit un programme d'immunité entraînée, nous avons évalué les effets des effets de l'IL4-aNP sur les monocytes in vitro (Fig. 6a). Nous avons basé la dose pour les expériences in vitro sur l'efficacité de l'induction de phospho-STAT6 dans les monocytes humains primaires, par rapport à l'IL4 nue (Extended Data Fig. 6a). En effet, les IL4-aNP (équivalent molaire de 200 ng ml-1 d'IL4 nue) ont significativement réduit la production de TNF et d'IL6 de monocytes stimulés par le LPS (Fig. 6b), tout en améliorant la réactivité à long terme des monocytes au jour 6 (Fig. 6c) . Ces données indiquent que les IL4-aNP, de la même manière que l'IL4, suppriment l'inflammation aiguë et induisent une immunité entraînée in vitro. Bien que les données de biodistribution in vivo montrent que les IL4-aNP ciblent spécifiquement les cellules myéloïdes (Fig. 5d), l'immunité entraînée induite par l'IL4 modifie l'expression des marqueurs de surface des macrophages, qui sont des cellules présentatrices d'antigène (Extended Data Fig. 1d, e). Cela pourrait à son tour affecter les signaux de polarisation lors de l'activation des lymphocytes T. Pour étudier ces effets indirects potentiels de l'IL4-aNP sur les cellules T, des cellules T naïves allogéniques ont été cultivées en présence de macrophages formés à l'IL4. Dans ce modèle, l'inadéquation de l'antigène leucocytaire humain provoque l'activation et la polarisation des lymphocytes T non spécifiques de l'antigène. Aucune différence significative dans l'abondance des sous-types de lymphocytes T, Th1 (CD4+ IFNγhigh), Th2 (CD4+ IL4+), les cellules Treg (CD4+ IL10+), Th17 (CD4+ IL17+) et les lymphocytes T cytotoxiques (CD8+ Granzyme B+ Perforin+) n'a été observée entre les macrophages entraînés et contrôles (Extended Data Fig. 6d). Ensemble, ces résultats indiquent que la formation d'IL4 ne montre pas la capacité de fausser indirectement les réponses des lymphocytes T, suggérant un effet principalement myéloïde.

a, Aperçu schématique des expériences d'inflammation directe et d'immunité entraînée in vitro. b. Taux de TNF et d'IL6 après 24 h de stimulation des monocytes en présence d'IL4-aNPs. c, niveaux de TNF et d'IL6 après restimulation des cellules formées à l'IL4(-aNP). d, Vue d'ensemble schématique du modèle de tolérance murin in vivo, y compris l'IL4-nanothérapie. e, taux sériques de TNF et d'IL6 après une nouvelle provocation au LPS de souris traitées avec des IL4m-aNP. Le test U de Mann-Whitney a été utilisé pour les comparaisons statistiques. f, vue d'ensemble schématique du modèle d'endotoxémie expérimentale humaine, y compris l'inversion de la tolérance ex vivo. g, taux de TNF et d'IL6 après restimulation ex vivo de cellules humaines in vivo tolérisées par le LPS. h, le TNF et l'IL6 augmentent après restimulation ex vivo de cellules humaines in vivo tolérisées par le LPS. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sd

Les patients atteints de septicémie peuvent éprouver à la fois des réponses hyper-inflammatoires et une immunoparalysie, créant un paradoxe thérapeutique. L'induction d'une immunité entraînée peut théoriquement être utilisée pour inverser la tolérance immunitaire, mais cela n'a pas été traduit dans des modèles in vivo11. L'une des raisons est que l'IL4 humaine ne présente pas d'activité biologique chez la souris. Nous avons donc conçu et produit une protéine de fusion chimère, constituée d'apoA1 humaine et d'IL4 murine pour une formulation avec des lipides afin d'obtenir des IL4m-aNPs. Ici, nous avons étudié si les IL4m-aNP peuvent inverser la tolérance induite par le LPS chez la souris. À cette fin, nous avons injecté par voie intrapéritonéale à des souris C57B/6 du LPS (0,1 mg kg-1) pour induire une immunoparalysie ou du PBS (comme témoin). Nous avons administré par voie intraveineuse des IL4m-aNPs (200 µg par dose) 24 h et 48 h après le traitement au LPS. Nous avons re-défié les souris avec une autre injection intrapéritonéale de LPS (0, 1 mg kg -1) 72 h après la première provocation (Fig. 6d). Malgré les contraintes de taille d'effet, le traitement avec IL4m-aNPs a amélioré les réponses immunitaires innées, comme en témoigne l'augmentation statistiquement significative (P = 0, 0079) des concentrations sériques d'IL6 après une nouvelle provocation au LPS de souris tolérisées (Fig. 6e). Alors que les concentrations de TNF chez certaines souris étaient également clairement élevées, la signification statistique n'a pas été atteinte (P = 0, 1508) en raison de l'hétérogénéité de la réponse thérapeutique (Fig. 6e). Ensemble, nos données in vitro et in vivo montrent que les immunothérapies IL4-aNP peuvent réduire la tolérance.

Après avoir observé une inversion de la tolérance dans le modèle murin, nous avons étayé ces résultats avec un modèle qui imite plus étroitement l'immunoparalysie clinique humaine. Nous avons obtenu du sang d'individus en bonne santé subissant une endotoxémie humaine expérimentale, un modèle contrôlé standardisé d'inflammation systémique capturant les caractéristiques des phénotypes hyper-inflammatoires et immunoparalytiques de la septicémie (Fig. 6f). Dans ce modèle humain contrôlé, le LPS est administré par voie intraveineuse à des volontaires sains, entraînant une réponse inflammatoire systémique suivie d'une tolérisation des monocytes circulants, phénomène également observé dans l'immunoparalysie induite par le sepsis. Le sang a été prélevé avant et 4 h après le début de l'administration de LPS. Les monocytes isolés après l'administration de LPS ont montré une production de cytokines déficiente lors d'une réexposition immédiate au LPS, indiquant une tolérance (Extended Data Fig. 6b). Lorsque les monocytes tolérants des volontaires confrontés au LPS ont été exposés ex vivo à l'IL4 ou à l'IL4-aNP pendant 24 h, ils ont montré une production significativement améliorée de TNF, mais pas d'IL6, lors de la restimulation avec du LPS le jour 3 (Fig. 6g (concentration) et 6h (changement de pli) et données étendues Fig. 6c). En revanche, les monocytes non traités sont restés complètement tolérants. Ensemble, ces données mettent en évidence la capacité de l'IL4 et de l'IL4-aNP à inverser au moins partiellement la tolérance au LPS ex vivo.

L'IL4 est généralement considérée comme une cytokine anti-inflammatoire, mais ses effets à long terme sur la fonction des monocytes et des macrophages ne sont pas clairs15,24,25,26. Nous nous attendions initialement à ce que l'IL4 inhibe l'immunité entraînée, de la même manière que l'IL37 et l'IL38 (réf. 27,28. En plus de ses effets inhibiteurs connus sur l'inflammation aiguë, nous avons observé que l'IL4 induit une immunité entraînée, comme en témoigne la réactivité accrue à la production de cytokines. l'induction de l'immunité entraînée par IL4 était inattendue, nos observations sont conformes à l'activation de la cascade de signalisation mTOR par IL4, un mécanisme central de l'immunité entraînée 10, 29. Nous avons ensuite étudié l'effet à long terme de la pré-exposition à l'IL4 ainsi que la capacité de l'IL4 à inverser la tolérance immunitaire induite par l'endotoxémie expérimentale Dans ce contexte, les résultats montrent qu'un programme cellulaire anti-inflammatoire dépendant de STAT6 domine lors de l'exposition aiguë des cellules à l'IL4 mais que celui-ci évolue avec le temps vers un programme mTOR-drive programme d'immunité entraînée à long terme.L'entraînement IL4 présente des caractéristiques généralement attribuées à l'immunité entraînée, notamment une production accrue de cytokines, un recâblage épigénétique, une activité métabolique accrue et des réponses transcriptomiques altérées lors de la restimulation. Ces observations sont conformes aux preuves croissantes d'un modèle de différenciation des monocytes dépendant de la dynamique et du moment, tel que celui proposé dans la réf. 30.

