La suppression de l'enzyme malique humaine 2 modifie le métabolisme énergétique et inhibe la respiration cellulaire

Communications Biology volume 6, Article number: 548 (2023) Citer cet article

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L'enzyme malique dépendante du NAD(P)+ mitochondrial humain (ME2) est bien connue pour son rôle dans le métabolisme cellulaire, qui peut être impliqué dans le cancer ou l'épilepsie. Nous présentons de puissants inhibiteurs de ME2 basés sur des structures cyro-EM qui ciblent l'activité de l'enzyme ME2. Deux structures de complexes inhibiteurs de ME2 démontrent que l'acide 5,5'-méthylènedisalicylique (MDSA) et l'acide embonique (EA) se lient de manière allostérique au site de liaison au fumarate de ME2. Des études de mutagenèse démontrent que Asn35 et le réseau Gln64-Tyr562 sont nécessaires pour la liaison des deux inhibiteurs. La surexpression de ME2 augmente la production de pyruvate et de NADH tout en diminuant le rapport NAD+/NADH de la cellule ; cependant, le renversement ME2 a l'effet inverse. Le MDSA et l'EA inhibent la synthèse du pyruvate et augmentent ainsi le rapport NAD+/NADH, ce qui implique que ces deux inhibiteurs interfèrent avec les changements métaboliques en inhibant l'activité cellulaire de ME2. Le silence de ME2 ou l'inhibition de l'activité de ME2 avec MDSA ou EA diminue la respiration cellulaire et la synthèse d'ATP. Nos résultats suggèrent que ME2 est crucial pour le pyruvate mitochondrial et le métabolisme énergétique, ainsi que pour la respiration cellulaire, et que les inhibiteurs de ME2 pourraient être utiles dans le traitement du cancer ou d'autres maladies impliquant ces processus.

L'enzyme malique ME est une nouvelle classe de décarboxylases oxydatives qui catalysent la conversion du L-malate en pyruvate tout en réduisant simultanément le NAD(P)+ en NAD(P)H1,2,3,4. Les enzymes maliques chez les mammifères sont classées en trois isoformes, ME1, ME2 et ME3, en fonction de leur localisation subcellulaire et de leur spécificité de cofacteur, chacune remplissant une fonction physiologique distincte. ME1 est un ME dépendant du NADP + cytosolique impliqué dans la génération de NADPH cytoplasmique pour la biosynthèse réductrice et la reconstitution de l'intermédiaire du cycle de l'acide tricarboxylique (TCA) par la transformation inverse du pyruvate en L-malate5,6. ME3 est un ME dépendant du NADP+ mitochondrial exprimé de manière négligeable qui peut être impliqué dans le cycle du NADPH dans les mitochondries5. ME2 est un ME dépendant de NAD+ ou NADP+ trouvé dans les mitochondries qui est impliqué dans la génération de NADH et NADPH mitochondriaux4,7,8,9. ME2 se distingue des deux autres isoformes de mammifères par sa double spécificité de cofacteur et un système de régulation allostérique complexe. De plus, seule l'isoforme ME2 coopère avec le substrat L-malate et le fumarate peut activer l'enzyme de manière allostérique tandis que l'ATP inhibe son activité enzymatique10,11,12,13,14,15,16,17,18,19.

ME2 a été initialement identifié dans les mitochondries de l'hépatome8, et a depuis été identifié dans la leucémie, le mélanome, le gliome et le cancer du sein9,20,21,22 où il est fortement associé à la progression du cancer et à la survie. En conséquence, il a été identifié comme une cible prometteuse pour le traitement du cancer23. Il est également présent dans les îlots pancréatiques de cellules d'insulinome humain, de rat et de souris, et il peut contribuer à la sécrétion d'insuline stimulée par les acides aminés et fournir suffisamment de pyruvate pour augmenter le flux du cycle de Krebs lorsque le glucose est limité24,25. ME2 est également requis pour la prolifération et la différenciation des ostéoblastes26. L'activité ME2 est extrêmement abondante dans les mitochondries synaptiques du cerveau, ce qui indique qu'elle joue un rôle dans la voie de recyclage du pyruvate et dans le maintien du glutathion réduit intramitochondrial dans les terminaisons synaptiques27. Le gène ME2 a été lié aux syndromes d'épilepsie. En utilisant à la fois des méthodes cas-témoins et des associations basées sur la famille, il s'est avéré qu'il était associé à l'épilepsie généralisée idiopathique (IGE) dans une étude.

ME2 a été identifié avec un gène associé aux syndromes épileptiques. Il a été identifié avec le gène associé à l'épilepsie généralisée idiopathique (IGE) dans une étude utilisant à la fois des méthodes cas-témoins et des associations basées sur la famille28. L'haplotype du polymorphisme mononucléotidique ME2 (SNP) a été associé à un risque accru d'IGE et prédispose à l'épilepsie généralisée génétique de l'adolescence29.

Dans les cellules tumorales, la glutaminolyse via le cycle de l'acide tricarboxylique peut coopérer avec l'oxydation du malate en pyruvate via ME24,9,30. Le glutamate et la glutamine sont utilisés comme sources d'énergie dans les cellules cancéreuses, et ME2 peut jouer un rôle essentiel dans la glutaminolyse30,31. ME2 convertit le L-malate, qui est dérivé de la glutamine, dans les mitochondries en pyruvate et NAD(P)H30,31,32,33. En produisant du NADH et du pyruvate, le ME2 peut jouer un rôle important dans la production d'énergie dans les tissus et les cellules tumorales à prolifération rapide8,31,34 ; en produisant du NADPH, ME2 génère les équivalents réducteurs pour la réduction du glutathion35,36.

Il a été démontré que ME2 est régulé négativement par p53 et que son expression protège les cellules cancéreuses de la sénescence cellulaire causée par p5337. Deux éléments de réponse fonctionnels de p53 sont situés dans le premier intron du gène ME2, ce qui implique que p53 peut agir comme un répresseur transcriptionnel pour ME237. En effet, une relation de régulation réciproque existe entre p53 et les enzymes maliques, qui déterminent le destin irréversible de la cellule via la voie métabolique impliquée par ME238. Nous avons démontré l'importance de ME2 dans le mélanome cutané20. Le déficit en ME2 dans les cellules de mélanome entraîne une diminution des niveaux d'ATP et une augmentation des niveaux de ROS, ce qui déclenche l'activité de la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK), favorisant la phosphorylation et l'activation de p53, et finalement la mort cellulaire20. L'effet des analogues structuraux du substrat malate et du fumarate activateur allostérique sur le ME2 humain a été étudié39,40. De plus, notre laboratoire a découvert une petite molécule inhibitrice, l'acide embonique (EA), qui est spécifique de ME2, et l'EA inhibe la croissance des cellules cancéreuses du poumon et induit la sénescence cellulaire41.

L'enzyme malique est un homotétramère, ou un dimère de dimères, dans lequel l'interface dimère est plus étroitement couplée que l'interface tétramère42. Les structures cristallines du ME2 humain en complexe avec leurs ligands révèlent que chaque monomère de l'enzyme contient deux sites de liaison de ligand supplémentaires11. Un site est situé à l'interface dimère et est responsable de la liaison de l'activateur allostérique fumarate11. L'autre site, situé à l'interface tétramère, est capable de se lier à un autre nucléotide, tel que NAD+ ou ATP ; ce deuxième site de liaison aux nucléotides est appelé "site exo". Les ligands nucléotidiques du site exo ont des fonctions biologiques discrètes qui incluent la régulation de la structure quaternaire et la catalyse de ME219. Le ME2 humain peut exister sous des formes ouvertes et fermées. La structure du ME2 humain dans son complexe binaire avec le cofacteur NAD+ est représentative de la forme ouverte I, alors que la structure des complexes pentanaires tels que ME2-nucléotide (NAD+, NADH ou ATP)-cation divalent (Mg2+ ou Mn2+)-substrat (pyruvate ou L-malate)-fumarate est représentatif de la forme fermée II de l'enzyme10,11,43. Le gène humain ME2 contient de nombreux variants mononucléotidiques (SNV) dans la région codante, qui peuvent avoir un effet sur la fonction de l'enzyme. Nous avons précédemment établi que les SNV dans le site de liaison du fumarate allostérique et l'exo-site entraînent l'inactivation ou l'hyper-activation de ME2, et les structures ME2-SNV résolues fournissent une base moléculaire pour expliquer les propriétés cinétiques anormales des enzymes SNV44.

Dans cet article, nous décrivons les structures complexes de ME2 et de ses inhibiteurs allostériques, démontrant l'effet néfaste des inhibiteurs sur la transition de structure ; nous discutons également du rôle de ME2 dans le métabolisme énergétique. Nous avons étudié l'efficacité des inhibiteurs allostériques de ME2, EA et MDSA, dans l'inhibition du pyruvate médié par ME2 et du métabolisme énergétique dans trois cellules non cancéreuses, démontrant le rôle de ME2 dans le métabolisme énergétique en augmentant la production de pyruvate et de NADH, qui stimule la production d'ATP, ainsi que en anti-oxydation lorsque les mitochondries sont soumises à un niveau élevé de stress oxydatif. Cet article illustre parfaitement la régulation allostérique des enzymes, démontrant les effets des inhibiteurs allostériques sur leur structure et leur fonction, ainsi que sur le métabolisme énergétique cellulaire. En outre. en utilisant des approches biochimiques, biophysiques et métaboliques cellulaires, il explique le rôle de ME2 dans les mitochondries, ainsi que le rôle de PFK dans le cytoplasme ; les deux jouent un rôle de détection d'énergie dans leurs organites respectifs.

Sur la base de la mutagenèse dirigée des interfaces dimère ou tétramère, du site de liaison au fumarate et du site exo, nous avons précédemment signalé que le 4,4'-méthylène-bis(acide 3-hydroxy-2-naphtoïque), également connu sous le nom d'acide embonique (EA), peut agir comme un inhibiteur allostérique de ME241. De plus, les effets inhibiteurs de divers dérivés d'acide disalicylique et d'acide naphtoïque sur l'activité enzymatique de ME2 ont été étudiés (Fig. S1). Les structures chimiques de ces dérivés sont répertoriées dans le tableau S1, ainsi que leurs valeurs IC50. Parmi ces composés, un acide disalicylique, l'acide 5,5'-méthylènedisalicylique (MDSA) avait un effet inhibiteur remarquable sur ME2 avec une IC50 de 0,51 µM (Fig. S1a), tandis que l'acide salicylique avait un effet inhibiteur négligeable sur ME2 (IC50 = 800,7 µM ; figure S1b). L'acide 3-benzoylbenzoïque, qui a un squelette carboné similaire au MDSA, a eu un effet inhibiteur négligeable sur l'activité ME2, avec une valeur IC50 de 652 µM, comme le montre la Fig. S1b.

L'EA, un acide bis 3-hydroxy-2-naphtoïque, a eu un effet inhibiteur notable sur ME2 avec une CI50 de 1,1 µM. (Fig. S1a). L'effet inhibiteur de l'acide 3-hydroxy-2-naphtoïque avec un groupe hydroxyle en position 5', l'acide 3,5-dihydroxy-2-naphtoïque (IC50 de 12,4 µM ; Fig. S1b) a un effet inhibiteur supérieur à 3,5 -acide dihydroxy-2-naphtoïque avec un groupe hydroxyle ou bromo en position 7', acide 3,7-dihydroxy-2-naphtoïque et acide 7-bromo-3-hydroxy-2-naphtoïque (valeurs IC50 de 37,6 µM et 307,8 µM , respectivement ; figure S1b). Les dérivés d'acide naphtoïque avec des groupes hydroxyle adjacents, tels que l'acide 1-hydroxy-2-naphtoïque et l'acide 3-hydroxy-2-naphtoïque, présentent un effet considérablement moins inhibiteur sur l'activité que l'EA (valeurs IC50 de 74,7 µM et 105,4 µM, respectivement ; Fig. .S1b). Le 2,6-dicarboxynaphtalène, un naphtalène contenant de l'acide dicarboxylique, a eu un effet inhibiteur négligeable sur l'activité ME2, avec une valeur IC50 de 352,9 µM (Fig. S1b).

