VEGF

Psychiatrie moléculaire (2023)Citer cet article

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L'activation de l'immunité innée dans le cerveau est une caractéristique importante de la maladie d'Alzheimer (MA). La présente étude a examiné la régulation de l'immunité innée par injection de sérum de type sauvage dans un modèle de souris AD transgénique. Nous avons constaté que le traitement avec du sérum de souris de type sauvage réduisait de manière significative le nombre de neutrophiles et la réactivité microgliale dans le cerveau des souris APP/PS1. Imitant cet effet, la déplétion des neutrophiles via les anticorps neutralisants Ly6G a entraîné des améliorations des fonctions cérébrales de la MA. L'analyse protéomique sérique a identifié le facteur de croissance endothélial vasculaire-A (VEGF-A) et le ligand 1 de la chimiokine (motif CXC) (CXCL1) comme des facteurs enrichis dans les échantillons de sérum, qui sont cruciaux pour la migration et le chimiotactisme des neutrophiles, la migration des leucocytes et le chimiotactisme cellulaire. Le VEGF-A exogène a inversé les diminutions induites par l'amyloïde β (Aβ) de la kinase dépendante de la cycline 5 (Cdk5) et les augmentations de CXCL1 in vitro et a bloqué l'infiltration de neutrophiles dans le cerveau de la MA. La surexpression endothéliale de Cdk5 a conféré un effet inhibiteur sur l'infiltration de CXCL1 et de neutrophiles, restaurant ainsi les capacités de mémoire chez les souris APP/PS1. Nos découvertes révèlent un lien auparavant inconnu entre la signalisation VEGF dérivée du sang et l'infiltration des neutrophiles et soutiennent le ciblage de la signalisation endothéliale Cdk5 comme stratégie thérapeutique potentielle pour la MA.

La maladie d'Alzheimer (MA) est le type de démence le plus répandu qui touche principalement les patients âgés. La bêta-amyloïde (Aβ) et les dégénérescences neurofibrillaires (NFT) dans le cerveau sont les principales caractéristiques pathologiques de la MA. De plus en plus de preuves suggèrent que les facteurs circulatoires, y compris les cellules immunitaires et les cytokines apparentées, peuvent être associés à des changements pathologiques dans les modèles de souris AD [1,2,3,4,5]. Les neutrophiles, en tant que leucocytes innés les plus abondants dans le sang périphérique, se sont révélés être augmentés dans le sang des patients atteints de MA atteints de démence [6], dans le parenchyme cérébral des patients atteints de MA [7, 8] et dans plusieurs modèles de souris MA. [4, 9, 10, 11]. De plus, les facteurs systémiques dans le sang des jeunes souris peuvent rajeunir la neurogenèse, la plasticité synaptique et les fonctions cognitives chez les souris vieillissantes [12, 13] et vice versa [14], indiquant que les facteurs systémiques jouent un rôle important dans la modulation du comportement de l'hôte, de l'immunité , et les fonctions cérébrales [15,16,17]. Ainsi, ces études suggèrent que l'immunité innée, y compris les neutrophiles, peut jouer un rôle crucial dans le développement de la MA [4, 6, 7, 8, 18]. Cependant, on sait peu de choses sur la façon dont ce mécanisme peut être lié aux thérapies utilisant du sang jeune et à d'autres stratégies thérapeutiques impliquant des facteurs circulants. De plus, les facteurs systémiques clés qui sous-tendent l'homéostasie de l'immunité innée dans le cerveau AD restent à déterminer.

En tant que facteur transmissible par le sang, la signalisation du facteur de croissance endothélial vasculaire A (VEGF-A) s'est avérée impliquée dans l'arrêt de la neurodégénérescence et du déclin cognitif liés à la MA [19,20,21]. Il a été constaté qu'une signalisation insuffisante du VEGF a un impact sur le vieillissement de plusieurs organes, y compris la cognition cérébrale chez la souris, tandis qu'une signalisation améliorée du VEGF peut prévenir la perte capillaire associée à l'âge dans le cerveau et prolonger la durée de vie [22]. Le VEGF-A peut également augmenter la neurogenèse hippocampique chez les jeunes souris [23, 24] et envoyer un signal aux cellules endothéliales hippocampiques, qui sont des capteurs essentiels des facteurs circulatoires liés à l'âge [25]. Il a été démontré que le VEGF prévient la perte de récepteur AMPA induite par Aβ et sauve le dysfonctionnement synaptique par une action directe sur les synapses [26].

Dans cette étude, nous avons révélé que le nombre de neutrophiles inflammatoires était diminué en périphérie et dans le cerveau chez les souris APP/PS1 après injection de sérum de type sauvage. Nous avons en outre cherché à découvrir le rôle de la signalisation endothéliale VEGF-A/cycline-dépendante kinase 5 (Cdk5)/chimiokine (motif CXC) ligand 1 (CXCL1) dans le processus d'infiltration des neutrophiles dans le cerveau des souris APP/PS1. Nos résultats démontrent que cibler les neutrophiles et/ou la signalisation des molécules de trafic pour rééquilibrer le microenvironnement immunitaire dans le cerveau est une stratégie prometteuse pour le traitement de la MA.

Des souris transgéniques mâles APP/PS1 (APPswePSEN1dE9) âgées de huit mois sur un fond C57BL/6, des souris de type sauvage (WT) appariées selon l'âge et des souris mâles C57BL/6 âgées de 4 à 6 semaines ont été obtenues à partir du Institut de recherche biomédicale de Nanjing de l'Université de Nanjing (Nanjing, Chine). Les promoteurs des deux transgènes chez les souris transgéniques APP/PS1 coexprimant le gène APP muté par KM670/671L humain et le gène PSEN1 muté par M146L sont contrôlés par le transcrit de lecture de la protéine prion de souris (Prn). Des souris transgéniques Cx3cr1-GFP (B6.129P-Cx3cr1tm1Litt/J) ont été achetées auprès du Jackson Laboratory (Stock # : 005582). Les animaux ont été anesthésiés à l'aide d'une injection intrapéritonéale (ip) de 250 mg/kg de tribromoéthanol (T48402, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) et 2,5 % d'alcool tert-amylique (240486, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) filtré avec un filtre de 0,22 µm (Millipore, MA, États-Unis), le sang a été prélevé et le cerveau a été perfusé avec une solution saline froide et/ou du PFA à 4 % avant le prélèvement. Tous les animaux ont été logés dans des conditions de température et d'humidité contrôlées et maintenus dans un environnement de cycle lumière/obscurité de 12 h. Tous les protocoles expérimentaux étaient conformes aux réglementations du Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université Sun Yat-sen. Les animaux ont été exclus des expériences lorsqu'ils présentaient un état évident de comportement semblable à une maladie, comme être immobile dans les tests OFT et MWM ou mourir avant ou pendant les expériences.