La capacité de l'IL4 à supprimer simultanément l'inflammation aiguë tout en induisant un programme d'immunité entraîné, dont il a été rapporté qu'il améliore la défense de l'hôte10, peut être potentiellement utilisée pour traiter des infections graves. Par exemple, la septicémie et la maladie à coronavirus 2019 (réf. 31) sont caractérisées par une réponse immunitaire dérégulée, créant un paradoxe thérapeutique qui nécessite à la fois de gérer les réponses hyper-inflammatoires et d'améliorer les réponses de défense de l'hôte contre les infections secondaires (opportunistes). Pour tirer parti de ces caractéristiques de l'IL4, nous avons développé une stratégie d'ingénierie des protéines nanoparticulaires, surmontant ainsi les propriétés pharmacocinétiques in vivo défavorables de cette cytokine. Par conséquent, nous échangeons la puissance IL4 réduite de la protéine de fusion, une caractéristique qui peut être améliorée dans de futures études en optimisant la protéine et le système d'expression comme nous l'avons fait pour la protéine de fusion chimérique, au profit de la biodisponibilité et de la pharmacocinétique considérablement améliorées. Nous montrons que la stratégie aNP modifie favorablement la demi-vie sanguine et le profil de biodistribution de l'IL4, entraînant une accumulation élevée spécifique aux neutrophiles et aux monocytes dans les organes riches en cellules myéloïdes tels que la moelle osseuse et la rate, comme observé précédemment dans les modèles. d'immunité entraînée32. De plus, ces études ont montré que les aNP constitués de 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC), de cholestérol et d'apoA1 n'induisent pas d'immunité entraînée, soulignant que nos résultats sont strictement liés à l'effet biologique de l'IL4 ( réf. 33). Alors que nous avons étudié la biodistribution des aNP contenant l'apoA1-IL4 humaine, nous avons également développé la variante murine IL4m-aNP pour évaluer l'efficacité in vivo. En effet, nous montrons que les IL4m-aNP peuvent inverser partiellement l'immunoparalysie dans un modèle murin de septicémie induite par le LPS. Bien que les données montrent des réponses immunitaires innées restaurées, avec une augmentation substantielle de la production d'IL6 et une nette tendance à l'augmentation des concentrations de TNF dans le sérum des souris traitées avec IL4m-aNP, des études complètes de détermination de la dose sont nécessaires pour étendre le potentiel de la thérapie IL4-aNP dans une gamme de maladies à médiation immunitaire caractérisées par une hyper-inflammation et une immunoparalysie concomitantes. Il est encourageant qu'en utilisant la protéine de fusion humaine, nous ayons montré que les IL4-aNPs peuvent inverser la tolérance immunitaire des cellules acquises à partir d'un modèle humain imitant l'immunoparalysie clinique.

Nous prévoyons que la technologie des cytokines-nanoparticules pourrait trouver des utilisations dans d'autres applications ciblées sur les myéloïdes. L'état d'immunoparalysie n'est pas unique à la septicémie. Des applications immuno-oncologiques pourraient être envisagées, car le cancer se caractérise également par une inflammation locale pro-tumorale et la suppression simultanée des réponses anti-tumorales (souvent médiées par les cellules myéloïdes)34. L'infarctus du myocarde et l'accident vasculaire cérébral sont également caractérisés par une inflammation stérile suivie d'une immunoparalysie35,36, et les patients souffrant de traumatismes graves souffrent d'un état immuno-paralytique similaire37. Dans toutes ces situations, réduire l'inflammation et surmonter l'immunoparalysie peut être bénéfique pour le rétablissement du patient et prévenir les infections secondaires. La technologie IL4-aNP pourrait être développée en une modalité thérapeutique pour le traitement de toutes ces conditions.

Des couches leucocytaires (Sanquin) ou du sang total EDTA de volontaires sains ont été acquis après l'obtention d'un consentement éclairé écrit. Le matériau a été dilué au moins 1:1 avec du PBS sans calcium ni magnésium (Lonza) et appliqué sur du Ficoll-Paque (GE Healthcare). Une centrifugation en gradient de densité pendant 30 min à 615 g a été utilisée pour séparer l'interphase des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC). Après trois à cinq lavages avec du PBS froid, le rendement et la composition des PBMC ont été évalués à l'aide d'un hémoanalyseur (XN-450 ; Sysmex).

Les monocytes sélectionnés négativement ont été obtenus à l'aide de MACS, conformément aux instructions du fabricant (kit d'isolement de monocytes MACS Pan, humain ; Miltenyi Biotec). Le rendement et la pureté des monocytes ont été évalués sur un hémoanalyseur Sysmex.

Pour certaines expériences (indiquées dans le texte), les monocytes ont été alternativement enrichis à partir de PBMC par centrifugation à gradient de densité hyper-osmotique sur Percoll (Sigma-Aldrich). Environ 150 à 200 × 106 PBMC ont été superposés sur une solution de Percoll hyper-osmotique (48,5 % v/v de Percoll, 0,16 M de NaCl, dans de l'eau stérile) et centrifugés pendant 15 min à 580 g, température ambiante (RT). L'interphase a été recueillie, lavée une fois avec du PBS froid et remise en suspension dans du RPMI.

Tous les monocytes et macrophages humains primaires ont été cultivés dans du RPMI-1640 avec des modifications hollandaises (Invitrogen) qui ont été complétées avec du GlutaMAX (2 mM ; GIBCO), du pyruvate de sodium (1 mM ; GIBCO) et de la gentamicine (50 μg ml-1 ; Centrafarm) . Ce milieu est encore appelé RPMI+++. De plus, 10 % (v/v) de sérum humain regroupé ont été ajoutés au milieu pendant la culture cellulaire (également appelé « milieu de culture cellulaire »).

Pour induire une immunité entraînée dans les monocytes humains primaires, une méthode précédemment optimisée et publiée a été utilisée38,39. En bref, les monocytes ont été collés à une plaque de culture cellulaire à fond plat pendant 1 h et lavés avec du PBS chaud pour éliminer toutes les cellules non adhérentes et les débris cellulaires. Ensuite, ils ont été stimulés ("formés") pendant 24 h avec l'un des stimuli détaillés dans le tableau supplémentaire 1, ou avec un milieu uniquement ("contrôle non entraîné").

Pour les expériences d'inhibition pharmacologique, les monocytes ont été pré-incubés pendant 1 h avec l'un des inhibiteurs décrits dans le tableau supplémentaire 2 avant l'ajout du stimulus d'entraînement.

Après la stimulation initiale de 24 h, les cellules ont été lavées avec du PBS chaud et un milieu de culture cellulaire chaud a été ajouté. Les monocytes ont ensuite été autorisés à se reposer et à se différencier en macrophages pendant 5 jours. Au jour 6, l'induction de l'immunité entraînée a été évaluée. À cette fin, les cellules étaient généralement restimulées avec du LPS pendant 24 h supplémentaires pour déclencher la production de cytokines. Les surnageants ont été récupérés et conservés à -20 °C jusqu'à analyse ultérieure.

Pour la plupart des autres méthodes de lecture de l'immunité entraînées, les cellules ont été collectées comme suit : tout d'abord, les cellules ont été incubées dans le réactif de dissociation cellulaire Versene (Life Technologies) pendant 30 minutes dans un incubateur de culture cellulaire. Un grattoir à cellules a ensuite été utilisé pour retirer les cellules des plaques de culture. Pour maximiser le rendement, les plaques de culture ont été grattées une deuxième fois après l'ajout de PBS glacé. Les macrophages ont été centrifugés pendant 10 min à 300 g, 4 ° C et comptés avant de poursuivre les applications en aval.

Pour les expériences dans lesquelles les moDC ont été comparés aux macrophages (témoins non entraînés ou formés à l'IL4), les moDC ont été différenciés comme suit. Tout d'abord, des monocytes sélectionnés négativement ont été obtenus comme décrit ci-dessus. Après une adhérence d'une heure et un lavage au PBS, ils ont été cultivés dans du RPMI+++ avec 10 % de HPS, complétés par de l'IL4 (25 ng ml-1) et du GM-CSF (1 000 UI ml-1 ; qualité supérieure, Miltenyi Biotec). Les cellules ont été différenciées jusqu'au jour 6, avec un rafraîchissement du milieu au jour 3. Au jour 6, les cellules non adhérentes ont été collectées en plus des cellules adhérentes (comme décrit ci-dessus). Les moDCs et les macrophages ont ensuite été soumis à une analyse par cytométrie en flux comme décrit ci-dessous.