Dans le site actif des ME, les résidus nécessaires à la liaison au substrat et au métal sont sensiblement conservés à travers ME1 et ME23, 10, 42, 43. ME2, mais pas ME1, est une enzyme allostérique, et le fumarate ou les nucléotides se lient à des sites allostériques distincts pour moduler l'activité de ME23,11,12,16,17,19. En fait, contrairement à ME2, ME1 n'a pas de site allostérique à l'interface dimère, il ne peut donc pas être activé par le fumarate3,15. Les alignements de séquences et les études cinétiques démontrent cette possibilité12,16,17,45. La grande majorité des résidus de sites allostériques dans ME2 ne sont pas conservés dans ME1. Par conséquent, ME1 ne peut pas être activé par le fumarate, et il va de soi que ME1 peut ne pas être sensible aux inhibiteurs allostériques.

ME2 est très sensible à l'inhibition de la MDSA et de l'EA, tandis que ME1 est nettement moins sensible, ce qui indique que les deux inhibiteurs se lient aux sites allostériques. Dans cet article, nous démontrons les structures cryo-EM de ME2-MDSA et ME2-EA révélant que le site de liaison des inhibiteurs spécifiques de ME2 MDSA et EA est situé au site de liaison du fumarate allostérique de l'interface dimère (Fig. 1). La structure révèle que Asp37 dans ME1 peut gêner stériquement la liaison de MDSA et EA alors que la glycine est le résidu correspondant dans ME2.

a Structures Cryo-EM du complexe binaire ME2-NAD+ à une résolution d'environ 2,7 Å. L'exo-site NAD+ est surligné en bleu. La carte est tracée à 6,7 σ au-dessus de la moyenne. b Structure Cryo-EM du complexe ternaire ME2-NAD+-EA à une résolution d'environ 2,7 Å. L'inhibiteur EA est surligné en orange. Le NAD+ du site actif est coloré en rouge et le NAD+ de l'exosite est coloré en bleu. La carte est contournée à 8,3 σ. c Structure Cryo-EM du complexe ternaire ME2-NAD+-MDSA à une résolution d'environ 2,8 Å. L'inhibiteur MDSA est représenté en vert. Le NAD+ du site actif est coloré en rouge et le NAD+ de l'exosite est coloré en bleu. La carte est contournée à 8 σ. d Représentations en dessin animé du complexe binaire ME2 avec exo-site NAD+ (sphères bleues). Les sites allostériques (indiqués par des cercles en pointillés rouges), les sites actifs (indiqués par des cercles en pointillés violets) et les sites exo (indiqués par des cercles en pointillés roses) sont démontrés. Les lignes pointillées verticales et horizontales indiquent les interfaces dimère et tétramère, respectivement. e Complexe ternaire ME2 avec le site allostérique EA (sphères oranges), le site actif NAD+ (sphères rouges) et l'exo-site NAD+ (sphères bleues). f Complexe ternaire ME2 avec le site allostérique MDSA (sphères vertes) et le site actif NAD+ (sphères rouges) et l'exosite NAD+ (sphères bleues).

La structure cryo-EM du ME2 humain dans des complexes ternaires avec du NAD et des inhibiteurs (EA ou MDSA) a été déterminée à des résolutions de 2, 72 Å et 2, 82 Å, respectivement (Fig. S2 et Tableau S2). De plus, nous avons déterminé la structure cryo-EM du ME2 humain en l'absence de l'inhibiteur à une résolution de 2, 72 Å (Fig. S2 et Tableau S2). Les analyses cryo-EM à une seule particule ME2, EA-ME2 et MDSA-ME2 sans inhibiteur ont été affichées sous forme d'image cryo-EM représentative, de moyennes de classe 2D sans référence, de cartes de résolution pour les reconstructions finales, de parcelles FSC standard pour les reconstructions 3D et la distribution de l'angle d'Euler des images de particules (Fig. S2a – e, respectivement). Les flux de travail de traitement des données pour la structure ME2 sans inhibiteur, ME2-EA et ME2-MDSA sont représentés sur les Fig. S3–S5.

La structure cryo-EM globale du ME2 tétramérique sans inhibiteur (Figs. 1a et 1d) est comparable à celle du complexe binaire avec NAD + 42. Comme le montre la moyenne de classe bidimensionnelle des images au microscope électronique (Fig. S2b), les quatre monomères sont positionnés aux quatre coins de la structure. Dans la structure cryo-EM du ME2 humain sans l'inhibiteur, l'échantillon a été purifié en l'absence des cofacteurs NAD+, et une seule molécule NAD+ est observée dans le site exo de la sous-unité ME2 (Figs. 1a et 1d). Le site actif de structure sans inhibiteur est exposé au solvant, similaire à la forme ouverte de ME242.

Les deux complexes ME2-inhibiteur (ME2-EA et ME2-MDSA) ont été générés en présence des cofacteurs NAD+ et Mg2+, du substrat naturel pyruvate (PYR) et de l'inhibiteur (EA ou MDSA), mais les structures démontrent que seul le (EA ou MDSA) se lie au site de régulation allostérique à l'interface dimère (Figs. 1b, c, respectivement), tandis que les molécules NAD + apparaissent dans chaque site actif et exo-site à l'interface tétramère (Figs. 1e, f). La partie mononucléotide nicotinamide (NMN) du NAD + a des densités d'électrons considérablement plus faibles dans ces trois structures cryo-EM du ME2 humain (Fig. 1), ce qui implique qu'il peut être très désordonné. La composante NMN mal résolue du NAD+ est également observée dans la structure cristalline du ME211.

Des études structurelles antérieures ont découvert les conformations ouvertes et fermées de ME2, qui correspondent respectivement aux états inactif et actif de l'enzyme. Le site actif est complètement exposé au solvant sous forme ouverte inactive. Après la liaison des cations divalents (Mn2+ ou Mg2+) et des substrats (malate ou pyruvate), la fermeture du site actif est principalement médiée par le mouvement du corps rigide du domaine du site actif vers le site allostérique. En conséquence, les cations divalents et les substrats sont protégés du solvant sous la forme fermée active3,44.

Dans les structures contenant des inhibiteurs liés (ME2-EA et ME2-MDSA), à la fois l'EA et la MDSA sont liées au site allostérique à l'interface dimère. Contrairement au fumarate, l'encombrement des deux inhibiteurs nécessite un espace supplémentaire, poussant ainsi le domaine B vers le site actif. Ce mouvement modifie les emplacements spatiaux de Glu255, Asp256 et Asp279. Arg165 remplace spécifiquement Asp256 à la position de la chaîne latérale. Il a été démontré que les acides aminés hautement conservés Glu255, Asp256 et Asp279 sont nécessaires pour la catalyse et la chélation des ions divalents dans le site actif de MEs3,10,11,43. Par conséquent, les arrangements spatiaux induits par EA et MDSA conduisent à la perte d'ion divalent au site actif et inhibent la catalyse.

Le fumarate peut déclencher l'activité catalytique du ME2 humain, et l'activateur allostérique a été trouvé à l'interface dimère (Fig. 2d), à environ 30 Å de chaque site actif (Fig. 1). L'activateur interagit avec les chaînes latérales de Arg67 et Arg91 dans la région allostérique (Fig. 2d), et des études de mutagenèse confirment l'importance des résidus Arg67 et Arg91 dans la liaison du fumarate11,43.

Les structures illustrent les interactions ligand du site allostérique (panneaux supérieurs) et les surfaces coulombiennes entourant le site allostérique (panneaux inférieurs). Les mailles grises représentent les densités de ligands, et les bâtonnets représentent les résidus en interaction. Les interactions de liaison hydrogène sont indiquées par des lignes cyan, les interactions cation-π par des lignes vertes et les paires d'ions par des lignes magenta. a, e L'inhibiteur EA est représenté en bâtonnets orange dans le complexe ME2-EA. La carte est tracée à 6,5 σ au-dessus de la moyenne. b, f La MDSA est représentée par des bâtons verts dans le complexe ME2-MDSA. La carte est contournée à 7,5 σ. c, g Site allostérique du ME2 sans inhibiteur. d, h Le fumarate activateur est représenté en bâtonnets cyan foncé sous la forme fermée ME2 (PDB ID : 1PJ3). La carte est profilée à 1,8 σ. Les surfaces coulombiennes ont été calculées en utilisant les paramètres par défaut dans UCSF Chimera55.

La structure cryo-EM du complexe inhibiteur ME2 (ME2-EA et ME2-MDSA) révèle l'inhibiteur EA ou MDSA dans la région régulatrice allostérique de l'interface dimère (Figs. 1b, c, respectivement). EA interagit avec ME2 via des appariements d'ions, des interactions cation-pi, des liaisons hydrogène et des interactions hydrophobes avec les acides aminés environnants (Fig. 2a). Les résidus, Arg67 et Arg91 ont des interactions cation-π avec EA, tandis que Arg91 forme en outre une paire d'ions avec EA. Asn35, Asn92 et Gln64 interagissent avec EA via des liaisons hydrogène, et des réseaux hydrogène existent entre les chaînes latérales Gln64, Asn92 et Tyr562 (Fig. 2a).

La MDSA forme des paires d'ions avec les résidus de sous-unités adjacents Arg67 et Arg128, tandis que Arg91 interagit avec la MDSA via une interaction cation-π. Gln64 forme des liaisons hydrogène avec MDSA, et des réseaux hydrogène existent également entre les chaînes latérales Gln64, Asn92 et Tyr562 (Fig. 2b). Par rapport à la structure ME2 sans l'inhibiteur (Fig. 2c), Arg91 du complexe ME2-EA se déplace légèrement vers EA, formant une interaction cation-pi (Fig. 2a). Dans la structure du complexe ME2-MDSA, non seulement la chaîne latérale d'Arg91 change de direction vers la MDSA, mais la chaîne latérale d'Arg128 d'une autre sous-unité est également déplacée et interagit avec elle (Fig. 2b). Contrairement au fumarate, qui interagit principalement avec les chaînes latérales de Arg67 et Arg91 via des interactions de paires d'ions (Fig. 2d), les inhibiteurs EA et MDSA interagissent principalement avec les chaînes latérales de Arg67 et Arg91 via des interactions de paires d'ions et cation-pi ( Figures 2a, b). La poche du site allostérique est extensible, ce qui lui permet d'accueillir des molécules plus grosses que le fumarate, telles que l'EA et la MDSA (Figs. 2e – h).

Les quatre sites actifs sont situés dans les coins de la structure tétramère ME2 humaine, à environ 60 Å l'un de l'autre (Fig. 1). La structure cryo-EM de ME2 sous forme ouverte sans inhibiteur est un complexe binaire avec uniquement l'exo-site NAD+ ; les sites actifs n'ont pas de ligands et sont complètement exposés au solvant. (Fig. 3c). La forme fermée de ME2 est un complexe pentanaire avec le produit naturel pyruvate, cofacteur NAD+, Mn2+ et fumarate3,43. Malgré l'ajout de pyruvate lors de la préparation cryo-EM des deux échantillons (Figs. 1b, c, respectivement), le substrat pyruvate n'a pas été détecté dans les structures complexes ternaires ME2-EA et ME2-MDSA, et le site actif ne contenait que le NAD + molécule (Figs. 3a, b).