Le sérum de souris a été prélevé sur de jeunes souris mâles C57BL/6 (n = 150 ; âgées de 4 à 6 semaines) après un saignement rétro-orbitaire. Le sérum a été préparé à partir du sang total après incubation pendant 1 h à température ambiante et à 4 ° C pendant la nuit et centrifugation à 4000 × g. Le sérum de souris regroupé a été filtré à travers un filtre à seringue stérile de taille de pores de 0, 22 µm (Millipore), dialysé à l'aide d'une cassette Slide-A-Lyzer ™ (Thermo Scientific), puis stocké à -80 ° C. Des souris APP/PS1 mâles âgées de huit mois (n = 20) et des compagnons de litière WT du même âge (n = 20) ont été traités par voie systémique avec 9 injections de sérum (200 μL/injection) ou une quantité égale de PBS stérile dans la queue veine tous les 3 jours. Toutes les souris (âgées d'environ 9 mois) ont été sacrifiées 48 h après le test de conditionnement de la peur ; n = 7–10 pour les tests comportementaux et n = 4–15 pour les tests histologiques et biochimiques [27]. La taille de l'échantillon a été choisie sur la base d'études antérieures similaires dans la MA [3, 4, 10]. Tous les échantillons ont été assignés au hasard à des groupes avec des tailles d'échantillon à peu près équilibrées.

Le conditionnement de la peur a été effectué dans une chambre aux dimensions internes de 20 cm de largeur × 20 cm de profondeur × 30 cm de hauteur (Coulbourn Instruments, USA). Des souris mâles ont été placées individuellement dans la chambre de test. Après un temps de référence (192 s), les animaux ont reçu trois paires de tonalité-choc. Le stimulus conditionné (SC) était une tonalité pure (durée de 20 s, 4000 Hz, 60 dB), qui était immédiatement suivie d'un choc électrique brouillé en continu délivré sur le sol de la grille (stimulus inconditionnel, US : 2 s, 0,5 mA). Chaque appariement tonalité-choc a été suivi de 64 s de temps, et les souris sont restées dans le contexte A pendant 64 s supplémentaires après le troisième choc. Vingt-quatre heures après le conditionnement, les souris ont été replacées dans la chambre de test pendant 320 s et ont été notées pour le temps de congélation (conditionnement contextuel). Par la suite, les animaux ont été déplacés vers une nouvelle chambre avec des parois internes en plastique noir non parfumées et une litière sur le sol et ont été notés pour la congélation pendant une période de base de 192 s suivie d'une exposition de 320 s à un ton identique au stimulus conditionné (conditionnement indicé ). Le protocole détaillé a été décrit précédemment [28].

Le test MWM a été réalisé sur des souris mâles, comme décrit précédemment avec une légère modification [29]. En bref, pendant la phase d'acquisition, les souris ont reçu un essai d'entraînement par jour pour localiser une plate-forme cachée positionnée à 1,0 cm sous la surface de l'eau dans une piscine, en utilisant les repères visuels distincts placés sur la paroi intérieure de la piscine. Le temps maximum donné pour chaque essai était de 60 s. Une souris n'a pas réussi à atteindre la plate-forme dans les 60 s et a été guidée manuellement vers la plate-forme et est restée pendant 10 s avant d'être renvoyée dans la cage. L'intervalle entre les essais pour chaque souris était de 10 min. Pendant la phase de sonde, la plate-forme a été retirée et les souris ont reçu un seul essai d'une durée de 60 s sans évasion disponible. Les trajectoires de nage ont été enregistrées avec le système de suivi vidéo TopScanTM 2.0 (Clever Sys., Inc., Reston, VA, USA). Tous les tests comportementaux ont été effectués entre 10h00 et 17h00 en phase d'extinction.

Sous anesthésie profonde, les souris ont été perfusées par voie transcardiaque avec une solution saline stérile froide et le cerveau a été immédiatement retiré. Un hémisphère a été congelé dans de l'azote liquide et l'autre hémisphère a été fixé par immersion dans du paraformaldéhyde à 4% à 4 ° C pendant 24 h et équilibré dans du saccharose à 15% dans un tampon phosphate 0, 1 M (PB) suivi de 30% de saccharose. Ensuite, des sections congelées de 40 μm d'épaisseur de l'hippocampe ont été prélevées à l'aide d'un microtome coulissant Leica SM2000R (Leica Microsystems, Richmond Hill, Ontario, Canada) et stockées à 4 ° C jusqu'à ce que la coloration par immunofluorescence soit effectuée. Les tranches de cerveau ont été sélectionnées à une équidistance continue de cinq tranches coronales espacées de 240 μm. Les hémisphères congelés ont été homogénéisés et extraits à 4 °C dans un tampon RIPA (test de radioimmunoprécipitation) (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Triton X-100 à 1 %, désoxycholate de sodium à 1 % et SDS à 0,1 %) contenant 1% d'inhibiteurs de phosphatase et 1% de protéase (Sigma-Aldrich, MO, USA) à l'aide d'un homogénéisateur TissueRuptor (Qiagen, DUS, Allemagne); l'homogénat a été centrifugé pendant 30 min à 12 000 × g (Eppendorf, HAM, Allemagne) et le surnageant a été collecté en tant que fraction soluble dans le RIPA. Le culot a été réextrait dans du SDS à 2 % et du Tris-HCl 50 mM, pH 7,4. Le surnageant a été recueilli sous forme de fraction soluble dans le SDS.