Huit volontaires masculins en bonne santé (confirmés par leurs antécédents médicaux, un examen physique et des tests de laboratoire de routine) âgés de 18 à 35 ans ont fourni un consentement éclairé écrit pour participer à des expériences expérimentales sur l'endotoxémie menées à l'unité de recherche du service de soins intensifs du Radboud Centre Médical Universitaire. Toutes les procédures d'étude ont été approuvées par le comité d'éthique local (CMO Arnhem-Nijmegen (Radboudumc), numéros d'enregistrement NL71293.091.19 et 2019-5730) et ont été menées conformément à la dernière version de la déclaration d'Helsinki.

Un schéma de perfusion continue d'endotoxines a été utilisé, comme décrit en détail ailleurs40. En bref, les participants ont été admis dans l'unité de recherche et une veine antécubitale et une artère radiale ont été canulées pour permettre l'administration de fluides et d'endotoxines, ainsi que le prélèvement sanguin et la surveillance hémodynamique, respectivement. Un ECG à 3 dérivations a été enregistré en continu tout au long de l'expérience. Après une pré-hydratation iso-osmolaire (1,5 l de NaCl 0,45 % et glucose 2,5 % administrés par voie intraveineuse dans l'heure précédant le début de la perfusion d'endotoxine), les volontaires ont été provoqués par voie intraveineuse avec une dose de charge de 1 ng kg−1 d'endotoxine de poids corporel (Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) type O113, lot n° 94332B1 ; List Biological Laboratories), directement suivie d'une perfusion continue de 0,5 ng kg-1 h-1 pendant 3 h. Les participants ont été surveillés pendant 8 h après la dose de charge d'endotoxine, après quoi ils ont quitté l'unité de recherche.

Pour ce projet, des échantillons de sang ont été prélevés à deux moments : 1 h avant et 4 h après l'administration de la dose de charge. Les monocytes sélectionnés négativement ont été acquis comme décrit ci-dessus. Les cellules ont été collées et stimulées pendant 24 h avec de l'IL4 humaine recombinante, des IL4-aNP discoïdes, du LPS (pour évaluer la tolérance immunitaire initiale) ou du milieu uniquement (comme témoin). Après un lavage au PBS, les cellules ont été laissées au repos dans un milieu de culture pendant 48 h et restimulées avec du LPS pendant 24 h supplémentaires. Les surnageants ont été récupérés et conservés à -20 °C.

Le TNF, l'IL6 et l'IL1Ra ont été mesurés dans les surnageants de culture cellulaire à l'aide de kits ELISA duoset (R&D Systems), conformément aux instructions du fabricant. Pour les mesures de lactate, un dosage fluorimétrique a été utilisé. Environ 30 µl d'échantillon, de contrôle moyen ou d'étalon connu ont été ajoutés à une plaque noire à 96 puits. Ensuite, 30 µl de mélange réactionnel (PBS pH 7,4, peroxydase de raifort (0,2 U ml−1), lactate oxydase (2 U ml−1), Amplex red (100 µM ; Fisher Scientific)) ont été ajoutés, et le mélange réactionnel a été incubé pendant 20 min dans l'obscurité à TA. Immédiatement après, la fluorescence a été mesurée à 530/25 nm et 590/35 nm. Le logiciel Gen5 (v3.03, BioTek) a été utilisé conjointement avec Microsoft Excel pour calculer les concentrations de cytokines et de lactate dans les échantillons d'origine.

Les macrophages ont été collectés comme décrit ci-dessus et transférés dans une plaque à 96 puits à fond en V pour la coloration. Les cellules ont été centrifugées à 400g pendant 5 min à 4°C. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été lavées une fois avec 200 ul de PBA (PBS pH 7,4, 1 % p/v BSA (Sigma)).

Les récepteurs Fc ont été bloqués par incubation dans du PBS additionné de 10 % de sérum humain regroupé pendant 15 min à 4 °C. Après un nouveau lavage, les marqueurs de surface et la viabilité ont été colorés dans un volume de 50 µl pendant 30 min à 4 °C, en utilisant les anticorps et le colorant de viabilité décrits dans le tableau supplémentaire 3. Après deux lavages, les cellules ont été remises en suspension dans 150 µl PBA et mesuré sur un cytomètre en flux Cytoflex (Beckman Coulter) ou un système BD FACSVerse (BD Biosciences). La compensation a été effectuée à l'aide de billes de compensation VersaComp (Beckman Coulter) pour les taches d'anticorps simples ; un mélange de cellules vivantes et tuées par la chaleur a été utilisé pour les taches uniques du colorant de viabilité (selon les recommandations du fabricant). L'analyse des données a été effectuée dans Flowjo (v10.7.1, BD Biosciences). Notre stratégie de déclenchement était la suivante : premièrement, un portail temporel a été utilisé si nécessaire. Ensuite, les événements à cellule unique ont été sélectionnés à l'aide des portes FSC-A/SSC-A et FSC-A/FSC-H suivantes. Les cellules mortes ont été retirées de l'analyse en sélectionnant la population de colorant négatif pour la viabilité. Les intensités géométriques moyennes de fluorescence ont été calculées en tant que mesure de l'expression du marqueur de surface.

Pour les expériences de réaction lymphocytaire mixte, les macrophages collectés ont été utilisés pour les tests de polarisation des lymphocytes T ultérieurs. Les cellules T naïves allogéniques ont été ensemencées avec des macrophages dans un rapport de 10 cellules T pour chaque macrophage. Les cellules ont été cultivées dans des plaques 96 puits à fond plat pendant 7 jours dans un milieu de culture cellulaire standard. Dans ce modèle, le mésappariement de l'antigène leucocytaire humain provoque une activation non spécifique du récepteur des lymphocytes T. Le dernier jour, les cellules ont été stimulées avec du phorbol 12-myristate 13-acétate (25 ng ml-1) + ionomycine (0,5 µg ml-1) pendant 4 h en présence de 100 ng ml-1 bréfeldine A, une ' bouchon de Golgi'. Les cellules ont été collectées et réparties sur deux panels d'anticorps de cytométrie en flux (un pour les lymphocytes T CD4 et un pour CD8 ; voir également le tableau supplémentaire 3). Les cellules ont été colorées d'une manière similaire à celle décrite ci-dessus, avec une étape supplémentaire de perméabilisation des lymphocytes T pour permettre la coloration des cytokines intracellulaires. Ceci a été réalisé en utilisant le set de tampons fix et perm (eBioscience), selon les instructions du fabricant. La stratégie de déclenchement était similaire à ce qui est décrit ci-dessus, avec l'ajout d'une sélection pour les événements CD3-positifs. Le pourcentage de cellules positives pour les cytokines caractéristiques de la polarisation des lymphocytes T a été calculé pour estimer les proportions du sous-ensemble de lymphocytes T.

Les monocytes ont été stimulés avec du RPMI, de l'IL4 ou différentes concentrations d'IL4-aNP (indiquées dans Extended Data Fig. 6a) pendant 20 min à 37 ° C. Les cellules ont été transférées dans une plaque à 96 puits à fond en V et conservées sur de la glace pendant la durée de la procédure de coloration. Après coloration pour la viabilité et CD14 (de la manière décrite ci-dessus), les cellules ont été fixées et perméabilisées à l'aide de l'ensemble de tampons fix et perm (eBioscience) pendant 45 min à 4 ° C dans l'obscurité. Les cellules ont été lavées deux fois avec du tampon perm et incubées pendant une nuit dans du méthanol absolu refroidi au congélateur à -20 ° C. Après deux autres lavages dans un tampon perm, les cellules ont été colorées pour phospho-STAT6 en utilisant l'anticorps décrit dans le tableau supplémentaire 3, pendant 45 min à 4 ° C dans l'obscurité. Les cellules ont été lavées deux fois de plus dans du tampon perm et finalement remises en suspension dans du PBA pour acquisition sur le cytomètre Cytoflex. La stratégie de déclenchement était largement similaire à celle du marqueur de surface des macrophages avec l'ajout d'une sélection pour les événements CD14 positifs.

Les macrophages ont été collectés comme décrit ci-dessus et incubés à 37 ° C pendant 1 h avec C. albicans marqué au FITC (aimablement fourni par M. Jaeger, Radboudumc) à un MOI de 1: 5. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBA glacé et conservées sur de la glace pour arrêter la phagocytose. Les cellules ont été colorées pour CD45 (tableau supplémentaire 3) pendant 30 min dans l'obscurité à 4 ° C. Après deux lavages, du bleu trypan a été ajouté à une concentration finale de 0,01 % pour désactiver le FITC-Candida extracellulaire. Les cellules ont ensuite été acquises sur un cytomètre en flux Cytoflex.