Les structures illustrent les interactions ligand du NAD+ du site actif (a, b, c et d) et les surfaces coulombiennes entourant le site actif (e, f, g et h). Les mailles grises représentent les densités de ligands, et les bâtonnets représentent les résidus en interaction. Les interactions de liaison hydrogène sont indiquées par des lignes cyan, les interactions cation-π par des lignes vertes et les paires d'ions par des lignes magenta. Dans les panneaux supérieurs, seule la partie ADP de la molécule NAD+ est représentée. a, e Le NAD+ du site actif et les résidus en interaction sont représentés par des bâtonnets bleu clair dans le complexe ME2-EA. La carte est contournée à 5 σ au-dessus de la moyenne. b, f Le NAD+ du site actif et les résidus en interaction sont représentés par des bâtonnets roses dans le complexe ME2-MDSA. La carte est tracée à 7,5 σ au-dessus de la moyenne. c, g Le NAD + n'a pas été observé dans le site actif et les résidus entourant la poche dans le ME2 sans inhibiteur sont représentés par des bâtons gris. d, h Le NAD+ du site actif et les résidus en interaction sont représentés par des bâtonnets jaunes sous la forme fermée ME2 (PDB ID : 1PJ3). La carte est tracée à 1,5 σ au-dessus de la moyenne. Les surfaces coulombiennes ont été calculées en utilisant les paramètres par défaut dans UCSF Chimera55.

Le substrat pyruvate, le cofacteur NAD + et les cations divalents Mg2 + sont tous liés aux résidus environnants sous la forme fermée du site actif de ME2 (Fig. 3d) et ils sont protégés dans la fente profonde (Fig. 3h). En comparant les sites actifs dans les structures de ME2-EA et ME2-MDSA et dans les formes ouvertes et fermées de ME2, les poches de sites actifs de ME2-EA (Fig. 3a) et ME2-MDSA (Fig. 3b) sont dans un état ouvert similaire à la forme ouverte de ME2 (Fig. 3c), indiquant que la liaison de l'EA et de la MDSA verrouille la conformation enzymatique sous la forme ouverte catalytiquement inactive. La poche NAD + du site actif est légèrement ouverte, ce qui peut rendre la fraction NMN plus flexible (Figs. 3e – h).

Le site exo ME2 humain dans chaque sous-unité est situé à l'interface tétramère, à environ 35 Å du site actif (Fig. 1). Nos structures cryo-EM des complexes ternaires ME2-EA et ME2-MDSA, ainsi que la forme ouverte de ME2, révèlent que seule la partie ADP de la molécule NAD+ est ordonnée dans les sites exo de ME2 (Fig. S6), cohérent avec les observations cristallographiques précédentes (PDB ID: 1PJ3, Fig. S6d). La base adénine de NAD+ forme des liaisons hydrogène avec l'amide de Arg194 et le carbonyle de Arg556, tandis que les chaînes latérales de Arg197 forment des liaisons hydrogène avec le ribose de NAD+. Des liaisons hydrogène se forment entre les groupes phosphate de NAD+ et les chaînes latérales de Arg542 et Arg556 (Figs. S6a, S6b et S6c). Une comparaison des interactions ligand de l'exo-site NAD + dans les structures de ME2-EA et ME2-MDSA et des formes ouvertes et fermées de ME2 révèle que les portions ADP y sont orientées de manière similaire (Fig. S6).

Sur la base des structures de ME2-EA et ME2-MDSA, nous avons conçu 16 mutants ME2 et évalué leur sensibilité à l'inhibition de la MDSA ou de l'EA afin de déterminer quels résidus d'acides aminés sont nécessaires à la liaison et à l'inhibition de la MDSA ou de l'EA (Fig. S7). Arg67 et Arg91 sont les ligands directs du fumarate ; les mutants R67A et R91A étaient moins sensibles à la MDSA ou à l'EA, avec des valeurs IC50 accrues (tableau 1). Comme Arg67 est le ligand qui interagit directement avec la MDSA, le mutant R67A a démontré une activité nettement moins inhibée par la MDSA, avec une valeur IC50 de 185 µM, soit plus de 300 fois celle du WT (tableau 1). Arg67 et Glu59 forment un pont salin et Glu59 est apparié par des ions avec Lys57. Cependant, les mutants K57 et E59 sont restés sensibles à l'inhibition de la MDSA ou de l'EA, avec des valeurs d'IC50 comparables à celles du WT (tableau 1).

Gln64 sert de ligand principal pour la liaison MDSA ou EA, tandis que Tyr562 forme une liaison hydrogène avec Gln64. Q64N avait des valeurs IC50 de 62,4 µM et 38,2 µM, et Y562A avait des valeurs IC50 de 40,8 µM et 46,1 µM, pour MDSA et EA, respectivement, des valeurs qui étaient évidemment supérieures à celles de WT (tableau 1), indiquant que le Gln64-Tyr562 paire est nécessaire pour la liaison MDSA ou EA dans le site allostérique.

En raison de la liaison directe d'Asn35 à EA, la valeur IC50 de N35D était 10 fois supérieure à celle de WT, tandis que les valeurs IC50 de N35A et N35Q étaient 70 et 160 fois supérieures à celles de WT (tableau 1), indiquant que la spécificité structurelle de la chaîne latérale d'Asn35 est cruciale pour la liaison à l'EA. Par conséquent, malgré le fait que l'Asn35 n'interagit pas directement avec la MDSA, les mutants N35 étaient moins sensibles à l'inhibition de la MDSA en raison de l'effet de chaîne latérale de l'Asn35. Asn92 a une interaction directe avec EA, tandis que Arg128 a une interaction directe avec MDSA. Les deux résidus ne sont pas nécessaires pour la liaison à la MDSA ou à l'EA, comme l'indique le fait que les valeurs IC50 des mutants N92A, N92Q et R128A n'ont pas été nettement augmentées, ce qui indique que ces mutants sont restés sensibles à l'inhibition de la MDSA ou de l'EA (tableau 1).

Alors que ces mutants de liaison aux inhibiteurs de ME2 présentent une large gamme de propriétés cinétiques (tableau S3) et que la majorité sont insensibles au fumarate activateur allostérique (Fig. S8), comme indiqué précédemment dans la littérature44, leurs structures secondaires globales sont assez similaires à ceux du WT (Fig. S9), indiquant que la mutation de ces résidus n'a pas entraîné de changements conformationnels substantiels, et la sensibilité des mutants ME2 à l'inhibition de la MDSA ou de l'EA a été déterminée par la géométrie locale du site allostérique de ME2.

MDSA et EA ont été introduits pour déterminer leur effet inhibiteur sur le ME2 cellulaire dans trois lignées cellulaires non cancéreuses : HEK293T (cellules 293 de rein embryonnaire humain), HFL-1 (cellules de fibroblastes pulmonaires humains) et MRC-5 (cellules de fibroblastes pulmonaires embryonnaires humains). ) et deux lignées cellulaires cancéreuses : H1299 (carcinome pulmonaire non à petites cellules humain) et MCF-7 (adénocarcinome du sein humain). Les cinq lignées cellulaires présentaient l'expression de ME2 (Figs. S10a–10d). Nous avons également établi des cellules HEK293T stables avec des plasmides de surexpression de ME2 (vecteur pcDNA3 et pcDNA3-ME2; Fig. S10e) et avec un shARN pour le renversement de ME2 (shCon et shME2; Fig. S10a), comme contrôles positifs et négatifs, respectivement.

ME2 catalyse l'oxydation du malate suivie de la réduction du NAD+ ou du NADP+ pour former du pyruvate et du NADH ou du NADPH. En conséquence, les niveaux de pyruvate, de NADH et de NADPH, ainsi que le rapport NAD + / NADH ont d'abord été déterminés dans les cellules HEK293T surexprimant ME2 et renversées par ME2 (Fig. 4). Les cellules surexprimant ME2 présentaient une augmentation des niveaux de pyruvate et de NADH et une diminution du rapport NAD + / NADH (Figs. 4a, b, c, respectivement), tandis que les cellules silencieuses de ME2 avaient une diminution des niveaux de pyruvate et de NADH et une augmentation du rapport NAD + / NADH ( Figures 4a, b, c, respectivement). Lorsqu'elles sont traitées avec MDSA ou EA, les cellules HEK293T, HFL-1 et MRC-5 sont également sensibles à l'inhibition de ME2. Le traitement par EA ou MDSA a efficacement inhibé l'activité ME2 dans les cellules HEK293T, HFL-1 et MRC-5, entraînant une diminution des niveaux de pyruvate (Figs. 4a, d et S11a, respectivement) et de NADH (Figs. 4b, e et S11b, respectivement) et une augmentation du rapport NAD + / NADH (Figs. 4c, f et S11c, respectivement), similaires à celles du silence ME2 (Figs. 4a – c).

Le changement de pli dans les niveaux cellulaires de pyruvate et de NADH, le rapport NAD + / NADH, l'ATP, le NADPH et les espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans ME2-surexprimant (ME2-Over), ME2-knockdown (ME2-KD), EA-traité, et cellules traitées au MDSA. a Le changement de pli des niveaux de pyruvate dans les cellules HEK293T. N = 3-4. Test t de Student non apparié. *p < 0,05, ***p < 0,001. b Le pli modifie les niveaux de NADH dans les cellules HEK293T. N = 3. Test t de Student non apparié. *p < 0,05, ***p < 0,001. c Le rapport NAD+/NADH dans les cellules HEK293T. N = 3. Test t de Student non apparié. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. d Le changement de pli des niveaux de pyruvate dans les cellules HFL-1. N = 3. Test t de Student non apparié. **p < 0,01, ***p < 0,001. e Le changement de pli des niveaux de NADH dans les cellules HFL-1. N = 3. Test t de Student non apparié. **p < 0,01, ***p < 0,001. f Le changement de pli dans le rapport NAD+/NADH dans les cellules HFL-1. N = 3. Test t de Student non apparié. *p < 0,05, **p < 0,01. g Le changement de pli des niveaux d'ATP dans les cellules HEK293T. N = 3-4. Test t de Student non apparié. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. h Le changement de pli des niveaux de NADPH dans les cellules HEK293T. N = 3-4. Test t de Student non apparié. **p < 0,01. ns, aucune signification statistique. i Le changement de pli des niveaux de ROS dans les cellules HEK293T. N = 3-4. Test t de Student non apparié. **p < 0,01. ns, aucune signification statistique. j Le facteur de variation des niveaux d'ATP dans les cellules HFL-1. N = 3-4. Test t de Student non apparié. *p < 0,05, **p < 0,01. k Le facteur de variation des niveaux de NADPH dans les cellules HEK293T. N = 3. Test t de Student non apparié. **p < 0,01. l Le changement de pli des niveaux de ROS dans les cellules HEK293T. N = 3. Test t de Student non apparié. *p < 0,05, **p < 0,01. Les graphiques à barres illustrent le changement de pli dans les niveaux de ces métabolites après 48 h. Les barres d'erreur sont moyennes ± SD.