Les anticorps primaires suivants ont été utilisés : anti-Aβ1-42 de souris (1 :1 000 ; A5213, Sigma-Aldrich), anti-CD68 de rat (1 :400 ; MCA1957, Bio-Rad), anti-Iba-1 de lapin (1 : 1 000 ; Wako Chemical), récepteur anti-glutamate de souris 1 (1:400 ; ab183797, Abcam), anti-synaptophysine de souris (1:200 ; S5768, Sigma-Aldrich), anti-souris Ly6G de rat (1:200 ; BP0075, Bioxcell), anti-myéloperoxydase de souris (MPO, 1:1 000; AF3667-SP, R&D), anti-élastase des neutrophiles de souris (NE, 1:1 000; MAB4517-SP, R&D), anti-Ki67 de rat (1:500; SolA15 , eBioscience), anticorps polyclonal de lapin anti-Claudin5 (1:400; YT0953, Immunoway) anti-pCdk5 de souris (1:400; C-7, Santa Cruz) et anti-Cdk5 de souris (1:400; DC 17, Santa Cruz ). Les anticorps secondaires suivants ont été utilisés : Alexa Fluor 647 âne anti-souris, Alexa Fluor 594 âne anti-rat, Alexa Fluor 488 âne anti-chèvre, Alexa Fluor 555 chèvre anti-lapin et Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin (1 : 400, Invitrogen). Des anticorps anti-CD31 conjugués à la PE (1:100 ; 553373, B&D), anti-CXCL1 conjugués au FITC (1:100 ; IC4532G, B&D) et à la lectine marquée au DyLight 649 (1:200 ; L32472, InvitrogenTM) ont été utilisés dans quelques expériences d'immunofluorescence. Les protocoles détaillés d'immunofluorescence ont été décrits précédemment [30].

Un microscope confocal à balayage laser LSM 780 ou 800 (Carl Zeiss Microscopy) a été utilisé pour capturer des images représentatives des sections en utilisant les mêmes paramètres pour éviter les artefacts techniques potentiels. Le logiciel ImageJ (NIH) a été utilisé pour l'intensité moyenne de la quantification du signal de fluorescence dans la région d'intérêt de chaque image. Pour l'analyse de la colocalisation dans la Fig. 4 supplémentaire, analyse de la distribution du profil d'intensité de fluorescence de Cdk5 et pCdk5 avec CXCL1 à l'aide de ZEN 2.3 (Carl Zeiss Microscopy). Dans une description détaillée, ouvrez une microscopie à fluorescence confocale à l'aide de ZEN 2.3 (édition bleue) et sélectionnez "Traitement", puis sélectionnez "Définition du profil", la distribution du signal de fluorescence pourrait être affichée dans les graphiques à travers la flèche. La liste des données d'intensité de fluorescence se trouve dans le "Tableau des profils". Pour la reconstruction 3D, les images confocales originales de la pile Z ont été obtenues à l'aide d'une lentille à immersion d'huile 63 × avec zoom numérique 2.0 par microscope LSM 780. Ensuite, le logiciel Imaris (Bitplane, version 8.4) a été utilisé pour restituer et obtenir des images 3D reconstruites à l'aide de "l'outil de surface". Après la reconstruction, un outil de zoom numérique a été utilisé pour le grossissement de l'image, comme illustré à la Fig. 7H (à droite) et I. Les points lacrymaux de GluA1 + ont été rendus à l'aide de "Spot Tool". Les points ponctuels distribués à l'intérieur de la microglie ont été définis comme des points ponctuels synaptiques engloutis. La distance est inférieure à 0 μm de la surface microgliale et des points lacrymaux contactés distribués à l'extérieur de la microglie, mais la distance est inférieure à 0,25 μm de la surface microgliale.

Pour l'analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC), un échantillon de sang total de 200 µL provenant d'un autre ensemble de souris APP/PS1, APP/PS1 + sérum et APP/PS1 + Ly6G a été prélevé dans des tubes à centrifuger de 2 mL contenant 1 % d'héparine sodique ( 10 μL). Après anticoagulation, la solution a été diluée avec une solution saline stérile égale. Les PBMC ont été isolés à l'aide d'un tampon de lyse ammonium-chlorure-potassium (ACK) conformément aux instructions du fabricant. Les animaux ont été perfusés avec une solution saline stérile froide pour éliminer le sang périphérique restant, et les cerveaux ont été récoltés. La méthode de génération de cellules immunitaires cérébrales a été utilisée dans une étude précédente avec une légère modification [31]. Le cerveau a été rapidement disséqué et immergé dans une solution saline équilibrée froide de Hank (HBSS). Le cerveau a été haché avec des ciseaux et homogénéisé à l'aide d'un homogénéisateur Dounce dans du HBSS glacé 30 fois sans bulles. La suspension cellulaire a ensuite été transférée dans un tube préréfrigéré de 15 ml et filtrée à travers un filet en nylon préhumidifié (HBSS) de 70 μm. La myéline et les débris ont été éliminés en utilisant un gradient froid modifié de Percoll à 40 % (Merck Millipore, 17-0891-02) par centrifugation pendant 30 min à 500 x g sans accélération ni freinage. Le culot de cellules immunitaires contenait des microglies, des monocytes et des neutrophiles au fond d'un tube de 15 ml. Les échantillons ont été marqués avec un anti-CD45 conjugué au FITC (0,25 mg/106 cellules ; 11-0451-81, eBioscience), un anti-CD11b conjugué au PE-Cyn7 (0,125 mg/106 cellules ; 25-0112-81, eBioscience) , anti-CD62L conjugué à APC (0,5 mg/106 cellules ; 553152, B&D), anti-CXCR4 conjugué à FITC (0,5 mg/106 cellules ; 551967, B&D), anti-Ly6G conjugué à PE (0,5 mg/106 cellules ; E-AB-F1108D, Elabscience), anti-Ly6C conjugué à EF450 (0,5 mg/106 cellules ; 48-5932-80, Invitrogen), anti-CD31 conjugué à PE (0,25 mg/106 cellules ; B&D, 553373, MEC 13.3 ), les anticorps anti-VEGFR2/FLK-1 conjugués au BB700 (0,25 mg/106 cellules ; 742184, B&D) et les anticorps anti-CXCL1 conjugués au FITC (0,6 mg/106 cellules ; IC4532G, B&D) à une dilution de 1:100 pendant 30 min sur glace. Les échantillons expérimentaux ont été analysés à l'aide d'un cytomètre en flux (Beckman CytoFLEX S, CA, USA).