Au cours de l'analyse des données, les événements CD45+ ont d'abord été sélectionnés pour supprimer les événements Candida uniquement. Des cellules individuelles ont ensuite été fermées comme décrit ci-dessus, et le pourcentage de macrophages positifs pour Candida-FITC dans chaque échantillon a été calculé.

Les macrophages ont été collectés comme décrit ci-dessus. Les cellules ont été remises en suspension dans du RPMI+++ et ensemencées dans des cartouches calibrées pendant la nuit à 105 cellules par puits. Après avoir adhéré pendant 1 h, le milieu a été remplacé par un milieu de dosage (Agilent ; voir ci-dessous) et les cellules ont été incubées pendant 1 h à 37 °C dans des niveaux de CO2 ambiants. Les taux de consommation d'oxygène et les taux d'acidification extracellulaire ont été mesurés en tant qu'indicateurs du métabolisme glycolytique et mitochondrial, à l'aide d'un kit Seahorse XF Glycolysis Stress Test ou d'un kit Seahorse XF Cell Mito Stress Test (tous deux Agilent ; mesures effectuées conformément aux instructions du fabricant).

Les monocytes ou macrophages ont été lysés dans du tampon RLT (Qiagen) et conservés à -80 °C. Les extractions d'ARN ont été réalisées à l'aide de mini-colonnes RNeasy (Qiagen) avec un traitement à la DNAse I sur colonne (sans RNase; Qiagen). Un contrôle de qualité préliminaire et des mesures de concentration ont été effectués à l'aide d'un appareil Nanodrop. Des échantillons ont été envoyés au Beijing Genome Institute (BGI Danemark) pour le séquençage de l'ARN à l'aide de la plateforme DNBseq.

Pour déduire les niveaux d'expression génique, les lectures de séquençage d'ARN ont été alignées sur le transcriptome humain hg19 à l'aide de Bowtie (v1.2)41. La quantification des niveaux d'expression génique en tant que RPKM a été réalisée à l'aide de MMSEQ (v1.0.10)42. Les lectures et les transcriptions ont été normalisées à l'aide de DEseq2 et des comparaisons par paires ont été effectuées. Les gènes exprimés de manière différentielle ont été identifiés à l'aide de DEseq2 (v1.34.0) avec un changement de pli> 2 et P <0, 05, avec un RPKM moyen> 1 (réf. 43). Pour identifier les gènes qui ont été régulés positivement ou atténués par la formation d'IL4, les macrophages RPMI-d6 et IL4-d6 ont été comparés aux échantillons RPMI-d6 + LPS et IL4-d6 + LPS, respectivement. Les listes de gènes ont été fusionnées et classées sur la base de IL4-d6+LPS/RPMI-d6+LPS. L'ontologie des gènes et l'analyse des motifs TF ont été réalisées sur des promoteurs de gènes à l'aide de l'outil HOMER findMotifs (v4.11)44.

Les macrophages ont été collectés comme décrit ci-dessus et remis en suspension dans du RPMI+++. Les cellules ont été fixées pendant 10 min dans du formaldéhyde sans méthanol à 1 %. La réaction a ensuite été désactivée pendant 3 min en ajoutant 125 mM de glycine. Les cellules fixées ont été lavées trois fois avec du PBS glacé, lysées à environ 15 × 106 cellules par ml dans du tampon de lyse (20 mM HEPES pH 7,6, 1 % SDS, 1 × cocktail inhibiteur de protéase (Roche)), soniquées (Bioruptor Pico , Diagenode) et centrifugé (10 min, 16 060 g, à TA).

Des aliquotes de chromatine ont été dé-réticulées dans un tampon TBE 0,5 × (supplémenté avec 0,5 mg ml-1 protéinase K (Qiagen)) pendant 1 h à 65 ° C et exécutés sur un gel d'agarose à 1% pour confirmer la taille du fragment cible de 200 à 800 pb.

La chromatine restante a été divisée en puce et échantillons d'entrée. Les échantillons de puce ont été dilués 10 fois dans un tampon de dilution (16,7 mM Tris pH 8,0, 1,0 % Triton, 1,2 mM EDTA, 167 mM NaCl, 1 × cocktail d'inhibiteurs de protéase dans Milli-Q) et 1 µg d'anticorps de qualité ChIP (Diagenode) était ajouté. Les échantillons ont été mis en rotation pendant une nuit à 4°C.

Les billes magnétiques de protéine A/G (Dynabeads) ont été lavées deux fois dans un tampon de dilution additionné de 0,15 % de SDS et de 0,1 % de BSA. Les billes lavées ont été ajoutées aux échantillons de puce et mises en rotation à 4 ° C pendant 1 h. La chromatine liée aux billes a ensuite été lavée (rotation pendant 5 min, 4 ° C) comme suit : une fois avec un tampon de lavage à faible teneur en sel (20 mM Tris pH 8,0, 1,0 % Triton, 0,1 % SDS, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl dans Milli-Q), deux fois avec un tampon de lavage à haute teneur en sel (identique au tampon de lavage à faible teneur en sel mais avec 500 mM de NaCl) et deux fois avec un tampon de lavage sans sel (20 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, dans Milli -Q). La chromatine a été éluée des billes dans un tampon d'élution (0,1 M NaHCO3, 1 % SDS, dans Milli-Q) pendant 20 min, à température ambiante. Les échantillons d'entrée ont été dilués 12 fois dans un tampon d'élution. Après addition de NaCl (0, 2 M) et de protéinase K (0, 1 mg ml-1), tous les échantillons ont été déréticulés pendant au moins 4 h sur un bloc chauffant secouant (65 ° C, 1 000 tr / min). Des colonnes de purification PCR MinElute (Qiagen) ont été utilisées pour purifier les fragments d'ADN. Les fragments d'ADN ont été stockés à 4 ° C jusqu'à l'analyse en aval par qPCR.

L'analyse qPCR pour les échantillons et les entrées de puce a été effectuée comme suit. La méthode verte SYBR a été utilisée pour effectuer la qPCR avec les amorces détaillées dans le tableau supplémentaire 4. Une méthode Ct comparative a été utilisée pour comparer la puce aux échantillons d'entrée et calculer l'abondance relative sur une région de contrôle négatif. GAPDH et la région non traduite de ZNF ont été respectivement utilisés comme contrôles négatifs et positifs pour H3K9me3. Le TNF a été interrogé en utilisant six paires d'amorces pour l'analyse AUC comme décrit précédemment45.

ClearColi BL21 (DE3) (Lucigen) ont été transformés avec un vecteur d'expression pET20b(+)apoA1–IL4. Les bactéries transformées ont été inoculées dans 40 ml de bouillon de lysogénie (Sigma-Aldrich) additionné de 100 μg l-1 d'ampicilline et cultivées pendant une nuit à 37 °C. Par la suite, la culture d'une nuit a été inoculée dans du milieu 2YT (16 g l-1 de peptone, 10 g l-1 d'extrait de levure et 10 g l-1 de NaCl) additionné de 100 µg l-1 d'ampicilline et cultivée à 37 °C. Au moment où l'absorbance à 600 nm atteignait> 1, 5, 1, 0 mM d'isopropyl β-d-thiogalacopyranoside a été ajouté pour induire l'expression de pET20b (+) apoA1 – IL4, et les cellules ont été incubées pendant une nuit à 20 ° C. Les cellules ont été recueillies par centrifugation avant la préparation des lysats et la purification.

La protéine de fusion ApoA1 – IL4 exprimant des cellules ClearColi a été collectée par centrifugation à 10 880 g et 4 ° C pendant 10 min. Les cellules collectées ont été remises en suspension dans du PBS et centrifugées à 3 500 g et 4 ° C pendant 15 min. Les cellules ont été lysées en utilisant 20 ml de réactif d'extraction de protéine BugBuster (Merck) et 20 pl de benzonase nucléase (Merck) par litre de culture sur un agitateur pendant 30 min à température ambiante. Les lysats cellulaires ont été centrifugés à 39 000 g et 4 ° C pendant 30 min. Les culots insolubles ont été lavés avec 10 ml de BugBuster par litre et centrifugés à 39 000 g et 4 ° C pendant 20 min. Le culot contenant les corps d'inclusion a été remis en suspension dans un tampon d'extraction (chlorhydrate de guanidine 6 M, phosphate de potassium 50 mM et glutathion réduit 1 mM) et incubé sur un agitateur pendant 15 min à température ambiante. La suspension a été centrifugée à 39 000 g et 4 °C pendant 30 min pour éliminer la fraction insoluble. La fraction soluble filtrée a été chargée sur une colonne de nickel et lavée avec 15 volumes de colonne de tampon de lavage IMAC. ApoA1–IL4 a été déplié et replié sur la colonne de nickel en utilisant un tampon de dépliage à gradient linéaire 60 ml (urée 7 M, glutathion réduit 1 mM, glutathion oxydé 0,1 mM, phosphate de potassium 50 mM et NaCl 100 mM pH 6,8) pour replier le tampon 60 ml (glutathion réduit 1 mM, glutathion oxydé 0,1 mM, phosphate de potassium 50 mM et NaCl 100 mM pH 6,8) à 2,5 ml min-1. L'apoA1-IL4 repliée a été éluée de la colonne avec de l'imidazole 0, 5 M, du Tris 20 mM et du NaCl 0, 5 M à pH 7, 9. L'éluat a été collecté, concentré et purifié davantage et échangé par chromatographie d'exclusion de taille (HiLoad 16/600 Superdex 75 Augmentation ; GE Healthcare) équilibré avec un tampon de stockage PBS. Les fractions ont été analysées par SDS-PAGE, regroupées, concentrées et congelées instantanément dans de l'azote liquide avant d'être stockées à -80 ° C. La masse ApoA1 – IL4 a été confirmée par Q-ToF LC-MS (WatersMassLynx v4.1), en utilisant MagTran V1.03 pour MS.