Le rapport NAD+/NADH et les niveaux d'ATP dans la cellule sont des indicateurs critiques du métabolisme énergétique. Les cellules surexprimant ME2 avaient un rapport NAD + / NADH plus faible (Fig. 4c) et des niveaux d'ATP plus élevés (Fig. 4g), tandis que les cellules silencieuses de ME2 ont connu le contraire (Figs. 4c, g), indiquant que ME2 est positivement corrélé avec l'énergie métabolisme. Le traitement par EA ou MDSA a augmenté le rapport NAD + / NADH et a diminué les niveaux d'ATP dans les cellules HEK293T (Figs. 4c, g, respectivement). Des résultats similaires ont été observés dans les cellules HFL-1 et MRC-5 traitées à l'EA ou au MDSA. Le traitement par EA ou MDSA dans les cellules HEK293T, HFL-1 et MRC-5 a entraîné une diminution des niveaux d'ATP (Fig. 4g, j et S11d, respectivement) et de NADH (Fig. 4b, e et S11b, respectivement), indiquant que le MDSA et l'EA étaient capables de réguler négativement le métabolisme énergétique de la cellule en inhibant l'activité ME2.

Les niveaux d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les cellules HEK293T traitées avec MDSA ou EA sont restés constants (Fig. 4i), ce qui correspondait à des niveaux de NADPH inchangés (Fig. 4h). Dans les cellules MRC-5, le traitement à l'EA a entraîné une diminution de la production de NADPH (Fig. S11e), ce qui a entraîné une augmentation du niveau de ROS (Fig. S11f). Après avoir été traitées avec du MDSA ou de l'EA, les cellules HFL-1 produisaient également moins de NADPH (Fig. 4k), tandis que la production de ROS augmentait en même temps (Fig. 4l). Il est possible que le stress oxydatif causé par l'augmentation des ROS et la diminution du NADPH dans les cellules HFL-1 soit la cause du plus grand effet du traitement MDSA ou EA sur la viabilité cellulaire observé avec la cellule HFL-1 (Fig.S12c). La cellule HFL-1 était la plus sensible des trois cellules non cancéreuses à l'inhibition de ME2 médiée par MDSA ou EA (Fig. S12a – S12c); cela était dû au fait que le MDSA et l'EA avaient un effet suppressif prononcé sur celui-ci, réduisant non seulement les niveaux de pyruvate et de NADH (Fig. 4d et 4e, respectivement), mais également les niveaux de NADPH (Fig. 4k).

Nous avons continué à examiner l'efficacité de l'EA ou du MDSA sur les altérations métaboliques associées au ME2 dans les lignées cellulaires cancéreuses H1299 et MCF-7 (Fig. 5 et S13, respectivement). ME2 a été trouvé dans les deux lignées cellulaires (Fig. S10d). Il était intrigant que les cellules H1299 soient sensibles à l'EA ou au MDSA, comme en témoigne une réduction de la production de pyruvate, d'ATP et de NADPH et une augmentation de la production de ROS (Fig. 5a à d, respectivement). Une augmentation des ROS et une diminution du NADPH dans les cellules H1299 ont entraîné une mortalité cellulaire évidente (Fig. S12d). En revanche, ni l'EA ni le MDSA n'ont d'effets substantiels sur le métabolisme dirigé par ME2 dans les cellules MCF-7 (Fig. S13a – S13d) ou sur la viabilité cellulaire dans les cellules MCF-7 (Fig. S12e), indiquant que l'effet du médicament sur ME2 -les cellules exprimées sont variables.

Le changement proportionnel du pyruvate cellulaire, de l'ATP, du NADPH et du ROS dans les cellules H1299 en présence d'EA ou de MDSA (0, 75 et 150 µM). a Le changement de pli dans les niveaux de pyruvate. N = 3. Test t de Student non apparié. *p < 0,05. b Le changement de pli dans les niveaux d'ATP. N = 3. Test t de Student non apparié. **p < 0,01. c Le changement de pli dans les niveaux de NADPH. N = 3. Test t de Student non apparié. **p < 0,01. d Le changement de pli dans les niveaux de ROS. N = 3. Test t de Student non apparié. *p < 0,05. e Le taux de consommation d'oxygène dans les cellules H1299 traitées à l'EA. N = 3. f Le taux de respiration de base. N = 7, 8 et 11, de gauche à droite. ANOVA unidirectionnelle avec test de Dunnett. *p < 0,05, ***p < 0,001. g La fréquence respiratoire maximale. N = 7, 8 et 11, de gauche à droite. ANOVA unidirectionnelle avec test de Dunnett. **p < 0,01, ***p < 0,001. h Production d'ATP. N = 7, 6 et 11, de gauche à droite. ANOVA unidirectionnelle avec test de Dunnett. *p < 0,05, ***p < 0,001. i La capacité respiratoire de réserve. N = 7, 8 et 11, de gauche à droite. ANOVA unidirectionnelle avec test de Dunnett. *p < 0,05, ***p < 0,001. j Le taux de consommation d'oxygène dans les cellules H1299 traitées au MDSA (N = 3–5). k Le rythme respiratoire de base. N = 7, 16 et 13, de gauche à droite. ANOVA unidirectionnelle avec test de Dunnett. ***p < 0,001. l La fréquence respiratoire maximale. N = 7, 16 et 13, de gauche à droite. ANOVA unidirectionnelle avec test de Dunnett. *p < 0,05, ***p < 0,001. m Production d'ATP. N = 7, 16 et 13, de gauche à droite. ANOVA unidirectionnelle avec test de Dunnett. ***p < 0,001. n La capacité respiratoire disponible. N = 8, 16 et 13, de gauche à droite. ANOVA unidirectionnelle avec test de Dunnett. ns, aucune signification statistique. Les barres d'erreur sont moyennes ± SD. Oligo : Oligomycine ; FCCP : cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone ; Pourriture/fourmi : Roténone/Antimycine A.

La spectrométrie de masse a été utilisée pour déterminer les modifications des niveaux de pyruvate, de malate, de phosphoénolpyruvate (PEP) et de glucose après un traitement au MDSA ou à l'EA (Fig. S14). L'inhibition de ME2 par MDSA ou EA, comme prévu, a entraîné une diminution du pyruvate (Fig. 4 et S14). D'autre part, le niveau de malate cellulaire est resté relativement constant, ce qui indique que l'inhibition de l'activité ME2 n'entraîne pas d'accumulation de malate (Fig. S14). De plus, l'inhibition de l'activité ME2 n'a eu aucun effet sur les niveaux cellulaires de PEP et de glucose (Fig. S14). À la suite de ces découvertes, on peut conclure que l'inhibition de ME2 a diminué la génération de pyruvate sans altérer la glycolyse.

Nous avons mené des expériences de taux de consommation d'oxygène (OCR) pour déterminer la capacité respiratoire et la quantité d'ATP produite par la phosphorylation oxydative (Fig. 6). L'analyseur Agilent Seahorse XF a été utilisé pour mesurer la respiration cellulaire des cellules silencieuses au ME2, ainsi que des cellules traitées au MDSA ou à l'EA. L'OCR a été considérablement diminué dans les cellules HEK293T silencieuses par ME2 (Fig. 6a), tout comme la respiration basale et maximale (Figs. 6b, c), la quantité d'ATP produite par la phosphorylation oxydative (Fig. 6d) et la respiration de réserve. capacité (Fig. 6e), démontrant que le silence de ME2 réduit considérablement la respiration cellulaire et la production d'ATP.

a Le taux de consommation d'oxygène dans les cellules HEK293T ME2-control (shCon) et ME2-knockdown (shME2). N = 3–6. b Le rythme respiratoire de base. N = 16 et 12, de gauche à droite. Test t de Student non apparié. ***p < 0,001. c La fréquence respiratoire maximale. N = 16 et 12, de gauche à droite. Test t de Student non apparié. ***p < 0,001. d Production d'ATP. N = 16 et 13, de gauche à droite. Test t de Student non apparié. ***p < 0,001. e La capacité respiratoire de réserve. N = 16 et 11, de gauche à droite. Test t de Student non apparié. **p < 0,01. f Le taux de consommation d'oxygène dans les cellules HEK293T traitées à l'EA. N = 3-4. g Le taux de respiration de base. N = 9, 7 et 10, de gauche à droite. ANOVA unidirectionnelle avec test de Dunnett. *p < 0,05, ***p < 0,001. h La fréquence respiratoire maximale. N = 9, 7 et 10, de gauche à droite. ANOVA unidirectionnelle avec test de Dunnett. **p < 0,01, ***p < 0,001. j'ai la production d'ATP. N = 9, 7 et 10, de gauche à droite. ANOVA unidirectionnelle avec test de Dunnett. ***p < 0,001. ns, aucune signification statistique. j La capacité respiratoire de réserve. N = 9, 7 et 10, de gauche à droite. ANOVA unidirectionnelle avec test de Dunnett. *p < 0,05, ***p < 0,001. k Le taux de consommation d'oxygène dans les cellules HEK293T traitées au MDSA. N = 3-5. l Le rythme respiratoire de base. N = 10, 9 et 10, de gauche à droite. ANOVA unidirectionnelle avec test de Dunnett. **p < 0,01, ***p < 0,001. m La fréquence respiratoire maximale. N = 9, 9 et 10, de gauche à droite. ANOVA unidirectionnelle avec test de Dunnett. ***p < 0,001. n Production d'ATP. N = 9, 9 et 10, de gauche à droite. ANOVA unidirectionnelle avec test de Dunnett. **p < 0,01, ***p < 0,001. o La capacité respiratoire de réserve. N = 9, 9 et 10, de gauche à droite. ANOVA unidirectionnelle avec test de Dunnett. ***p < 0,001. Les barres d'erreur sont moyennes ± SD. Oligo Oligomycine, FCCP Cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone, Rot/Ant Roténone/Antimycine A.

L'OCR a été réduit dans les cellules traitées à l'EA de manière dose-dépendante (Fig. 6f), tout comme la respiration initiale et maximale (Fig. 6g, h), la synthèse d'ATP (Fig. 6i) et la capacité respiratoire de réserve (Fig. 6i). 6j), suggérant que l'EA, en inhibant ME2, réduit considérablement la respiration cellulaire et la synthèse d'ATP. La MDSA avait également le même type d'effets que l'EA (Figs. 6k–6o) mais était encore plus efficace ; par exemple, la réduction de la synthèse d'ATP avec MDSA nécessite 25 µM (Fig. 6n), alors qu'avec EA, elle nécessite plus de 25 µM (Fig. 6i).

De plus, des expériences d'OCR ont été menées pour évaluer l'efficacité de l'EA ou de la MDSA sur les lignées cellulaires cancéreuses H1299 et MCF-7 (Figs. 5e – n et S13e – n, respectivement). Il était évident que l'EA induisait des changements OCR dans les cellules H1299 (Fig. 5e), comme indiqué par une diminution de la respiration basale et maximale (Fig. 5f, g, respectivement), de la production d'ATP (Fig. 5h) et de la respiration de réserve. capacité (Fig. 5i). La MDSA a induit des altérations OCR similaires dans les cellules H1299 en tant qu'EA (Fig. 5j), comme en témoigne une diminution de la respiration basale et maximale et de la production d'ATP (Fig. 5k – m, respectivement), mais pas la capacité respiratoire de réserve (Fig. 5n ). Les cellules MCF-7, contrairement aux cellules H1299, n'étaient pas sensibles à l'EA ou à la MDSA en réponse à l'OCR (Fig. S13e, j, respectivement); la respiration basale et maximale, la production d'ATP et la capacité respiratoire de réserve n'ont pas été modifiées par le traitement avec EA ou MDSA (Fig. S13f – i et S13k – n, respectivement); cette découverte correspondait au fait que les cellules MCF-7 ne répondaient pas au métabolisme dirigé par ME2 avec EA ou MDSA (Fig. S13a – d).