Les profils de cytokines du sérum des groupes WT + PBS, WT + Sérum, APP/PS1 + PBS et APP/PS1 + Sérum (n = 1 mélange de quatre échantillons de sérum) ont été analysés à l'aide d'un ensemble d'anticorps de cytokines de souris (CAT # QAM-CAA-4000 ; RayBiotech, ATL, USA) et testé selon les protocoles expérimentaux. Une combinaison de facteurs, y compris le classement par changement de pli (<0,67 et >1,5) et l'intensité du signal (>150), a été utilisée pour identifier les changements robustes, et un méta-classement des protéines a été généré. L'intensité relative du signal des cytokines indiquées et les données d'enrichissement fonctionnel de Gene Ontology (GO) sont présentées dans un graphique de tendance. Le protocole détaillé de l'essai utilisant une matrice d'anticorps de cytokines de souris Quantibody® 4000 a été décrit précédemment [32].

Les procédures de déplétion des neutrophiles ont déjà été décrites [4, 10]. Les neutrophiles ont été épuisés 24 h avant la première injection de sérum par injection ip de 0,3 mg d'anticorps anti-souris Ly6G ou d'isotype contrôle (InVivoPlus anti-souris Ly6G, 1A8; BE0075-1, Bioxcell, NH, USA) tous les 3 jours. Les injections d'anticorps anti-ly6G et de sérum ont été poursuivies pendant 4 semaines jusqu'aux tests comportementaux. Les niveaux de neutrophiles périphériques sont restés très bas, ce qui a été confirmé par un test d'immunofluorescence après des tests comportementaux. La procédure des neutrophiles était continue pour éliminer les effets potentiels de rebond.

Les concentrations de CXCL1, CCL3, CXCL16, CXCL9, HGF, FetuinA, EGF, FGF2, IL-22, TGFB1 et VEGF-A (Beijing 4A Biotech) dans le sérum et l'hippocampe ont été mesurées comme décrit précédemment [29, 30] . Les échantillons de sang ont été centrifugés à 4 ° C (à 4000 × g pendant 15 min) et les sérums ont été transférés dans un autre ensemble de tubes. Les hippocampes ont été homogénéisés dans du tampon de lyse RIPA (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 137 mM NaCl, 1 % NP40, 10 % glycérol, 1 mM PMSF, 1 μL/mL aprotinine, 1 μg/mL leupeptine et 0,5 mM sodium vanadate).

Des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales de souris (MBEC, bEnd.3, Procell, CL-0598, Wuhan, Chine) ont été cultivées conformément aux instructions du fabricant. En bref, les MBEC ont été cultivées dans 10 % de sérum bovin fœtal / milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) et 1 % de pénicilline-streptomycine (Life Technologies, Inc.) dans des flacons T75 non revêtus à 37 °C et 5 % de CO2. Des changements complets de médias ont été effectués tous les deux jours. Les MBEC ont été passés en utilisant un traitement à la trypsine à 0, 25% pendant 1 min à 37 ° C. Un total de 10 000 cellules/cm2 ont été cultivées dans un milieu sans sérum pendant 24 h puis traitées avec du sérum (20 μL), des anticorps anti-VEGF-A (2 μg) et de la protéine VEGF-A (20 ng/mL) pendant 24 h (CME0014, Pékin 4A Biotech).

Pour le knock-out CRISPR/Cas9 du gène Cdk5 murin dans les cellules bEnd.3, les petits ARN guides (ARNsg) ont été utilisés : sgCDK5#1 : CAGGCTGGATGATGACGATG ; sgCDK5#2 : CCGGGAAACTCATGAGATTG. Les séquences de sgRNA ont été vérifiées dans l'outil en ligne NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov). Les séquences d'ARNsg ont été clonées dans notre vecteur pSB-CRISPR précédemment construit comme décrit précédemment [33]. L'efficacité des outils vecteurs pSB-CRISPR a été identifiée par Western blot avec un anticorps spécifique anti-Cdk5.

Les protéines totales ont été extraites de cellules bEnd.3 cultivées et de tissus cérébraux à l'aide d'un tampon de lyse protéique (P0013C, Beyotime), contenant 1 % d'inhibiteurs de phosphatase (Sigma-Aldrich) et 1 % d'inhibiteurs de protéase (Sigma-Aldrich) et centrifugés à 12 000 × g (30 min, 4 °C). La concentration en protéines totales a été déterminée à l'aide d'un kit d'analyse de protéines BCA (Beyotime, P0012) et a été ajustée à 3,5 mg/mL. Un total de 30 μg de protéines a été séparé par 4-10% SDS-PAGE et transféré sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF). La membrane a été bloquée avec une solution saline tamponnée au Tris avec du Tween-20 (TBST) contenant 5 % de lait et analysée à l'aide d'anticorps monoclonaux contre Ki67 (1 : 2 000, SolA15 ; eBioscience), Cdk5 (1 : 2 000, DC 17 ; Santa Cruz), p-Cdk5 (1:2 000, C-7; Santa Cruz), récepteur anti-glutamate de souris 1 (1:2000; ab183797, Abcam), anti-synaptophysine de souris (1:2000; S5768, Sigma-Aldrich), anti-souris de -PSD95 (1:2000 ; ab13552, Abcam), Tau total (D1M9X, 1:2000, 46687, Cell Signaling Technology), phospho-Tau Ser199/202 (1:2000, AB9674 ; Sigma-Aldrich) et lapin anti-β -actine (1:2 000, 4970 ; technologie de signalisation cellulaire). Les transferts ont été numérisés à l'aide du système Image Quant Las4000mini. Le logiciel ImageJ (NIH) a été utilisé pour l'intensité moyenne des bandes.

Des souris APP/PS1 ont reçu une injection intrapéritonéale de 2 μg/kg/j de VEGF-A de souris recombinant ou de solution saline pendant 3 jours comme décrit précédemment avec une légère modification [34]. L'AAV-BR1-CMV-mCdk5-P2A-EGFP (BR1-mCdk5) ou AAV-BR1-CMV-EGFP (BR1-CON) recombinant systématique a été injecté à des souris APP/PS1 âgées de 30 semaines (7,5 mois) par le veine caudale (mCdk5; 1,0 × 1012 particules génomiques/souris). Un traitement supplémentaire, tel qu'une injection de sérum, a été effectué 2 semaines après l'injection d'AAV. L'AAV a été produit par un système de transfection triple plasmide selon les études précédentes [35]. En bref, un plasmide contient la capside BR1, un deuxième plasmide comprend le gène Cdk5 flanqué d'ITR et un troisième plasmide fournit des gènes auxiliaires.