Les cellules HEK293T ont été co-transfectées avec fuGENE (Promega) comprenant le vecteur de transfert pHR-apoA1 – IL4m, l'emballage de pCMVR8.74 et l'enveloppe de pMD2.G dans Opti-MEM (GIBCO) à 37 ° C pendant 24 h. Les cellules ont été lavées avec du DMEM additionné de FBS inactivé à la chaleur à 2 % et incubées pendant 48 h. Pour obtenir le lentivirus contenant pHR-apoA1 – IL4m, le surnageant a été centrifugé à 875 g pour éliminer les débris cellulaires filtrés à travers un filtre seringue PES de 0, 45 µm et centrifugé à 50 000 g pendant 2 h à 4 ° C. Le culot contenant le lentivirus pHR-apoA1 – IL4m a été remis en suspension dans un milieu de culture, congelé instantanément dans de l'azote liquide et trié à -80 ° C. Les cellules HEK293F ont été transduites avec pHR-apoA1 – IL4m contenant des lentivirus dans un milieu de transfection (DMEM, 10 % HI FBS, 1 x polybrène (Sigma-Aldrich) pendant 24 h. Par la suite, les cellules ont été cultivées dans un milieu d'expression (50 % EX-CELL 293 Milieu sans sérum pour cellules HEK293 (Merck) et 50 % de milieu d'expression FreeStyle 293 (Thermo Fisher Scientific), additionné de Glutamax, 1 % de Pen-Strep et 1 µg ml−1 de doxycycline (Merck) sur un agitateur à 150 tr/min pendant 3 jours à 37 ° C. Le surnageant de culture contenant apoA1 – IL4m a été centrifugé à 3 500 g, 4 ° C pendant 15 min et filtré à travers un filtre seringue PES de 0,22 µm pour éliminer les débris cellulaires. La fraction soluble filtrée a été chargée sur une colonne StrepTactin XT 4flow de 5 ml (Cytiva) et lavé avec 5 volumes de colonne de tampon W (NaCl 150 mM, Tris 100 mM, EDTA 1 mM pH 8) avec un débit de 1 à 2 ml min - 1. ApoA1 – IL4m a été éluée de la colonne avec du tampon W additionné de biotine 50 mM. L'éluat a été collecté, concentré et congelé dans de l'azote liquide avant d'être stocké à -80 ° C. La masse d'ApoA1 – IL4m a été confirmée par Q-ToF LC-MS (WatersMassLynx v4.1), à l'aide de MagTran V1. 03 pour la SEP.

Pour confirmer la fusion d'apoA1 et d'IL4, 100 ng d'IL4 (BioLegend), d'apoA1 et d'apoA1-IL4 ont été chargés sur un gel de polyacrylamide à 4-20 % (Bio-Rad). Après électrophorèse sur gel, les échantillons ont été transférés sur des membranes de nitrocellulose avec un tampon de transfert (tampon 10 x TG, 20 % de méthanol). Par la suite, les membranes ont été incubées avec un tampon de blocage (5 % de lait, 0,1 % de tween dans du PBS (PBST)) pendant une nuit à 4 °C. Les blots ont été incubés avec des anticorps monoclonaux primaires anti-IL4 (HIL41, 1:200; sc-12723, Santa Cruz Biotechnology) et anti-apoA1 (B10, 1:100; sc-376818, Santa Cruz Biotechnology) pendant 1 h à 4 °C. Après incubation avec des anticorps primaires, les membranes ont été lavées et incubées avec un conjugué IgG anti-souris de lapin (H + L) – HRP (1: 5 000, 31457, Pierce). Les anticorps secondaires conjugués à la HRP ont été détectés avec TMB (Thermo Fisher Scientific) et visualisés à l'aide de l'imageur de gel Image Quant (GE Healthcare).

Les mesures SPR ont été effectuées à l'aide d'un système Biacore × 100 SPR (GE Healthcare). La chimère alpha-FC du récepteur humain de l'IL4 (Biolegend) a été immobilisée sur une puce de capteur de protéine G (GE Healthcare). La série de concentrations de dilution Log2 consistait en apoA1–IL4 allant de 200 nM à 6,25 nM et en IL4 humaine allant de 20 nM à 0,65 nM. Tous les échantillons ont été préparés dans du tampon HPS-EP (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,005 % (v/v) P20 pH 7,4). L'association a été suivie pendant 180 s et la dissociation pendant 180 s avec un débit de 30 µl min-1. La puce du capteur a été régénérée avec de la glycine 1,5 (glycine-HCl 10 mM pH 1,5, GE Healthcare). La cinétique a été déterminée en ajustant les données SPR d'interaction pour une liaison 1:1.

Les cellules HEK-Blue IL4/IL13 ont été achetées chez InvivoGen. Cette lignée cellulaire a une voie STAT6 entièrement active et porte un gène rapporteur SEAP inductible par STAT6. Les cellules HEK-Blue IL4/IL13 produisent SEAP en réponse à IL4 et IL13. Les niveaux de SEAP sécrétés peuvent être déterminés avec QUANTI-Blue (InvivoGen). Environ 180 μl de DMEM avec 10% de FBS et 1% de Pen-Strep contenant 5 × 104 cellules ont été ajoutés par puits dans une plaque à 96 puits. Par la suite, 20 μl de stimulus ou de véhicule ont été ajoutés et les cellules ont été incubées pendant 20 à 24 h à 37 ° C. Ensuite, 180 μl de QUANTI-Blue ont été ajoutés par puits dans une plaque à 96 puits séparée (à fond plat) et 20 μl du surnageant cellulaire ont été ajoutés. La plaque a été incubée pendant 1 à 3 h à 37 ° C et l'absorbance à 640 nm a été mesurée sur un lecteur de plaque Tecan Spark pour déterminer les niveaux de SEAP.

Tous les phospholipides ont été achetés chez Avanti Polar Lipids. Quatre ANP différents ont été formulés. Pour les aNP discoïdes issus de solutions mères (10 mg ml-1) dans du chloroforme, DMPC (133,5 μl) et cholestérol (Sigma-Aldrich) (7,5 μl), et pour les aNP sphériques, POPC (66,5 μl), PHPC (17,5 μl), le cholestérol (4,5 μl) et la tricapryline (Sigma-Aldrich) (2,79 μl à partir de 0,956 g ml-1 stock) ont été combinés dans un flacon en verre et séchés sous vide. Le film résultant a été redissous dans un mélange d'acétonitrile et de méthanol (95:5%, 800 μl de volume total). Pour la formulation à base d'apoA1, du cholestérol (15 µl) a été utilisé. Séparément, une solution de protéine apoA1 dans du PBS (6 ml, 0,1 mg ml−1), de protéine apoA1–IL4 dans du PBS (6 ml, 0,17 mg ml−1) ou d'apoA1–IL4m dans du PBS (6 ml, 0,18 mg ml− 1) a été préparé.