Nous avons étudié les effets de l'EA ou du MDSA sur la migration et l'invasion des cellules cancéreuses H1299 et MCF-7 (Fig. 7 et S15). Le test de cicatrisation des plaies a révélé que l'EA et le MDSA peuvent inhiber la migration des cellules H1299 (Fig. 7a et S15a, respectivement). Le taux de cicatrisation relatif des cellules H1299 traitées à l'EA ou au MDSA était plus lent que celui des cellules non traitées (figures 7b, c, respectivement). En revanche, l'EA et la MDSA ne peuvent pas inhiber la migration des cellules MCF-7 (Figs. 7d et S15b, respectivement). Des taux de cicatrisation similaires ont été observés entre les cellules MCF-7 traitées à l'EA ou au MDSA et les cellules non traitées (Fig. 7e, f, respectivement).

a Migration cellulaire (essai de cicatrisation) de cellules H1299 avec EA. b Analyse quantitative des taux relatifs de cicatrisation des plaies des cellules H1299 en l'absence ou en présence d'EA. N = 3. Test t de Student non apparié. *p < 0,05. c Analyse quantitative des taux relatifs de cicatrisation des plaies des cellules H1299 en l'absence ou en présence de MDSA. N = 4. Test t de Student non apparié. **p < 0,01. d Essai de cicatrisation des cellules MCF-7 avec EA. e Analyse quantitative des taux relatifs de cicatrisation des plaies des cellules MCF-7 en l'absence ou en présence d'EA. N = 4. Test t de Student non apparié. ns, aucune signification statistique. f Analyse quantitative des taux relatifs de cicatrisation des plaies des cellules MCF-7 en l'absence ou en présence de MDSA. N = 4. Test t de Student non apparié. ns, aucune signification statistique. g Invasion cellulaire des cellules H1299 avec EA. h Modifications du pli des cellules H1299 invasives en l'absence ou en présence d'EA. N = 3. Test t de Student non apparié. *p < 0,05. i Pliez les modifications des cellules H1299 invasives en l'absence ou en présence de MDSA. N = 3. Test t de Student non apparié. *p < 0,05. j Invasion cellulaire des cellules MCF-7 avec EA. k Pliez les modifications des cellules MCF-7 invasives en l'absence ou en présence d'EA. N = 3. Test t de Student non apparié. ns, aucune signification statistique. l Modifications du pli des cellules MCF-7 invasives en l'absence ou en présence de MDSA. N = 4. Test t de Student non apparié. ns, aucune signification statistique. Les barres d'erreur sont moyennes ± SD.

Le test d'invasion a démontré que l'EA et le MDSA peuvent inhiber l'invasion cellulaire des cellules H1299 (Fig. 7g et S15c, respectivement). Les changements de pli des cellules invasives dans les cellules H1299 traitées à l'EA ou au MDSA étaient inférieurs à ceux des cellules non traitées (Fig. 7h, 7i, respectivement). Cependant, ni l'EA ni le MDSA n'inhibent l'invasion des cellules MCF-7 (Fig. 7j et S15d, respectivement). Le nombre de cellules invasives dans les cellules MCF-7 n'a pas changé considérablement après le traitement avec EA ou MDSA (Figs. 7k, l, respectivement). En conclusion, l'EA ou la MDSA inhibent le métabolisme associé au ME2, en particulier le métabolisme énergétique, ce qui suggère que l'inhibition de la migration cellulaire et de l'invasion par l'EA ou la MDSA pourrait être attribuable à la suppression de la production d'énergie dans les cellules cancéreuses.

ME2 a été cristallisé sous des formes ouvertes et fermées avec divers ligands associés au centre actif, au site allostérique et au site exo10,11,42,43. Notre laboratoire a précédemment déterminé les structures cristallines de ME2, révélant que la structure du mutant ME2_R67Q était une "forme morte" inactivante de l'enzyme, alors que la structure de ME2_R484W était une "forme fermée" suractivante44. De plus, ME2 est un dimère de dimères, chaque monomère comprenant quatre domaines distincts (domaines A, B, C et D). Le domaine A (résidus 23 à 130) est impliqué dans la tétramérisation ainsi que dans la catalyse. Un fumarate activateur allostérique est lié à l'interface dimère de ME2 qui contient le domaine A. Des mutations dans le site de liaison du fumarate et le domaine A entraînent fréquemment l'inactivation de l'enzyme44.

Dans cet article, nous rapportons que trois structures cryo-EM de ME2 : une forme ouverte de complexe binaire ME2 ne contenant que du NAD+ (Fig. 8a) et deux complexes ternaires ME2 contenant soit EA soit MDSA et NAD+ (ME2-EA-NAD+ ou ME2 complexes -MDSA-NAD+ ; figures 8b, c, respectivement). Sur la base de ces structures cryo-EM, nous pouvons conclure que l'EA et la MDSA sont des inhibiteurs allostériques plutôt que des inhibiteurs du site actif, car ils se lient à l'interface dimère près du site de liaison au fumarate de ME2 (Fig. 1), et la liaison de EA ou MDSA empêche ME2 de basculer entre ses formes ouverte et fermée, inhibant ainsi son activité. L'EA et la MDSA ont des modes de liaison uniques qui chevauchent le mode de liaison du fumarate sur ce site allostérique (Fig. 2). Le fumarate, un activateur allostérique, peut largement augmenter l'activité de ME2 en abaissant K0,5, malate et Km, NAD, améliorant ainsi l'affinité de ME2 pour ses substrats (Fig. 8d et Tableau S3). Contrairement à la liaison du fumarate, qui peut inciter ME2 à passer de la forme ouverte à la forme fermée, la liaison EA ou MDSA empêche cependant ME2 de passer de la forme ouverte à la forme fermée (Figs. 8b, c), inhibant ainsi l'activité enzymatique de ME2. Ainsi, malgré l'ajout de pyruvate, Mg2+, NAD+ et EA (ou MDSA) lors de la préparation de l'échantillon cryo-EM, nous n'avons pas obtenu de complexe pentanaire ME2 avec pyruvate, NAD+, Mg2+ et EA (ou MDSA). Cela peut être dû au fait que la liaison de l'EA ou de la MDSA verrouille la conformation ME2, rendant le site actif inadapté à la liaison du pyruvate et du Mg2+. L'inhibition de ME2 par EA ou MDSA est réversible et le fumarate peut restaurer l'activité ME2 qui a été inhibée par EA ou MDSA en entrant en compétition pour le site allostérique à l'interface dimère (Fig. 8b, d)44. L'activité ME2 convertit le L-malate en pyruvate, qui entre dans le cycle de l'acide tricarboxylique (TCA) et produit ensuite de l'ATP via la chaîne respiratoire ; ainsi, lorsque [ATP] est augmenté, l'activité ME2 est inhibée (Fig. 8e).

a Le complexe binaire ME2-NAD+ présente une forme ouverte inactive. b Les complexes ternaires ME2-NAD+-EA et c ME2-NAD+-MDSA présentent également une forme ouverte inactive. L'EA ou la MDSA peuvent se lier au site allostérique à l'interface du dimère, inhibant l'activité de ME2 en inhibant la liaison des substrats de ME2 et en stabilisant ainsi ME2 sous une forme ouverte inactive. d Le complexe pentanaire ME2-NAD+-PYR-Mn2+-FUM (code PDB : 1PJ3) présente une forme fermée active, et e Le complexe pentanaire ME2-ATP-MAL-Mn2+-FUM (code PDB : 1PJ4) présente une forme fermée inactive . Afin d'activer l'activité ME2, le fumarate peut se lier au site allostérique à l'interface dimère, ce qui favorise la liaison des substrats ME2 et stabilise ainsi ME2 sous une forme fermée pleinement active. Cependant, lorsque le niveau d'ATP cellulaire est augmenté, l'ATP peut entrer en compétition avec le NAD+ pour se lier au site actif et à l'exo-site, inhiber l'activité de ME2 et maintenir ME2 dans un état fermé inactif. FUM fumarate, PYR pyruvate.

Le mécanisme de régulation de ME2 est assez similaire à celui de la phosphofructokinase (FPK), malgré le fait que les deux enzymes sont localisées à des endroits différents ; ME2 est localisé dans les mitochondries, tandis que PFK est localisé dans le cytosol (Fig. 9a). De diverses conditions physiologiques, l'ATP est l'inhibiteur allostérique le plus efficace de ME2 et de PFK. La glycolyse génère de l'ATP cytosolique; lorsque les niveaux d'ATP sont élevés, l'ATP inhibe la PFK, ralentissant ainsi la glycolyse. La PFK est inactive à moins que la cellule ne produise du fructose-2,6-bisphosphate, son activateur allostérique qui est lié à la PFK et l'active pour initier la glycolyse. Lorsque [ATP] est épuisé, le fructose-2,6-bisphosphate est lié à PFK pour réactiver l'enzyme en abaissant le Km des substrats de PFK, suivi du redémarrage de la glycolyse. De même, lorsque les niveaux d'ATP mitochondrial augmentent, l'ATP inhibe ME2, diminuant ainsi la production de pyruvate (Fig. 8e). ME2 est également inactif jusqu'à ce que la cellule produise ses activateurs allostériques, le fumarate, qui est lié à ME2 et l'active pour générer du pyruvate mitochondrial (Fig. 8d). ME2 peut être impliqué dans la glutaminolyse, et la réaction ME2 produit du pyruvate mitochondrial, qui est ensuite converti en acétyl-CoA, qui est ensuite utilisé pour générer de l'ATP supplémentaire via le cycle TCA et la phosphorylation oxydative médiée par la chaîne de transport d'électrons (Fig. 9a). Le fumarate est un composant du cycle du TCA. Lorsque [ATP] est épuisé, le fumarate se lie à ME2 et le réactive (Figs. 8d, e), réintroduisant NAD + dans le site actif et produisant finalement du pyruvate pour la synthèse d'ATP. Ainsi, ME2 et PFK sont des enzymes de détection d'énergie dont l'activité est régulée par l'état énergétique de la cellule. ME1 n'est pas régulé par l'ATP, ce qui indique qu'il ne s'agit pas d'une enzyme de détection d'énergie.

a Un lien entre la réaction catalysée par ME2, le cycle de l'acide tricarboxylique (TCA) et la phosphorylation oxydative médiée par la chaîne de transport d'électrons. b Modifications métaboliques induites par ME2 dans les cellules en régulant positivement ou négativement ME2 et en traitant avec les inhibiteurs allostériques ME2 EA et MDSA.

Le pyruvate peut être obtenu à partir de deux sources : le pyruvate dérivé du glucose du cytosol et la conversion catalysée par ME2 du L-malate mitochondrial en pyruvate. Le L-malate peut être produit dans les mitochondries par la glutaminolyse, la transamination ou la navette malate-aspartate, entre autres processus (Fig. 9a). La surexpression de ME2 entraîne une augmentation des niveaux de pyruvate, de NADH et d'ATP, ainsi qu'une diminution du rapport NAD + / NADH, indiquant que ME2 est essentiel au métabolisme énergétique (Fig. 9b). L'augmentation de l'activité de ME2 dans les mitochondries augmente le niveau de NADPH afin de contrecarrer la production de ROS, qui représente une fonction unique de ME2 dans les mitochondries, alors que PFK dans le cytosol manque de capacité antioxydante (Fig. 9). Le silence de ME2, en revanche, entraîne une diminution des niveaux de pyruvate et de NADH, ainsi qu'une augmentation du rapport NAD+/NADH, par rapport au groupe témoin. La réduction des niveaux de NADPH entraîne une augmentation de la production de ROS (Fig. 9b). Mécaniquement, le silence de ME2 entraîne une diminution de la production d'ATP, de la respiration basale et maximale, ainsi que de la capacité respiratoire de réserve dans la cellule, indiquant que les réactions catalysées par ME2 sont cruciales pour la respiration cellulaire et la phosphorylation oxydative, comme le démontrent les résultats de cette étude (Figs. 4–6).