Les cellules endothéliales primaires de l'hippocampe ont été isolées comme décrit précédemment [36]. En bref, des hippocampes de souris APP/PS1 traitées avec BR1-mCdk5 ou BR1-CON ont été hachés et digérés pendant 30 min à 37 °C avec 2 % (vol/vol) de FBS dans du PBS contenant 400 U/mL de collagénase. Après digestion enzymatique, le tissu a été culotté par centrifugation à 300 × g à 4 ° C pendant 5 min et le surnageant a été jeté. Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans du FBS à 2 % (vol/vol) dans du PBS contenant de la DNase I (0,5 mg/mL), et des suspensions unicellulaires ont été doucement ajoutées au-dessus de Percoll à 22 % et centrifugées à 560 x g à 4 °C pendant 10 min pour obtenir les cellules vasculaires au fond du tube. Les cellules purifiées ont été analysées sur un cytomètre en flux FACS Calibur (BD influxTM, NJ, USA) en utilisant un anticorps anti-CD31-PE (0,25 mg/106 cellules ; B&D).

Des cellules endothéliales hippocampiques de souris ont été isolées comme décrit ci-dessus [36]. L'ARN total des cellules endothéliales de l'hippocampe a été isolé à l'aide de RNAiso Plus (Sangon Biotech, Shanghai, Chine). L'ADNc a été synthétisé à l'aide d'un kit de transcription inverse d'ADNc GoScriptTM (Promega, Madison, WI, USA). L'expression d'ARNm spécifiques a été dosée à l'aide d'une PCR quantitative en temps réel basée sur la fluorescence (RT-PCR). Des PCR quantitatives ont été réalisées à l'aide de TransStart Tip Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Pékin, Chine) en triple exemplaire pour chaque échantillon. Les détails des séquences d'amorces sont les suivants :

Cdk5 (avant), 59-CAATGCAGAAATACGAGAAACTGG-39 ;

Cdk5 (inverse), 59-CTTTGAGTAGACAGATTCCCCG-39;

Cxcl1 (vers l'avant), 59-ACCGAAGTCATAGCCACACTC-39 ;

Cxcl1 (verso), 59-CTCCGTTACTTGGGGACACC-39.

La perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BBB) ​​a été évaluée à l'aide de la coloration au bleu d'Evans, comme décrit précédemment avec de légères modifications [30]. En bref, une solution à 2 % de colorant bleu Evans (E2129 ; Sigma-Aldrich) dans une solution saline à 0,9 % a été injectée par voie intraveineuse dans les souris APP/PS1 via la veine de la queue à une dose de 2 mL/kg un jour après le dernier VEGF-A injection. Deux heures plus tard, toutes les souris ont été anesthésiées et perfusées par voie transcardiaque avec une solution saline froide à 0,9 %. Pour détecter la fuite de bleu Evans, des échantillons de tissu cérébral ont été homogénéisés dans du diméthylformamide à 99 % et incubés dans un bain-marie à 50 °C pendant 48 h. Le surnageant a été recueilli après centrifugation à 12 000 × g (30 min, 4 °C) et l'absorbance de l'échantillon a été mesurée à 620 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques.

Des tranches de cerveau coronales de l'hippocampe (300 μm d'épaisseur) ont été préparées à partir de souris APP/PS1 mâles postnatales âgées de 5 à 6 mois et de leurs compagnons de portée WT à l'aide d'un vibratome (Leica VT1000) dans une solution pré-réfrigérée contenant (en mM) 110 chlorure de choline, 7 MgCl2·6H2O, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2·H2O, 1,3 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 20 glucose, saturé avec 95 % O2 et 5 % CO2. Les tranches ont été immédiatement transférées dans du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) à 35 ° C pendant 30 min, puis transférées dans une chambre d'enregistrement. L'enregistrement d'ACSF contenant (en mM) : 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2·H2O, 1,3 MgCl2·6H2O, 1,3 NaH2PO4, 25 NaHCO3 et 10 glucose. Toutes les solutions ACSF doivent être saturées de carbogène (95 % O2/5 % CO2) avant utilisation pour assurer un tampon de pH stable (pH 7,3) et une oxygénation adéquate. Des enregistrements de patch-clamp de cellules entières du soma des neurones pyramidaux du gyrus denté (DG) ont été obtenus sous un microscope infrarouge (IR) à contraste d'interférence différentiel (DIC) (ECLIPSE FN1, Nikon). Pour enregistrer mEPSC, les potentiels de maintien ont été maintenus à -70 mV, le récepteur GABAA et les potentiels d'action ont été bloqués avec 20 µM de méthiodure de bicuculline (BMI) et 1 µM de tétrodotoxine (TTX), respectivement. Des pipettes en verre ont été remplies d'une solution interne contenant (en mM) 100 CsMeSO4, 25,5 CsCl, 10 HEPES, 8 NaCl, 0,25 EGTA, 10 glucose, 4 MgATP et 0,3 Na3GTP (pH 7,3, 285 mOsm). Les données ont été numérisées à 10 kHz et filtrées à 1 kHz et enregistrées à l'aide d'un amplificateur multiClamp 700B et Digidata 1500B avec le logiciel pClamp11.2 (Molecular Devices). Les données ont été recueillies lorsque la résistance en série fluctuait dans les 20 % des valeurs initiales et analysées à l'aide du programme Mini Analysis (Synaptosoft) et du logiciel pClamp 11.2 (Molecular Devices). La méthode d'électrophysiologie a été réalisée selon les études précédemment rapportées [37, 38].

Un total de 100 µL d'échantillons de sang total provenant de souris APP/PS1 de type large et de souris APP/PS1 injectées avec du sérum ont été prélevés par ponction cardiaque dans des tubes recouverts d'héparine. Tous les échantillons de sang périphérique ont été analysés avec un analyseur d'hématologie automatique (Sysmex, XT-2000i, Sysmex Corporation, Japon). Les paramètres sanguins suivants ont été analysés : nombre de globules blancs (GB), nombre de globules rouges (RBC), neutrophiles (Neu), lymphocytes (Lym), monocytes (Mon), éosinophiles (Eos), basophiles (Bas), hémoglobine ( HGB), hématocrite (HCT), volume corpusculaire moyen (MCV), hémoglobine corpusculaire moyenne (MCH), concentration corpusculaire moyenne d'hémoglobine (MCHC), numération plaquettaire (PLT), volume plaquettaire moyen (MPV), largeur de distribution plaquettaire (PDW).