Les deux solutions ont été injectées simultanément à l'aide d'une pompe microfluidique fusion 100 (Chemyx) dans un mélangeur à chevrons Zeonor (Microfluidic Chipshop, code produit 10000076) avec un débit de 0,75 ml min-1 pour la solution lipidique et un débit de 6 ml min-1 pour la solution d'apoA1. La solution obtenue a été concentrée par filtration centrifuge en utilisant soit un MWCO de 10 kDa pour discoïde et un MWCO de 100 kDa pour un tube Vivaspin aNPs sphérique à 3 500 g pour obtenir un volume de 1 ml. Du PBS (5 ml) a été ajouté et la solution a été concentrée à 5 ml; cela a été répété deux fois. La solution lavée a été concentrée à environ 1,5 ml et filtrée à travers un filtre seringue PES de 0,22 μm pour obtenir les aNP finis. La concentration de protéines dans les échantillons d'aNP a été quantifiée avec le kit d'analyse de protéines Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific). Pour formuler des aNP fluorescents, 0,5 mg de colorant DiOC18(3) (DiO) (Thermo Fisher Scientific) a été dissous dans la solution de chloroforme utilisée pour préparer le film lipidique.

Les formulations d'aNP obtenues dans du PBS ont été filtrées à travers un filtre seringue PES de 0,22 µm et analysées par DLS sur un analyseur Malvern Zetasizer Nano ZS. Les valeurs sont rapportées sous forme de distribution de taille moyenne en nombre moyen.

IL4, apoA1 – IL4 et IL4-aNPs ont été incubés avec deux excès molaires de DFO-p-NCS (5 mg ml-1 dans du DMSO) pendant 2 h lavés trois fois à l'aide de tubes MWCO Vivaspin de 10 kDa pour éliminer tout DFO-p n'ayant pas réagi -NCS. Pour le radiomarquage, les protéines couplées au DFO et les aNP ont été incubés avec du 89Zr à 37 ° C à l'aide d'un thermomixeur à 600 tr / min pendant 1 h et lavés trois fois à l'aide de tubes MWCO Vivaspin de 10 kDa pour éliminer tout 89Zr n'ayant pas réagi.

Tout d'abord, la surface de grilles de cuivre soutenues par du carbone lacé de 200 mailles (Electron Microscopy Sciences) a été traitée au plasma pendant 40 s à l'aide d'un revêtement de carbone Cressington 208. Par la suite, 3 ml d'échantillon d'IL4-aNPs (~ 1 mg de protéine par ml) ont été appliqués sur une grille et vitrifiés en un film mince par vitrification en plongée dans de l'éthane liquide à l'aide d'un robot automatisé (FEI Vitrobot Mark IV). L'imagerie Cryo-TEM a été réalisée sur le cryoTITAN (Thermo Fisher Scientific), équipé d'un canon à émission de champ, d'un filtre d'imagerie post-colonne Gatan (modèle 2002) et d'une caméra post-GIF 2k × 2k Gatan CCD (modèle 794). les images ont été acquises à une tension d'accélération de 300 kV en mode TEM à fond clair avec un filtrage d'énergie sans perte à 6 500 × (débit de dose de 1,64 électrons A−2 s−1) ou un grossissement de 24 000 × (débit de dose de 11,8 électrons A−2 s−1) et temps d'acquisition de 1 s.

Des monocytes humains ont été isolés du sang périphérique d'un donneur sain comme décrit ci-dessus. Environ 100 000 monocytes ont été ensemencés par puits sur une lamelle à chambre traitée par culture cellulaire (µ-Slide 8 puits, IBID). Après 2 h d'incubation à 37 ° C (attachement cellulaire), les cellules ont été incubées pendant 2 h à 37 ° C avec une variante marquée au Cy5 de l'apoA1 nue ou de l'apoA1 – IL4, des aNP discoïdes ou IL4-aNP et des aNP sphériques ou IL4-aNP. Ensuite, les cellules ont été lavées avec du PBS et fixées avec du PFA à 4% pendant 20 min. Le récepteur de l'IL4 a été coloré avec un anticorps primaire polyclonal de lapin IgG1 anti-IL4R humain (Thermo Fisher Scientific; dilution 1:100) pendant 24 h à 4 ° C, suivi d'un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488 conjugué (Thermo Fischer Scientific ; dilution 1 : 500) pendant 1 h à température ambiante. Les cellules colorées ont été stockées dans du PBS à 4°C. Pour le dSTORM, les cellules ont été immergées dans du tampon d'imagerie GLOXY (40 μg ml-1 catalase, 0,5 mg ml-1 glucose oxydase, 5% glucose et 0,01 M cystéamine dans du PBS, pH 8,0) pendant quelques minutes avant et pendant l'imagerie . L'acquisition a été réalisée en mode de fluorescence à réflexion interne totale, à l'aide d'ONI Nanoimager (ONI). Il est équipé d'un objectif à immersion dans l'huile 100 × / 1,4 NA et d'une caméra sCMOS, et dans cette étude, des lasers de 488 nm (200 mW) et 640 nm (1000 mW) ont été utilisés. Environ 10 000 images ont été acquises avec un temps d'exposition de 10 ms avec un champ de vision de 50 × 80 µm. Les données brutes ont été traitées à l'aide du logiciel ThunderSTORM (v1.3)46,47, produisant des images avec une résolution spatiale de 10 nm.

Des souris femelles C57BL/6 J (âgées d'environ 8 à 11 semaines et pesant environ 20 g) ont été achetées à Charles River en Allemagne. Pour les études sur les primates non humains, deux singes cynomolgus mâles (Macaca fascicularis) ont été utilisés, âgés de 15 ans et 16 ans. Tous les animaux ont été co-hébergés dans des conditions climatiques contrôlées, respectivement, à 20-24 ° C, 45-65% d'humidité avec des cycles lumière-obscurité de 12 h et ont reçu de l'eau à volonté. Les souris ont reçu un régime alimentaire standard et les primates non humains ont reçu le régime Teklad Global 20% Protein Primate Diet. Les soins aux animaux et les procédures expérimentales étaient basés sur des protocoles institutionnels approuvés par l'école de médecine Icahn du mont Sinaï. Toutes les souris ont été assignées au hasard à des groupes expérimentaux.

Des souris C57BL/6 ont reçu une injection intraveineuse de variants d'IL4 marqués au 89Zr, respectivement IL4 (53,6 ± 6,6 μCi), apoA1–IL4 (30,1 ± 0,9 μCi), IL4-aNP discoïdes (146,1 ± 46,5 μCi) et IL4-aNP sphériques ( 108,6 ± 16,9 µCi). Deux primates non humains ont reçu une injection d'IL4-aNP discoïdale marquée au 89Zr (1079 μCi et 682 μCi). À des moments prédéterminés, 1, 2, 5, 10 et 30 min et 1, 2, 4, 8 et 24 h pour les souris et 5, 30 et 90 min et 48 h pour les primates non humains, après l'injection, du sang a été prélevé et pesés et la radioactivité a été mesurée à l'aide d'un compteur gamma automatique Wizard2 2480 (Perkin Elmer). Les données ont été corrigées de la décroissance radioactive et le pourcentage de dose injectée par gramme de sang (% ID par g) a été calculé. Les données ont été ajustées à l'aide d'une régression de décroissance non linéaire à deux phases dans GraphPad Prism, et la demi-vie sanguine pondérée a été calculée via l'équation (% rapide × t1/2 rapide + % lent × t1/2)/100. La biodistribution chez les souris a été déterminée 24 h après l'injection. Après perfusion de PBS, les tissus d'intérêt ont été collectés et pesés, et la radioactivité a été mesurée à l'aide d'un compteur gamma automatique Wizard2 2480 (Perkin Elmer). Les données ont été corrigées pour la désintégration radioactive et le pourcentage de dose injectée par gramme de tissu (%ID par g) a été calculé.

Des souris C57BL/6 ont reçu une injection intraveineuse de variants d'IL4 marqués au 89Zr, respectivement IL4 (53,6 ± 6,6 μCi), apoA1–IL4 (30,1 ± 0,9 μCi), IL4-aNP discoïdes (146,1 ± 46,5 μCi) et IL4-aNP sphériques ( 108,6 ± 16,9 µCi). Après 24 h, les souris ont été anesthésiées à l'aide d'isoflurane à 1,0 % dans de l'O2 à un débit d'environ 1,0 l min−1. Les scans PET-CT ont été acquis à l'aide d'un Mediso nanoScan PET-CT (Mediso). Un scanner corps entier a été exécuté (énergie, 50 kVp ; courant, 180 μAs ; taille de voxel isotrope, 0,25 mm) suivi d'un PET scan de 20 min. La reconstruction a été réalisée avec correction d'atténuation à l'aide de l'algorithme de reconstruction TeraTomo 3D du logiciel Mediso Nucline v3.04.020.0000. Les coïncidences ont été exclues par une fenêtre d'énergie comprise entre 400 keV et 600 keV. La taille du voxel était isotrope avec une largeur de 0,4 mm et la reconstruction a été appliquée pendant quatre itérations complètes, six sous-ensembles par itération.