Ici, nous avons rapporté la découverte de deux inhibiteurs allostériques de ME2, EA et MDSA, capables d'inhiber l'activité de ME2 et ainsi de diminuer la production de pyruvate cellulaire, de NADH et d'ATP. Le traitement avec EA ou MDSA entraîne une diminution de la respiration cellulaire et de la phosphorylation oxydative dans la cellule (Fig. 9b). Le traitement à l'EA ou au MDSA a également pour effet supplémentaire de diminuer la production de NADPH, ce qui augmente le niveau de ROS dans la cellule, ce qui peut entraîner la mort cellulaire. En d'autres termes, la capacité antioxydante de ME2 est supprimée par l'EA et le MDSA, ce qui entraîne une diminution du NADPH et une augmentation des ROS. Par conséquent, ME2 a deux fonctions dans les mitochondries : la première produit du pyruvate et du NADH pour générer de l'ATP par phosphorylation oxydative, et la seconde génère du NADPH pour contrer les ROS.

ME1, contrairement à ME2, n'a pas de site allostérique et n'a pas de double spécificité de cofacteur ; au lieu de cela, il utilise uniquement NADP+ comme cofacteur. Par conséquent, il est compréhensible que ME2 était plus sensible à l'inhibition par EA ou MDSA que ME1 in vitro (Fig. S1a). Parce qu'il a été découvert que l'EA ou la MDSA se lie à ME2 au niveau du site allostérique, il est possible que le site cible de l'EA ou de la MDSA dans ME1 soit situé au site actif. Ceci est avantageux en termes de spécificité pour l'inhibition allostérique de ME2 par EA ou MDSA. Cela implique également que la diminution de la production d'ATP dérivée du malate est due à l'inhibition de ME2 induite par l'EA ou la MDSA. De plus, bien que le traitement à l'EA et au MDSA ait réduit la production de pyruvate, cela a été accompli principalement par inhibition de l'activité ME2, plutôt que par inhibition de la glycolyse, qui est la principale voie de production de pyruvate. Comme en témoigne le fait que les niveaux de PEP et de glucose n'ont pas changé à la suite du traitement (Fig. S14), l'inhibition de ME2 par l'EA ou la MDSA n'altère pas la glycolyse.

ME2 a longtemps été soupçonné d'être un oncogène, mais aucun inhibiteur à petite molécule ne s'est avéré efficace pour inhiber l'activité de ME2 et provoquer la mort cellulaire. Nous avons précédemment démontré que l'EA peut induire une sénescence cellulaire dans la lignée cellulaire H1299, qui est une cellule d'adénocarcinome pulmonaire41. L'EA et le MDSA sont efficaces pour inhiber l'activité de ME2 à des concentrations submicromolaires, mais les cellules nécessitent des concentrations micromolaires pour empêcher le pyruvate et le métabolisme énergétique induits par ME2. En conséquence, l'optimisation de l'absorption de l'EA et de la MDSA dans les cellules est une première priorité pour la recherche future sur les maladies associées au ME2.

La protéine ME2 humaine a été exprimée dans la coloration Escherichia coli BL21 en utilisant le vecteur PRH281 sous le contrôle du promoteur trp, qui a été induit avec l'acide indol-3-acétique (IAA). ME2 a été purifié par chromatographie d'affinité ATP agarose (Sigma, St Louis, MO, USA). La protéine ME1 humaine a été exprimée dans Escherichia coli BL21(DE3) en utilisant le vecteur pET21b sous le contrôle du promoteur T7, qui a été induit avec l'isopropyl-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). ME1 a été purifié par chromatographie d'affinité Ni-NTA agarose (Sigma, St Louis, MO, USA). À l'aide d'un dispositif Amicon®Ultra-15 à coupure de 30 KDa, les enzymes maliques purifiées ont été dialysées et concentrées contre un tampon de stockage contenant du Tris-HCl 30 mM (pH 7,4) et du mercaptoéthanol 2 mM (Merck Millipore, Billerica, MA, USA). La pureté de la protéine a été déterminée à l'aide de SDS-PAGE, et la concentration de la protéine a été déterminée à l'aide d'un tampon de dosage de protéines commercial (Bio-Rad lab, Inc., Hercules, CA, USA) basé sur la méthode de Bradford, et l'absorbance à 595 nm a été détecté à l'aide d'un lecteur de microplaques multimode Biotek® (Agilent, Santa Clara, CA, USA).

L'inhibition de ME2 a été déterminée en titrant EA ou MDSA de 0 à 40 μM dans un tampon de réaction contenant 50 mM de Tris-HCl (7,4), 40 mM de L-malate, 2 mM de NAD+ et 10 mM de MgCl2 ; L'inhibition de ME1 a été déterminée dans un tampon de réaction contenant du Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), du L-malate 15 mM, du NADP+ 0,2 mM et du MgCl2 10 mM. L'inhibition des dérivés d'acide disalicylique et naphtoïque contre ME2 a été déterminée en titrant une gamme de concentrations d'inhibiteurs (0 à 500 μM) tout en maintenant les substrats de ME2 à 40 mM de L-malate, 2 mM de NAD+ et 10 mM de MgCl2. Pour obtenir la valeur IC50, la courbe d'inhibition peut être calculée à l'aide de l'équation suivante :

où A désigne la concentration en inhibiteur. L'activité enzymatique résiduelle (%) est normalisée à l'aide de la courbe du maximum (100 %) au minimum (0 %). La pente de la courbe en son milieu s'appelle la pente. La valeur IC50 indique la concentration d'inhibiteur qui inhibe 50 % de l'activité de l'enzyme. Prism 8.0 a été utilisé pour effectuer tous les calculs (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Le plasmide pRH281-ME2 a été amplifié à l'aide d'amorces mutagènes (tableau S4) pendant 16 à 18 thermocycles avec une ADN polymérase haute fidélité pfuUltra (Agilent, Santa Clara, Californie, États-Unis). Après digestion avec l'enzyme de restriction DpnI (TaKaRa, Shiga, Japon) pour éliminer le plasmide matrice de type sauvage, les produits d'ADN ont été transformés dans Escherichia coli XL-10. Enfin, l'autoséquençage a été utilisé pour identifier les mutants uniques ME2.

Les échantillons Cryo-EM ont été préparés à l'aide d'un Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) réglé sur 4 ° C et 100% d'humidité. Une solution d'échantillons purifiés (ME2, ME2-EA ou ME2-MDSA sans inhibiteur) a été appliquée dans une aliquote (3,5 μl) à une grille de carbone trouée Quantifoil R1.2/1.3 à décharge luminescente (Quatifoil GmbH, Allemagne). Après une attente de dix secondes, les grilles ont été tamponnées avec du papier filtre et immédiatement immergées dans de l'éthane liquide refroidi à l'azote liquide. Les grilles ont été buvardées pendant 3,0 s avec une force de buvardage de 0 pour le complexe ME2-EA (1 mg/ml) et le complexe ME2-MDSA (0,5 mg/ml). Dans le cas de ME2 (1 mg/ml) sans inhibiteur, la grille a été buvardée pendant 3,5 s avec une force de buvardage de 5. Les grilles cryo-EM ont ensuite été vitrifiées et stockées dans de l'azote liquide jusqu'à l'imagerie.

Pour commencer, les grilles cryo-EM ont été inspectées à l'aide d'un microscope électronique à transmission Talos Arctica de 200 kV équipé d'un détecteur Falcon III (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Les images ont été capturées en mode linéaire à un grossissement nominal de 92 000 ×, ce qui correspond à une taille de pixel de 1,1 Å/pixel et un réglage de défocalisation de -3,0 μm. Des grilles cryo-EM appropriées ont été stockées et récupérées dans de l'azote liquide jusqu'à ce que les données soient collectées à l'aide du microscope électronique à transmission Titan Krios (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). L'ensemble de données à haute résolution a été collecté automatiquement sur un Titan Krios de 300 kV (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) équipé d'une source d'électrons X-FEG à l'aide du logiciel EPU-2.7.0. Pour les complexes ME2-EA et ME2-MDSA, les données ont été collectées à l'aide d'un détecteur K2 Summit en mode comptage (lentille canon 4, taille de spot 6, ouverture C2 50 μm) équipé de filtres GIF Bio-Quantum Energy de Gatan. Les piles de films bruts ont été capturées à un grossissement nominal de 165 000 ×, ce qui correspond à une taille de pixel de 0,82 Å/pixel. La plage de défocalisation a été définie sur -1,5 à -2,25 μm et la largeur de fente des filtres d'énergie a été définie sur 20 eV. Soixante images de piles tiff non normalisées en gain ont été enregistrées à un débit de dose d'environ 11 e-/Å2 par seconde pour un temps d'exposition total de 4,5 s, résultant en une dose cumulée d'environ 50 e-/Å2 (~ 0,83 e- /Å2 par image). Comme pour ME2, les données ont été collectées à l'aide du détecteur K3 Summit (équipé de filtres GIF Bio-Quantum Energy, Gatan) en mode super-résolution (lentille de canon 4, taille de spot 5, ouverture C2 50 μm). Les piles de films bruts ont été capturées à un grossissement nominal de 81 000 ×, ce qui correspond à une taille de pixel de 1,061 (super-résolution 0,5305 Å/pixel). La plage de défocalisation a été définie sur -1,5 à -2,5 μm et la largeur de fente des filtres d'énergie a été définie sur 20 eV. Quarante images de piles tiff non normalisées en gain ont été enregistrées à un débit de dose d'environ 14 e-/Å2 par seconde pour un temps d'exposition total de 2,8 s, résultant en une dose cumulée d'environ 40 e-/Å2 (~ 1 e- /Å2 par image). Les paramètres utilisés pour acquérir les données cryo-EM sont résumés dans le tableau supplémentaire S2.

Toutes les piles d'images ME2-EA ou ME2-MDSA acquises en mode comptage ont été importées dans Relion pour la correction de mouvement et la pondération de dose à l'aide de MotionCor246 avec un patch 5 × 5 sans binning (résultant en une taille de pixel de 0,82 Å /pixel). MotionCor246 a été utilisé pour corriger le mouvement et doser les piles d'images ME2 sans inhibiteur en mode super-résolution à l'aide d'un patch 5 × 5 et d'un regroupement double (résultant en une taille de pixel de 0,83 Å/pixel). La fonction de transfert de contraste (CTF) a été calculée à partir des images à l'aide de CTFFIND4.1 après correction du mouvement et pondération de la dose47. Toutes les particules ont été extraites semi-automatiquement à l'aide de cisTEM48, et les coordonnées des particules sélectionnées ont ensuite été importées dans Relion 3.049 pour l'extraction des particules en utilisant une taille de boîte de 384 pixels (pour les complexes ME2-EA et ME2-MDSA) et 256 pixels (pour les complexes sans inhibiteur). ME2). Plusieurs cycles de classification 2D dans Relion 3.049 ont été utilisés pour éliminer les moyennes de classe 2D insatisfaisantes, suivis de la sélection et de l'extraction des particules. Les particules classées lors du dernier tour de classification 2D ont été transférées vers cryoSPARC50 pour la génération de cartes ab initio. Après cela, les cartes ab initio ont été importées dans Relion49 et utilisées comme références de départ pour la classification 3D (séparées en 3 classes). L'auto-raffinement 3D avec symétrie D2 a été utilisé pour affiner les belles classes 3D. Après raffinement CTF et polissage bayésien, les particules brillantes polies ont été importées dans cryoSPARC50 pour une classification 2D supplémentaire et un raffinement hétérogène 3D sans imposer de symétrie (C1). Après un raffinement homogène et non uniforme avec une symétrie D2, les particules appartenant aux classes 3D fines ont été raffinées à une résolution plus élevée. Dans cryoSPARC, la carte a été affinée et la résolution estimée50. La résolution globale a été déterminée à l'aide du critère Fourier Shell Correlation (FSC) = 0,143, tandis que la résolution locale a également été déterminée à l'aide de cryoSPARC50. UCSF Chimera a été utilisé pour visualiser des cartes de densité 3D51. La figure S2 résume les détails de la reconstruction cryo-EM. Les procédures de traitement d'images à une seule particule sont résumées dans les Fig. S3–S5. Le tableau S2 résume les données statistiques pour les reconstructions cryo-EM.