Tous les résultats représentent au moins trois expériences indépendantes et sont exprimés en moyenne ± SEM. Un test t de Student bilatéral non apparié (entre deux groupes) ou une ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle (tests de comparaison de Bonferroni ou LSD) ou un test de Kolmogorov – Smirnov a été effectué pour l'analyse statistique. Une ANOVA répétée à deux voies a été effectuée dans les résultats des tests MWM. Une ANOVA unidirectionnelle (homogénéité égale de la variance) ou Dunnett T3 (homogénéité inégale de la variance) a été utilisée pour l'analyse du profil hématologique. La distribution des données a été supposée normale ; cela a également été testé avec des QQ-plots ou des histogrammes. L'analyse et la représentation graphique ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism version 8.0 (GraphPad 8.0). P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

L'immunité innée est associée à la pathologie de la MA [39,40,41]. Pour étudier la réponse des cellules immunitaires innées au traitement au sérum de type sauvage chez les souris APP/PS1, nous avons utilisé la cytométrie en flux pour analyser les activités des sous-ensembles de cellules immunitaires CD45+ et CD45+/CD11b+ dans les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC, Fig. 1A, B ; Supplémentaire Fig. 1A, B) et des suspensions de cellules cérébrales (Fig. 1G, H). Fait intéressant, suite au traitement sérique, il y a eu une augmentation du nombre de cellules immunitaires CD45 +, mais une diminution des neutrophiles CD11b + Ly6GhiLy6Clo, à la fois dans le sang périphérique (Fig. 1C, D, F) et le cerveau (Fig. 1I, J, L) dans le modèle de maladie. Notamment, l'injection de sérum a augmenté de manière significative le nombre de cellules des monocytes CD11b + / Ly6Chi / Ly6Glo (Fig. 1C, E), ce qui est cohérent avec les résultats reflétés par CD11b + / CD45hi (Fig. 1B, C supplémentaire). De manière inattendue, nous avons observé des résultats incohérents entre le nombre de monocytes CD11b + / Ly6Chi / Ly6Glo (Fig. 1I, K) et les monocytes CD11b + / CD45hi (Fig. 1E, F supplémentaires) dans des cerveaux de souris APP / PS1 traités au sérum. Étant donné que les neutrophiles peuvent produire des pièges extracellulaires de neutrophiles (NET), nous avons analysé la présence de NET dans le cerveau de souris AD par anti-neutrophile élastase (NE) ou anti-myéloperoxydase (MPO) coloration immunofluorescente. En effet, nous avons observé des neutrophiles accompagnés de TNE dans le parenchyme, qui sont principalement localisés autour du ventricule cérébral, du plexus choroïde, des leptoméninges, de la plaque Aβ et des vaisseaux corticaux (Fig. 2A – D). De manière cohérente, le traitement par anticorps Ly6G a aboli les neutrophiles NE + ou MPO + adjacents à l'hippocampe, aux espaces ventriculaires et aux leptoméninges chez les souris AD (Fig. 2E, F). Ensuite, nous avons étudié le phénotype des neutrophiles infiltrants dans un modèle de souris AD par analyse de cytométrie en flux. Le nombre de sous-ensembles de neutrophiles sénescents hyperréactifs Ly6G + / CXCR4hi / CD62Llo nocifs a été significativement augmenté dans les cerveaux de souris APP / PS1 par rapport aux témoins WT, alors que ces effets ont été prévenus par un traitement par sérum ou anticorps neutralisant Ly6G (Fig. 2G, H). Ensemble, ces résultats suggèrent que l'injection de sérum chez les souris AD a diminué le nombre de neutrophiles périphériques et a empêché la migration du sous-ensemble de neutrophiles hyperréactifs vers le cerveau.

Stratégie de tri par cytométrie en flux des cellules immunitaires (P1), des cellules individuelles (P2), des leucocytes CD45+ (P3) et des monocytes CD45hi/CD11b+ (P4) dans les PBMC (A, B) et le cerveau (G, H). Les flèches rouges dans AB et GH représentent le sous-ensemble P2 basé sur P1, le sous-ensemble P3 basé sur P2 et le sous-ensemble P4 basé sur P3. Les monocytes C ont des populations nettement différentes en fonction de l'expression de Ly6C et Ly6G. D–F Analyse par cytométrie en flux des leucocytes CD45+ (P3), des monocytes Ly6Chi/Ly6Glo (indiqués par la porte bleue en C) et des fréquences des neutrophiles Ly6Ghi/Ly6Clo (indiquées par la porte rouge en C) dans les PBMC du PBS et du sérum -souris APP/PS1 traitées. I Les monocytes ont des populations nettement différentes en fonction de l'expression de Ly6C. J–L Analyse par cytométrie en flux des fréquences des leucocytes CD45+ (P3), des monocytes Ly6Chi/Ly6Glo (indiqués par la porte bleue en I) et des neutrophiles Ly6Clo/Ly6Ghi (indiqués par la porte rouge en I) dans le cerveau de PBS- et souris APP/PS1 âgées de 8 à 9 mois et traitées au sérum (les données sont présentées sous forme de moyenne ± sem ; test t bilatéral de Student non apparié, *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001 ; n = 5–6 par groupe).