Les tissus ont été placés dans une cassette de film contre une plaque d'imagerie phosphorescente (BASMS-2325, Fujifilm) à -20 ° C pour déterminer la distribution de la radioactivité. Les plaques ont été lues à une résolution de pixel de 25 mm avec un lecteur de plaques Typhoon 7000IP (GE Healthcare).

Pour la spécificité cellulaire, les souris ont reçu une injection intraveineuse d'IL4-aNP marqués au DiO qui ont été autorisés à circuler pendant 24 h. Par la suite, des souris ont été tuées et des suspensions de cellules individuelles ont été créées à partir de sang, de rate et de moelle osseuse, comme décrit précédemment. Les suspensions cellulaires ont été incubées avec des anti-CD115, anti-CD11b, anti-Ly6C, anti-Ly6G, anti-CD19, anti-CD45, anti-CD11c, anti-CD3 et anti-F4/80. Aqua vivant ou mort a été utilisé comme colorant de viabilité. Les cellules ont ensuite été lavées et remises en suspension dans du tampon FACS. Toutes les données ont été acquises sur un cytomètre en flux Aurora 5 l (Cytek Biosciences). Des DiO-IL4-aNP ont été détectés dans le canal FITC.

Après une nuit de jeûne, les primates non humains ont été anesthésiés avec de la kétamine (5 mg kg-1) et de la dexmédétomidine (0,0075–0,015 mg kg-1). Des primates non humains ont reçu une injection de 1,114 mCi et 0,682 mCi d'IL4-aNP discoïdales marquées au 89Zr, à une dose d'environ 0,1 mg kg-1. L'imagerie TEP dynamique telle qu'elle a été réalisée pendant 60 minutes après la perfusion, et des analyses TEP-IRM statiques supplémentaires ont été réalisées 1 h et 48 h après l'injection. De plus, du sang a été prélevé pendant l'imagerie à 5 min, 30 min et 120 min après l'injection. Les images TEP et IRM ont été acquises à l'aide d'un système TEP-IRM 3T (Biograph mMR, Siemens Healthineers). Commençant en même temps que l'injection d'aNP, une imagerie TEP dynamique a été réalisée en utilisant une position de lit couvrant la poitrine et l'abdomen. Les paramètres d'imagerie RM étaient les suivants : plan d'acquisition, coronal ; temps de répétition, 1 000 ms ; temps d'écho, 79 ms ; nombre de tranches, 144 ; nombre de moyennes, 4 ; résolution spatiale, 0,5 × 0,5 × 1,0 mm3 ; et durée d'acquisition, 42 min et 42 s. Après l'acquisition d'images TEP dynamiques, des images TEP corps entier statiques ont été acquises du crâne au bassin, en utilisant 4 positions de lit consécutives de 15 min chacune. Simultanément avec chaque lit, les images RM ont été acquises comme décrit ci-dessus, à l'exception de l'utilisation de seulement 1,4 moyennes de signal, nombre de tranches 160 et résolution spatiale 0,6 × 0,6 × 1,0 mm3 (durée d'acquisition, 14 min 56 s par lit). Une imagerie TEP et IRM corps entier a également été réalisée 48 h après l'injection, en utilisant 4 positions de lit TEP de 30 min chacune, avec les paramètres IRM suivants : plan d'acquisition, coronal ; temps de répétition, 1 000 ms ; temps d'écho, 79 ms ; nombre de tranches, 224 ; nombre de moyennes, 2 ; résolution spatiale, 0,6 × 0,6 × 1,0 mm3 ; et durée d'acquisition, 29 min et 56 s. Les images IRM du corps entier de chaque lit ont été automatiquement rassemblées par le scanner. Après l'acquisition, les données brutes PET de chaque lit ont été reconstruites et rassemblées hors ligne à l'aide des e7tools propriétaires de Siemens avec un algorithme de maximisation des attentes de sous-ensemble ordonné avec correction de la fonction d'étalement des points pour 3 itérations et 24 sous-ensembles. De plus, un filtre gaussien de 4 mm a été appliqué aux images. Une carte d'atténuation à trois compartiments (tissus mous, poumon et air) a été utilisée pour l'atténuation.

L'analyse des images a été réalisée avec Osirix MD, version 11.0. Les images IRM du corps entier ont été fusionnées avec les images TEP et analysées dans un plan coronal. Les régions d'intérêt (ROI) ont été dessinées sur des tissus d'intérêt, notamment la rate, le foie, les reins, les poumons, le cœur, le cervelet et le cerveau, qui ont été tracés dans leur intégralité, et l'absorption de la moelle osseuse a été déterminée à l'aide de trois vertèbres de la colonne lombaire. Pour chaque retour sur investissement, des valeurs d'absorption standardisées moyennes (SUV) ont été calculées. L'absorption d'IL4-aNP discoïde marquée au 89Zr par organe a été exprimée comme la moyenne de toutes les valeurs moyennes de SUV par organe.

Pour le modèle de tolérance in vivo, des souris C57BL/6 femelles âgées de 11 semaines ont été tolérisées par voie intrapéritonéale avec 0,1 mg kg-1 de LPS de poids corporel. À 24 h et 48 h, les souris ont été traitées par voie intraveineuse avec 200 µg d'IL4m-aNPs ou de PBS. Par la suite, les souris ont été soumises à une nouvelle provocation avec une injection intrapéritonéale de 0, 1 mg kg -1 de LPS à 72 h. Après 90 min, les souris ont été tuées, le sang a été prélevé pour ELISA et des suspensions de cellules individuelles ont été créées à partir de sang, de rate et de moelle osseuse comme décrit précédemment. Pour le protocole de coloration, les échantillons de sang pour ELISA ont été autorisés à coaguler à température ambiante pendant 30 min. Le sérum a été prélevé après centrifugation à 1 000 g pendant 10 min à 4 °C. Des tests ELISA TNF et IL6 de souris (Biolegend) ont été réalisés selon les protocoles du fabricant. Les soins aux animaux et les procédures expérimentales étaient basés sur des protocoles institutionnels approuvés par le comité d'expérimentation animale de Nimègue.

Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sd, sauf indication contraire. Les points de données individuels dans les graphiques sont des répétitions biologiques et non des répétitions techniques. Le nombre de points de données peut être clairement discerné dans chaque figure ou n est indiqué dans la légende de la figure. Sauf indication contraire, les analyses statistiques ont été effectuées dans Graphpad Prism (v9, Graphpad Software). Pour les expériences d'immunité entraînée et de stimulation aiguë avec des monocytes humains primaires (appariés, non paramétriques), des tests de rang signé de Wilcoxon ont été utilisés. Des méthodes statistiques pour l'analyse de séquençage d'ARN sont décrites ci-dessus. Les valeurs P bilatérales inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les principales données à l'appui des résultats de cette étude sont disponibles dans le document et ses informations supplémentaires. Les ensembles de données brutes et analysées générées au cours de l'étude sont disponibles à des fins de recherche auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable. Les données brutes de séquençage de l'ARN sont disponibles auprès du NCBI Gene Expression Omnibus sous le numéro d'accession GSE185433.

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Nous remercions M. Jaeger (Radboudumc) pour avoir aimablement fourni Candida albicans marqué à l'isothiocyanate de fluorescéine. D. Williams (East Tennessee State University) a fourni le β-glucane que nous avons utilisé dans nos expériences initiales. H. Lemmers (Radboudumc) a aimablement préparé le lipopolysaccharide purifié utilisé pour la stimulation des monocytes et macrophages humains primaires. Une partie des figures a été préparée à l'aide (entre autres logiciels) de Biorender.com. BN est soutenu par une bourse de recherche du National Health and Medical Research Council (Australie) (APP1173314). Ce travail a été soutenu par les subventions des National Institutes of Health R01 HL144072, R01 CA220234 et P01 HL131478, ainsi que par une subvention Vici du Dutch Research Council NWO et une subvention avancée de l'ERC (toutes à WJMM). MGN a été soutenu par une subvention Spinoza du Conseil néerlandais de la recherche NWO et une subvention avancée de l'ERC (#833247).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : David P. Schrijver, Rutger J. Röring.