Construire les modèles atomiques pour les cartes cryo-EM de ME2 sans inhibiteur (2,72 Å), ME2-EA (2,72 Å) et ME2-MDSA (2,84 Å), la structure atomique de ME2 humain (APB ID : 1QR6) était rigidement intégré dans les cartes cryo-EM. Les différences de conformation ont été ajustées manuellement dans le programme COOT52 à l'aide des fonctions "Real Space Refinement Zone" de l'utilitaire "Model/Fit/Refine" avec les contraintes "Torsion", "Plannar Peptide", "Trans Peptide" et "Ramachandran". . La fonction PHENIX "Real-space raffinement" a ensuite été utilisée pour optimiser davantage le modèle atomique53, qui comprenait le modèle atomique d'entrée, la carte cryo-EM et la valve de résolution estimée à l'aide du FSC de référence. Suite à une inspection visuelle dans COOT du modèle atomique optimisé PHENIX, les régions problématiques et les valeurs aberrantes de Ramachandran ont été corrigées manuellement à l'aide de la "Zone de raffinement de l'espace réel". De nombreuses exécutions de "raffinement dans l'espace réel" du modèle atomique dans COOT et PHENIX ont été effectuées jusqu'à ce qu'aucune amélioration supplémentaire ne soit obtenue. Nous n'avons pas modélisé les résidus avec une densité manquante aux extrémités N et C. La partie du groupement mononucléotide nicotinamide (NMN) de la densité électronique du NAD + est mal résolue, nous avons donc modélisé cette région principalement sur la base des contraintes géométriques. Intéressant, une partie de la densité de MDSA est relativement disparue dans la carte de netteté. Pour la modélisation MDSA, une partie de la densité MDSA est perdue dans la carte affinée mais peut être observée dans la carte non affinée (Fig. S16). La densité électronique de la demi-molécule de MDSA faisant face au site de liaison est moins bien définie que la demi-molécule du site de liaison. Nous avons d'abord placé la moitié de la MDSA dans le site de liaison en fonction de la densité bien définie et l'autre moitié en fonction des contraintes chimiques et de la densité traçable à partir de la carte non façonnée. Il convient de mentionner que la densité moins bien définie a disparu dans la carte affinée suggérant un facteur B différent au sein de la MDSA et que la moitié faisant face au site de liaison est plus flexible. La fonction "Comprehensive validation (cryo-EM)" de PHENIX a été utilisée pour valider le modèle atomique. Le tableau S2 résume les statistiques de validation.

Des cellules 293 de rein embryonnaire humain (HEK293T) ont été achetées chez Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA); deux cellules de fibroblastes pulmonaires fœtaux humains (HFL-1 et MRC-5) et des cellules d'adénocarcinome mammaire humain (MCF-7) ont été achetées auprès de Bioresource Collection and Research Center (BCRC, Hsinchu, Taiwan). La lignée cellulaire de cancer du poumon humain non à petites cellules H1299 a été acquise auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Les cellules HEK293T, HFL-1, MRC-5 et MCF-7 ont été cultivées dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) (HyCloneTM, Cytiva, Marlborough, MA, USA) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS ; Sigma, St Louis , MO, États-Unis) et 1 % de pénicilline/streptomycine ; la cellule H1299 a été cultivée dans du RPMI (HyCloneTM, Cytiva, Marlborough, MA, USA) contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine. Toutes les lignées cellulaires ont été incubées à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO2.

Environ 70% de cellules HEK293T confluentes (1 × 106 cellules) sur une boîte de 6 cm ont été transfectées avec pcDNA3.1-empty (vecteur squelette) et pcDNA3.1-ME2 par un réactif de transfection TransIT-X2® (Mirus Bio LLC, WI , USA) avec du milieu opti-MEMTM (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, Waltham, MA, USA) pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2. Le pcDNA3.1-vide (plasmide #52535) a été acheté chez Addgene (Cambridge, MA, USA) et le pcDNA3.1-ME2 a été construit en insérant le gène ME2 dans le vecteur. L'immunoblot a été utilisé pour déterminer le niveau d'expression de ME2 dans la cellule.

La particule de transfection lentivirale a été utilisée pour délivrer le vecteur lentiviral pLKO_005 avec un ARN en épingle à cheveux court (shRNA). Les vecteurs de contrôle pLKO-shCon (TRC2.Void, ASN0000000001) et pLKO-shME2 (TRCN0000294007) ont été obtenus auprès du National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taipei, Taiwan) et les séquences en épingle à cheveux de shRNA étaient les suivantes : shCon, 5′ -CCGGAGTTCAGTTACGATATCATGTCTCGAGACATTCGCGAGTAACTGAACTTTTTT-3′ ; shME2 : 5′- CCGGAGTTCTTACAGAGCTACTAAACTCGAGTTTAGTAGCTCTGTAAGAACTTTTTTG-3′. Sur des plaques à 6 puits, environ 30 % de cellules HEK293T confluentes (3 × 105 cellules/puits) ont été traitées pendant 48 h avec une solution de particules lentivirales à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2. La puromycine (3 μg/ml) a été utilisée pour éliminer les cellules non transfectées. En utilisant l'immunotransfert, le niveau d'expression de ME2 dans la cellule a été déterminé.

Les concentrations de pyruvate cellulaire et de NADPH ont été déterminées par le kit de dosage colorimétrique/fluorométrique du pyruvate et le kit de dosage fluorométrique PicoProbe™ NADPH Quantification, respectivement (K609-100 et K349-100 ; BioVision, Milpitas, CA, USA). Sur des plaques de 6 cm, HEK293T (1,5 × 106 cellules), MRC-5 (3 × 105 cellules), HFL-1 (3 × 105 cellules) et H1299 (3 × 105 cellules) et MCF-7 (6 × 105 cellules) ont été cultivées pendant 24 h dans un milieu contenant 20 mM de L-malate à 37 °C avec 5 % de CO2. Les cellules ont été traitées avec EA ou MDSA pendant 48 h. Après la récolte, les cellules ont été soniquées dans 100 µL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Après centrifugation, le surnageant a été déprotéiné à l'aide d'une colonne de centrifugation de 10 kDa (filtre seringue Acrodisc®, Pall Life Sciences) et analysé à l'aide de mélanges de travail dans une plaque à 96 puits avec le lecteur de microplaques multimode Biotek® pour détecter la fluorescence à Ex/Em = 535/587 nm (Agilent, Santa Clara, Californie, États-Unis).

Les niveaux de NAD+ et NADH ont été déterminés à l'aide du test NAD/NADH-GloTM (G9071 ; Promega, Madison, WI, USA). Sur des plaques de 6 cm, HEK293T (1,5 × 106 cellules), HFL-1 (3 × 105 cellules) et MRC-5 (3 × 105 cellules) ont été traités pendant 48 h avec 25 µM EA ou MDSA à 37 °C avec 5 %CO2. HEK293T (2 × 106 cellules dans 100 µL de PBS), HFL-1 et MRC-5 (2 × 105 cellules dans 100 µL de PBS) ont été soniquées et les surnageants ont été déprotéinés à l'aide de la colonne de centrifugation de 10 kDa (filtre seringue Acrodisc®, Pall Sciences de la vie). Les surnageants (2 × 104 cellules dans 100 µL de PBS) ont été mélangés avec un volume égal de réactif de détection dans une plaque à 96 puits, et les niveaux de NAD+ et NADH ont été déterminés à l'aide des signaux luminescents du lecteur de microplaques multimode Biotek® (Agilent, Santa Clara, Californie, États-Unis).

Sur des plaques de 6 cm, HEK293T (1,5 × 106 cellules), HFL-1 (3 × 105 cellules) et MRC-5 (3 × 105 cellules) ont été traités avec 25 µM EA ou MDSA à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 48 h. H1299 (3 × 105 cellules) et MCF-7 (6 × 105 cellules) ont été traités avec 150 µM d'EA ou de MDSA à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 48 h. La teneur en ATP des cellules a été déterminée à l'aide d'un test de viabilité cellulaire CellTiter-Glo® 2.0 (G9242; Promega, Madison, WI, USA). 2 × 104 cellules ont été remises en suspension dans 100 µL de PBS et mises à réagir avec un volume égal de tampon de dosage. La luminescence a été détectée à l'aide du lecteur de microplaques multimode Biotek® (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Les niveaux de ROS intracellulaires ont été déterminés à l'aide d'un kit de test de détection de ROS (ab287839 ; Abcam, Cambridge, Royaume-Uni). 1,5 × 105 cellules ont été incubées pendant 45 min à 37 ° C dans l'obscurité avec un tampon ROS dilué. Après un lavage avec du tampon PBS, les cellules ont été remises en suspension dans le tampon ROS de 150 µL et la fluorescence à Ex/Em = 495/529 nm a été détectée avec le lecteur de microplaques multimode Biotek® (Agilent, Santa Clara, CA, ETATS-UNIS).

Les cellules HEK293T (3,75 × 104 cellules), H1299 (1,75 × 104 cellules) et MCF-7 (2,8 × 104 cellules) ont été ensemencées et incubées dans des microplaques de culture cellulaire Agilent Seahorse XF24 pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO2. Les cellules HEK293T ont ensuite été exposées à 0, 25 et 50 µM d'EA et de MDSA pendant 4 h, tandis que les cellules H1299 et MCF-7 ont été exposées à 0, 75 et 150 µM d'EA et de MDSA pendant 3 h. Après 30 min d'incubation à 37 °C dans un incubateur sans CO2, le milieu de croissance a été remplacé par un milieu de base (Agilent, Santa Clara, CA, USA) contenant 1 mM de pyruvate, 4 mM de glutamine et 1 mg/mL D -glucose. Pendant un intervalle de temps de 24 minutes, les cellules ont été traitées séquentiellement avec 5 µM d'oligomycine A, 2 µM de FCCP et 1 µM de ronstone/antinomycine A. Le taux de consommation d'oxygène (OCR) a été déterminé à l'aide d'un analyseur Seahorse XFe24 en conjonction avec le Seahorse XF Cell Mito Stress Test (Agilent, Santa Clara, Californie, États-Unis). Les données expérimentales ont été analysées à l'aide du programme de contrôle Wave2.6 (Agilent, Santa Clara, CA, USA).