Images confocales représentatives des leucocytes NE + (globules rouges) dans le 3V (A), autour de la zone hippocampique (panneaux de gauche en B) et du plexus choroïde (panneaux de droite en B). Leucocytes MPO+ (globules rouges) dans les méninges et le parenchyme où la plaque Aβ (coloration verte) est déposée (C) et autour des vaisseaux cérébraux (panneaux de droite en D) chez des souris APP/PS1 âgées de 8 à 9 mois. Les vaisseaux cérébraux ont été identifiés sur la base de la coloration Hoechst 3D à l'aide du logiciel Zen. Quantification du nombre de cellules NE+ (E) et MPO+ (F) dans l'hippocampe, le 3V, les vaisseaux sanguins et la pie-mère chez des souris APP/PS1 traitées avec un anticorps anti-Ly6G ou un anticorps contrôle d'isotype (les données sont présentées sous forme de moyenne ± sem ; test t bilatéral de Student non apparié, n = 5–6 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001). G, H Analyse par cytométrie en flux des neutrophiles hyperréactifs infiltrant le cerveau, comme en témoigne la coloration CXCR4hi/CD62Llo chez des souris APP/PS1 traitées avec du sérum ou des anticorps anti-Ly6G et des contrôles WT (n = 4–5). ANOVA unidirectionnelle suivie de tests de comparaisons multiples de Bonferroni. ***p < 0,001. Hippocampe de la hanche, troisième ventricule 3V, gyrus denté DG, plexus choroïde CP, barre d'échelle : 20 μm en A et B ; 50 μm en C et D.

Le microenvironnement immunitaire circulant joue un rôle important dans l'homéostasie cérébrale dans la MA [40,41,42]. Nous avons montré que l'injection de sérum réduisait le nombre de neutrophiles périphériques et cérébraux chez les souris transgéniques APP/PS1. Cependant, la façon dont les neutrophiles périphériques réduits peuvent atténuer leur infiltration dans le parenchyme chez les souris AD reste incertaine. Par conséquent, nous avons d'abord analysé les profils de cytokines du sérum de souris WT + PBS, WT + sérum, APP/PS1 + PBS et APP/PS1 + sérum à l'aide d'un réseau de cytokines de souris. Le regroupement hiérarchique non supervisé basé sur des protéines exprimées de manière différentielle (DEP) a indiqué un réseau d'expression de protéines distinct induit par le sérum (Fig. 3A, B). Les 82 protéines les mieux classées sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 1. L'analyse de l'ontologie génique (GO) a montré un enrichissement significatif des protéines principalement impliquées dans la migration des neutrophiles, la migration des leucocytes et la chimiotaxie (Fig. 3C, D). L'analyse de l'encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) utilisant les 82 protéines les mieux classées (23 régulées à la baisse et 59 régulées à la hausse) a révélé un réseau d'interactions cytokine-récepteur de cytokine et de voies de signalisation des chimiokines (Fig. 2A, B supplémentaires).

L'analyse de la matrice d'anticorps de cytokines de souris a été réalisée dans le sérum de souris APP / PS1 traitées au PBS ou au sérum (âgées de 8 à 9 mois) et de souris WT du même âge traitées au PBS ou au sérum. A, B L'expression de cytokines régulée à la baisse (bleu) et non régulée (rouge) a été détectée dans le sérum entre les souris WT + PBS et APP/PS1 + PBS et entre les souris APP/PS1 + PBS et APP/PS1+Sérum. Analyse d'enrichissement de l'ontologie génique (processus biologique) de 23 cytokines régulées négativement (C) et 59 cytokines régulées positivement (D) dans les groupes APP/PS1 + Sérum vs APP/PS1 + PBS. Diagramme E Venn montrant les cytokines qui se chevauchent dans le sérum des quatre groupes. Le bleu représente les groupes APP/PS1 + PBS vs WT + PBS ; le rouge représente les groupes APP/PS1 + Sérum vs WT + PBS ; et le vert représente les groupes APP/PS1 + Sérum vs APP/PS1 + PBS. F Analyse de la carte thermique de l'expression génique de regroupement non supervisée montrant les 36 cytokines qui se chevauchent parmi le sérum des souris WT + PBS, WT + sérum, APP/PS1 + PBS et APP/PS1 + sérum.

De plus, 36 DEP (tableau supplémentaire 2) dans le sérum de souris WT + PBS, WT + sérum, APP/PS1 + PBS et APP/PS1 + sérum ont été identifiés par un diagramme de Venn (Fig. 3E) et une carte thermique (Fig. 3F). Des chimiokines, des facteurs de croissance et des cytokines ont été identifiés à partir des 36 DEP, notamment CXCL1, CCL3, CXCL16, CXCL9, HGF, FetuinA, EGF, FGF2, IL-22 et TGFB1. Ces facteurs sont significativement enrichis dans la migration et le chimiotactisme des neutrophiles/leucocytes. Nous avons en outre confirmé les résultats à l'aide de kits ELISA dans le sérum et le cerveau de souris WT + PBS, APP / PS1 + PBS et APP / PS1 + sérum (Fig. 4A – J).

Nos données ont montré que les niveaux de CXCL1 (A), CCL3 (B), CXCL16 (C) et FetuinA (F) étaient significativement augmentés, et les niveaux de CXCL9, HGF, IL-22 et TGFB1 étaient significativement diminués dans le sérum. de souris APP/PS1 (âgées de 8 à 9 mois) par rapport à celles des souris WT du même âge (D, E, I et J). Cependant, ces altérations accrues ont été restaurées aux niveaux détectés chez les souris WT + PBS après traitement au sérum. Aucune différence évidente dans les taux d'EGF et de FGF2 n'a été notée dans le sérum des souris WT + PBS, APP/PS1 + PBS et APP/PS1 + Sérum (G, H). Le réseau d'interaction protéine-protéine K (PPI) basé sur l'outil en ligne STRING utilisant les 82 protéines les mieux classées a produit le réseau le plus puissant autour de la signalisation des cytokines chimiotactiques et des facteurs angiogéniques (CXCL1 et VEGF-A). Les concentrations moyennes sont exprimées en pg/mL de sérum. ANOVA unidirectionnelle suivie de tests de comparaisons multiples de Bonferroni. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sem ; ns non significatif ; n = 6 par groupe ; *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001.

Conformément aux résultats du test de réseau d'anticorps de cytokines, les niveaux des chimiokines CXCL1, CCL3 et CXCL16 associées à la migration des neutrophiles ont augmenté de manière significative dans le cerveau des souris APP/PS1 + PBS. Après un traitement au sérum de type sauvage âgé de 4 à 6 semaines, l'expression accrue de ces trois chimiokines a été normalisée à la fois dans la périphérie et dans le cerveau, atteignant les niveaux de souris WT du même âge (9 mois) (Fig. 4A– C ; Fig. 3A–C supplémentaires). Notamment, l'analyse des voies d'ingéniosité (IPA) utilisant les protéines les mieux classées a produit le réseau le plus puissant autour de la signalisation CXCL1 et VEGF-A (Fig. 4K). Par ailleurs, nous avons réalisé le test à l'aide d'un analyseur d'hématologie chez des souris de type large, souris APP/PS1 traitées avec ou sans sérum. Conformément aux données des tests de cytométrie en flux (Fig. 1E; Fig. S1C), les données hématologiques ont montré que l'injection de sérum diminuait de manière significative le nombre de neutrophiles et augmentait le nombre de monocytes (tableau supplémentaire 3). Ces résultats indiquent que les chimiokines circulantes systémiques dérivées du sérum peuvent moduler l'infiltration de neutrophiles pro-inflammatoires dans le cerveau dans un modèle de souris AD.