Département de génie biomédical, Université de technologie d'Eindhoven, Eindhoven, Pays-Bas

David P. Schrijver, Jeroen Deckers, Anne de Dreu, Eveline G. Nugraha, Roderick S. Oosterwijk, Ewelina Kluza, Roy van der Meel, Maarten Merkx & Willem JM Mulder

Département de médecine interne et Radboud Center for Infectious Diseases (RCI), Radboud University Medical Center, Nimègue, Pays-Bas

David P. Schrijver, Rutger J. Röring, Jeroen Deckers, Yohana C. Toner, Bram Priem, Yuri van Elsas, Tom Anbergen, Simone JCFM Moorlag, Thijs J. Beldman, Leo AB Joosten, Mihai G. Netea et Willem JM Mulder

Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center, Nimègue, Pays-Bas

Rutger J. Röring, Jeroen Deckers, Tom Anbergen, Anouk MD Becker, Simone JCFM Moorlag, Aron Jansen, Peter Pickkers, Matthijs Kox, Leo AB Joosten & Mihai G. Netea

Institut de génie biomédical et d'imagerie, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, États-Unis

Yohana C. Toner, Geoffrey Prevot, Bram Priem, Jazz Munitz, Yuri van Elsas, Anthony Azzun, Carlos Pérez-Medina, Mandy MT van Leent, Abraham JP Teunissen & Zahi A. Fayad

Département de biochimie médicale, Centres médicaux universitaires d'Amsterdam, Amsterdam, Pays-Bas

Bram Premier

Laboratoire d'angiogenèse, Amsterdam UMC, Cancer Center Amsterdam, Amsterdam, Pays-Bas

Bram Premier

Département de chirurgie, Radboud University Medical Center, Nimègue, Pays-Bas

Laszlo A. Groh

Institut Radboud des sciences de la santé, Centre médical universitaire Radboud, Nimègue, Pays-Bas

Laszlo A. Groh

Département d'immunologie tumorale, RIMLS, Radboud University Medical Center, Nimègue, Pays-Bas

Anouk MD Becker

Centre national de recherche cardiovasculaire (CNIC), Madrid, Espagne

Carlos Perez-Medina

Epigenetics Group, Murdoch Children's Research Institute, Royal Children's Hospital et Département de pédiatrie, Université de Melbourne, Parkville, Victoria, Australie

Boris Novakovic

Département de médecine de soins intensifs et Radboud Center for Infectious Diseases (RCI), Radboud University Medical Center, Nimègue, Pays-Bas

Aron Jansen, Peter Pickkers et Matthijs Kox

Institut de recherche cardiovasculaire, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, États-Unis

Mandy MT van Leent & Abraham JP Teunissen

Département de génétique médicale, Université de médecine et de pharmacie Iuliu Hatieganu, Cluj-Napoca, Roumanie

Léo AB Joosten

Division de cardiologie, Département de médecine, Programme Marc et Ruti Bell en biologie vasculaire, École de médecine de l'Université de New York, New York, NY, États-Unis

Edward A. Fisher

Département de génomique et d'immunorégulation, Life and Medical Sciences Institute (LIMES), Université de Bonn, Bonn, Allemagne

Mihai G. Netea

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WJMM et MGN ont conceptualisé l'étude. WJMM, MGN, ZAF, EAF et RvdM ont supervisé l'étude. RJR, SJCFMM et LABJ ont démêlé le mode d'action de l'IL4. DPS, JD, AdD et MM ont conçu, exprimé et optimisé des protéines de fusion. DPS, JD, AdD, RSO, EGN, GP, AA, CP-M., EK et AJPT ont produit, marqué et caractérisé des nanoparticules. DPS, RJR, LAG, AMDB, BN, MK, AJ, PP et TJB ont réalisé des expériences ex vivo (humain), in vivo et in vitro. DPS, RJR, YCT, JD, BP, JM, YvE, TA et MMTvL ont réalisé des expériences in vivo et ex vivo sur des primates non humains de souris. DPS, RJR, MGN et WJMM ont rédigé le manuscrit et produit les figures. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit et ont fourni des commentaires.

Correspondance à Mihai G. Netea ou Willem JM Mulder.

WJMM, LABJ et MGN sont les cofondateurs scientifiques de Trained Therapeutix Discovery et détiennent des parts dans Trained Therapeutix Discovery. WJMM est CSO de Trained Therapeutix Discovery. WJMM et MGN sont les co-fondateurs scientifiques de BioTrip et ont des parts dans BioTrip.

Nature Biomedical Engineering remercie Jeffrey Hubbell, Srinivasa Reddy et Markus Weigand pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

( a ) Niveaux de lactate surnageant après stimulation de 24 heures avec IL4. (b) Niveaux de lactate surnageant accumulés au jour 6 après l'entraînement à l'IL4. ( c ) Mesure par cytométrie en flux de la phagocytose de Candida albicans marquée au FITC au jour 6 après l'entraînement à l'IL4. ( d ) Mesure par cytométrie en flux des marqueurs de surface couramment associés à l'activation de l'IL4 des monocytes / macrophages, au jour 6 après la formation de l'IL4. ( e ) Mesure par cytométrie en flux du marqueur de cellules dendritiques CD1c sur des macrophages formés à l'IL4 et des cellules dendritiques dérivées de monocytes (moDC). Les données sont présentées sous forme de moyenne (cytométrie en flux : moyenne géométrique de l'intensité de fluorescence) ± SD.

(a) Production de TNF/IL6 après re-stimulation des cellules entraînées avec IL4 tout en bloquant les principales voies de signalisation de l'IL4 (b) Multiplication du TNF/IL6 après restimulation des cellules entraînées avec l'IL4 tout en bloquant les principales voies de signalisation de l'IL4 . ( c ) Carte thermique du transcriptome des monocytes directement après isolement et après stimulation avec RPMI, IL4, LPS ou LPS + IL4. ( d ) Analyse d'enrichissement du motif du facteur de transcription des effets aigus de l'IL4 sur les monocytes stimulés par le LPS. ( e ) Analyses d'enrichissement des voies de l'effet de l'IL4 sur la stimulation aiguë du LPS. ( f ) Analyse ChIP-qPCR du TNF dans des cellules formées à l'IL4. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD.

Cinétique de la liaison de l'IL4 à l'IL4Rα à l'aide de SPR.

( a ) Évaluation DLS de la taille des particules d'aNPs conventionnelles. ( b ) Stabilité DLS des ANP conventionnels dans le temps.

( a ) Autoradiographie d'organe 24 h après l'injection de 89Zr-IL4-aNPs chez la souris. ( b ) Comptage gamma dans les organes vitaux 24 h après l'injection de 89Zr-IL4-aNPs chez la souris (n = 5). ( c ) Rapports d'absorption par les organes cibles par rapport aux organes de clairance chez la souris ANOVA à 2 voies avec analyse post-hoc de Turquie. ( d ) Analyses TEP / IRM dynamiques de primates non humains à 1, 30 et 60 minutes après l'injection de 89Zr-IL4-aNPs. ( e ) SUVmoyenne spécifique à l'organe chez les primates non humains sur 1 heure après l'administration de 89Zr-IL4-aNPs. ( f ) Stratégie de déclenchement pour la moelle osseuse (en haut) et la rate (en bas) dans des expériences visant à mesurer la spécificité de type cellulaire des IL4-aNP discoïdes marqués au DiO. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD, le cas échéant.

( a ) Phosphorylation de STAT6, mesurée par cytométrie en flux après 30 minutes de stimulation avec du RPMI, de l'IL4 ou différentes concentrations d'IL4-aNP. Les données sont exprimées par rapport au signal élicité par l'IL4 nue. ( d ) Essai de polarisation des lymphocytes T par cytométrie en flux, après 7 jours de réaction leucocytaire mixte avec des macrophages formés à l'IL4 (-aNP) ou un contrôle. ( b ) Production de TNF après stimulation par le LPS de monocytes isolés avant et 4 heures après la provocation par endotoxine in vivo chez l'homme. ( c ) Niveaux de TNF et d'IL6 après restimulation ex vivo de cellules humaines in vivo tolérisées par le LPS (à gauche) et les mêmes données exprimées en changements de pli par rapport aux échantillons d'endotoxémie tolérants (à droite).

Tableaux supplémentaires 1 à 5 et gels SDS – PAGE non traités et Western blots pour la figure 3.

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Schrijver, DP, Röring, RJ, Deckers, J. et al. Résoudre l'immunoparalysie induite par la septicémie via une immunité entraînée en ciblant l'interleukine-4 sur les cellules myéloïdes. Nat. Biomédical. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01050-0

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Reçu : 21 décembre 2021

Accepté : 02 mai 2023

Publié: 08 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41551-023-01050-0

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