Le mélange réactionnel pour l'activité enzymatique ME2 était composé de 10 mM de MgCl2, 40 mM de L-malate et 2 mM de NAD+ dans 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4). Les valeurs de K0,5,malate et Km,NAD ont été déterminées en titrant une gamme de concentrations de L-malate et NAD+, respectivement, tout en maintenant des niveaux saturés d'autres composés. Un spectrophotomètre UV/VIS (Lambda 25, Perkin Elmer, MA, USA) a été utilisé pour surveiller l'activité enzymatique en traçant en continu les augmentations de NADH, qui a une absorbance notable à 340 nm. L'équation de Michaelis-Menten a été utilisée pour déterminer la valeur de Km,NAD, et le coefficient d'extinction de 6,22 mM-1 cm-1 a été utilisé pour déterminer la valeur de kcat. L'équation suivante a été utilisée pour calculer la coopérativité du L-malate :

où v désigne la vitesse initiale, Vmax désigne la vitesse maximale de la réaction, K0,5 désigne la concentration de substrat à une vitesse demi-maximale et h désigne le coefficient de colline, qui signifie le degré de coopérativité. Prism 8.0 a été utilisé pour effectuer tous les calculs (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). L'activation du fumarate a été déterminée en titrant une gamme de concentrations de fumarate (0 à 6 mM) tout en maintenant 15 mM de L-malate, 1 mM de NAD+ et 10 mM de MgCl2.

Les cellules ont été lysées avec du tampon de lyse RIPA (Promega, Waltham, MA, USA). La concentration en protéines des surnageants a été déterminée en utilisant la méthode de Bradford après homogénéisation et centrifugation. Les surnageants (50 μg) ont été séparés par SDS-PAGE et transférés sur la membrane de transfert PVDF. Le PVDF a été bloqué avec un tampon de blocage et incubé pendant 24 h à 4 °C avec des anticorps anti-ME2 humains personnalisés (0,5 μg/ml) (MDbio Inc., Taipei, Taiwan) et des anticorps anti-actine (1 μg/ml) ( Arigo Biolaboratories, Hsinchu, Taiwan), suivie d'une heure à 25 °C avec le deuxième anticorps marqué à la peroxydase de raifort. Enfin, les anticorps marqués ont réagi avec un tampon de chimiluminescence amélioré et la luminescence a été détectée à l'aide d'un mini imageur ImageQuantTM LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ).

Le nombre relatif de cellules viables dans une population a été déterminé à l'aide du test de viabilité cellulaire CellTiter-Fluor™ (G6080, Promega, Madison, WI, USA). Sur des plaques à 96 puits, 1 × 104 cellules ont été ensemencées et incubées pendant 24 h dans 100 µL de milieu. Pendant 24 h supplémentaires, les cellules ont été traitées avec diverses concentrations d'EA et de MDSA. Après avoir remplacé 50 µL de milieu par 50 µL de réactif de dosage dans chaque puits, les cellules ont été incubées pendant 30 min à 37 °C avec 5 % de CO2. La viabilité des cellules a été déterminée à l'aide du lecteur de microplaques multimode Biotek® réglé sur Ex/Em = 490/505 nm (Agilent, Santa Clara, CA, USA).

La structure secondaire de la protéine ME2 a été déterminée à l'aide d'un spectropolarimètre à dichroïsme circulaire (CD) Jasco J-815 (Jasco Deutschland GmbH, Pfungstadt, Allemagne). Des échantillons de protéines (0,3 mg/mL) dans du Tris-acétate 30 mM (pH 7,4) ont été détectés à l'aide d'une cuvette en quartz avec une longueur de trajet de 0,1 cm, et les données des spectres CD ont été recueillies par incréments de 0,2 nm entre 190 et 260 nm. Chaque spectre de CD a été déterminé en utilisant une moyenne de dix balayages individuels et normalisé à la concentration de l'échantillon.

Environ 70 % de cellules HEK293T confluentes (3 × 106 cellules) ont été traitées pendant 48 h avec 50 µM d'EA et de MDSA à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2. 4 mL de méthanol à 80 % (vol/vol) ont été utilisés pour extraire les métabolites cellulaires des cellules. Après déprotéinisation avec la colonne de centrifugation de 10 kDa (filtre seringue Acrodisc®, Pall Life Sciences), la concentration de la solution d'extraction a été normalisée par rapport à la concentration d'ADN ou de protéine. La solution d'extraction de métabolites a été évaporée à l'aide d'un évaporateur d'azote pour éliminer le méthanol et remise en suspension dans de l'acétonitrile (ACN) à une concentration de 20 % (vol/vol). Les expériences de chromatographie liquide ont été menées sur un système VanquishTM LC (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) équipé d'une colonne Cogent Diamond-HydrideTM (150 × 2,1 mm, 4 µm ; MicroSolv Technology Corp., Eatontown, NJ, USA) . La phase mobile était composée de (A) 0,01 % d'acide formique et (B) eau/ACN 90:10 (vol/vol). Le gradient suivant a été utilisé dans cette étude : 0–3 min, 20-20 % A ; 3–9,5 min, 20–30 % A ; 9,5–10 min, 30–70 % A ; 10–11 min, 70-100 % A ; 11–14 min, 100-100 % A ; 14-14,1 min, 100–20 % A ; 14,1–35 min, 20-20 % A. Le débit était de 0,2 mL/min. Les analyses par spectrométrie de masse ont été effectuées sur un spectromètre de masse triple quadripôle Thermo Fisher Scientific TSQ AltisTM (Waltham, MA, USA) équipé d'une source d'ionisation par électrospray (ESI) en mode de balayage positif en utilisant le mode de surveillance de la réaction (SRM) sélectionné. Les paramètres optimaux étaient les suivants : débit de gaz gaine de 35 unités arbitraires, débit de gaz auxiliaire de 5 unités arbitraires, température capillaire de 325 °C et tension de pulvérisation de 3,5 kV.

H1299 (1,5 × 105 cellules) et MCF-7 (3,0 × 105 cellules) ont été ensemencés dans une plaque 24 puits Costar® (Corning, NY, USA) et cultivés pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO2 pour former un monocouche de cellules confluentes. Une fois que les cellules ont atteint la confluence, le milieu a été retiré et un tampon PBS a été utilisé pour laver les cellules. La monocouche a ensuite été grattée avec une pointe de pipette de 200 µL et les cellules ont été traitées avec 150 µM d'EA ou de MDSA à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 48 h. À l'aide d'un microscope automatisé Lionheart FX (BioTek®, Agilent, Santa Clara, Californie, États-Unis), les images en champ clair des cellules ont été acquises et analysées.

Du Matrigel® (Corning, NY, USA) a été appliqué dans la chambre supérieure d'une plaque Transwell® à 24 puits (Corning, NY, USA) pendant 24 h (matrigel 200 µg/mL pour MCF7, matrigel 1000 µg/mL pour H1299) . Matrigel a été dilué avec le milieu sans FBS. Suite à cela, H1299 (1,0 × 105 cellules) et MCF7 (1,5 × 105 cellules) ont été ensemencés dans la chambre supérieure avec un milieu sans FBS et traités pendant 24 h avec 150 µM d'EA ou de MDSA. Dans l'intervalle, le milieu chimioattractant contenant 10 % de FBS a été ajouté à la chambre inférieure. Un microscope inversé (Olympus Corporation, Tokyo, Japon) a été utilisé pour capturer les images cellulaires, qui ont ensuite été analysées à l'aide de l'image J54.

Les données présentées indiquent les moyennes ± les écarts-types (moyenne ± SD). Dans ces cas, le nombre d'échantillons biologiquement indépendants est de trois ou plus. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du test t de Student bilatéral non apparié ou de l'analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) avec le test de Dunnett à des niveaux de signification de *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les structures cryo-EM déterminées ici sont déposées dans la banque de données de microscopie électronique (EMDB) sous les codes d'accession EMD-33145 (forme ouverte de ME2), EMD-33146 (complexe ME2-EA) et EMD-33147 (complexe ME2-MDSA ). Les modèles moléculaires associés sont déposés dans la PDB sous le code d'accession 7XDE (forme ouverte de ME2), 7XDF (complexe ME2-EA) et 7XDG (complexe ME2-MDSA). Toutes les autres données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié, les données supplémentaires et les fichiers d'informations supplémentaires. Les ensembles de données générés et analysés au cours de cette étude sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant.

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Ce travail a été soutenu financièrement par le Ministère de la Science et de la Technologie, ROC (MOST 104-2311-B-005-009 -MY3, MOST 110-2311-B-005-007 et 108-2320-B-040-020-MY3 ); en partie soutenu par le Centre avancé de biotechnologie des plantes et des cultures vivrières du programme du Centre de recherche sur les zones en vedette dans le cadre du projet de germination de l'enseignement supérieur du ministère de l'Éducation (MOE) de Taïwan. Nous tenons à exprimer notre gratitude pour l'aide à l'analyse MS fournie par le Centre d'instruments de l'Université nationale Chung Hsing. Les expériences cryo-EM ont été réalisées à l'Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). L'ASCEM est soutenu conjointement par Academia Sinica Core Facility et Innovative Instrument Project (Grant No. AS-CFII-111-210) et Taiwan Protein Project (Grant No. AS-KPQ-109-TPP2). Ce travail a utilisé les ressources du cloud distribué ASGC (Academia Sinica Grid-computing Center), qui est pris en charge par Academia Sinica.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Ju-Yi Hsieh, Kun-Chi Chen, Chun-Hsiung Wang.

Département des sciences de la vie, Université nationale Chung Hsing, Taichung, 402, Taiwan ROC

Ju-Yi Hsieh, Kun-Chi Chen, Jie-An Ye, Yu-Tung Chou, Yi-Chun Lin, Cheng-Jhe Lyu, Rui-Ying Chang, Yi-Liang Liu et Hui-Chih Hung

doctorat Programme en génie tissulaire et médecine régénérative, Université nationale Chung Hsing, Taichung, 402, Taiwan ROC

Kun-Chi Chen & Hui-Chi Hung

Institut de chimie biologique, Academia Sinica, Taipei, 115, Taiwan ROC

Chun-Hsiung Wang et Meng-Chiao Ho

Institut de médecine, Collège de médecine, Université médicale Chung Shan, Taichung, 402, Taiwan ROC

Guang-Yaw Liu & Jie-An Ye

Instrument Center, Office of Research and Development, National Chung Hsing University, Taichung, 40227, Taiwan ROC

Yen-Hsien Li

Département de chimie, Université nationale Chung Hsing, Taichung, 402, Taiwan ROC

Yen-Hsien Lee et Mau-Rong Lee

Institut des sciences biochimiques, Université nationale de Taiwan, Taipei, 106, Taiwan ROC

Meng-Chiao Ho

Institut de génomique et de bioinformatique, Université nationale Chung Hsing, Taichung, 402, Taiwan ROC

Hui Chih Hung

Centre avancé de biotechnologie des plantes et des cultures vivrières, Université nationale Chung Hsing, Taichung, 402, Taiwan ROC

Hui Chih Hung

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JYH, CJL, RYC et YLL ont réalisé les expériences cinétiques. CHW a réalisé le gros œuvre. JYH, KCC, JAY, YTC et YCL ont réalisé les études cellulaires. YHL et MRL ont effectué l'analyse par spectrométrie MASS. JYH, CHW et KCC ont analysé les données et aidé à l'interprétation des résultats. HCH, MCH et GYL ont co-supervisé le projet et contribué à sa conception et à sa mise en œuvre, ainsi qu'à son analyse et à la rédaction d'articles.

Correspondance avec Meng-Chiao Ho ou Hui-Chih Hung.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Azhar Rasul, Matthew J. Belousoff et Song Xiang pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteur principal de la manipulation : Joao Valente.

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Réimpressions et autorisations

Hsieh, JY., Chen, KC., Wang, CH. et coll. La suppression de l'enzyme malique humaine 2 modifie le métabolisme énergétique et inhibe la respiration cellulaire. Commun Biol 6, 548 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04930-y

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Reçu : 04 août 2022

Accepté : 12 mai 2023

Publié: 22 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04930-y

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