Nous avons ensuite étudié le mécanisme moléculaire sous-jacent à l'adhésion/infiltration des neutrophiles chez les souris APP/PS1. Nous nous sommes concentrés sur la cytokine CXCL1, une chimiokine attractive pour les neutrophiles dans l'AVC ischémique [43], la sclérose en plaques [44] et plusieurs modèles murins de neuroinflammation [45,46,47]. L'inactivation de Cdk5 spécifique de l'endothélium a augmenté l'expression de CXCL1 et conduit à une astrogliose progressive dans l'épilepsie [48]. Conformément à l'étude précédente, nous avons trouvé une relation négative entre les niveaux de CXCL1 et les niveaux de Cdk5 / pCdk5 dans les cellules bEnd.3 après un traitement Aβ ou sérique (Fig. 5A; Fig. Supplémentaire 4A, B). L'analyse de colocalisation a confirmé que les protéines Cdk5, pCdk5 et CXCL1 existaient dans le cytoplasme des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (Fig. 4C, D supplémentaires). Cependant, la distribution de Cdk5 et pCdk5 différait évidemment de la distribution de CXCL1 dans le cytoplasme (Fig. 4E, F supplémentaires).

A Images représentatives de l'expression de CDK, pCDK et CXCL1 dans les cellules bEnd.3 (CD31+). Barre d'échelle : 10 μm. B Western blot (WB) pour les marqueurs de prolifération cellulaire Ki67, Cdk5 phosphorylé et Cdk5, dans les cellules bEnd.3 ont été traités avec Aβ (2 μM), du sérum (20 μL), des anticorps anti-VEGF-A (2 μg), et protéine recombinante VEGF-A (20 ng/mL). C Quantification de la bande pour les protéines Ki67, pCdk5 et Cdk5 à l'aide d'une analyse Western blot ; n = 5 par groupe. Analyse D ELISA pour les niveaux de CXCL1 liés au C dans le surnageant ; n = 6 par groupe. E La roscovitine, un inhibiteur de Cdk5 (20 μM), inhibe la phosphorylation de Cdk5 induite par le VEGF-A dans les cellules bEnd.3 ; n = 3–4 par groupe. F Effet de l'inactivation de CDK5 à l'aide d'un sgRNA sur l'expression de CXCL1 dans les cellules bEnd.3 avec ou sans stimulation par le VEGF-A ; n = 6 par groupe. G, H Images représentatives et quantification de l'angiogenèse cérébrale (lectine+) chez les souris WT, APP/PS1, APP/PS1 traitées avec des anticorps anti-Ly6G ou la protéine recombinante VEGF-A ; n = 8 souris par groupe, 12 champs d'image de 5 tranches de cerveau par animal ont été analysés et moyennés comme valeur ; Barre d'échelle : 50 μm dans G. I–J Images représentatives et quantification de l'adhérence des neutrophiles colorées par l'anticorps anti-MPO dans les capillaires corticaux chez les souris APP/PS1 (bilinéaire blanc ; les vaisseaux identifiés sur la base de l'outil Z-Stack) ; ANOVA unidirectionnelle suivie de tests de comparaisons multiples de Bonferroni. ns non significatif ; n = 6 souris par groupe, 10 champs d'image de 4 tranches de cerveau par animal ont été analysés et moyennés comme valeur ; *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001 pour tous. Barre d'échelle : 20 μm en I. Les trois expériences in vitro distinctes qui ont produit des résultats comparables sont illustrées par les données.

De plus, nous avons constaté que le VEGF-A était une autre molécule clé de l'IPA après traitement au sérum (Fig. 4K) et que l'exposition au sérum augmentait les taux de VEGF-A circulants chez les souris APP / PS1 (Fig. 5 supplémentaire). De plus, la signalisation VEGF-A module les fonctions cérébrales dans la progression du vieillissement [22]. L'inhibition ou l'extinction de Cdk5 a réduit la migration des cellules endothéliales et l'angiogenèse en interférant avec le cytosquelette d'actine [49, 50]. De manière cohérente, nos données ont montré qu'une diminution de la prolifération des cellules endothéliales était parallèle à la faible expression de Cdk5 après un traitement Aβ in vitro (Fig. 5B, C), ce qui implique un lien potentiel entre Cdk5 et l'angiogenèse. Par conséquent, nous émettons l'hypothèse que le VEGF-A peut affecter l'expression de CXCL1 via la signalisation Cdk5. Premièrement, nous avons constaté que le sérum ne parvenait pas à empêcher les diminutions induites par Aβ de l'expression et de la phosphorylation de Cdk5 dans les cellules bEnd.3 après un traitement par anticorps VEGF-A (Fig. 5B, C). Semblable aux effets bénéfiques du sérum, le VEGF-A a également empêché de manière significative l'augmentation induite par Aβ de l'expression de CXCL1 (Fig. 5D). Pour étudier plus en détail comment le VEGF-A médiait la faible expression de CXCL1, nous avons examiné l'activité de Cdk5 en utilisant la roscovitine, un inhibiteur de Cdk5 (Fig. 5E). Nous avons constaté que la roscovitine atténuait l'effet inhibiteur du VEGF-A sur l'expression de CXCL1 (Fig. 6A – G supplémentaire). Conformément à ces résultats, l'inactivation du gène endothélial Cdk5 dans les cellules bEnd.3 via l'édition du gène CRISPR-Cas9 a également empêché la suppression de CXCL1 médiée par le VEGF-A, induisant à la place une triple augmentation des niveaux de CXCL1 dans le surnageant (Fig. 5F).

L'adhésion des neutrophiles dans les capillaires cérébraux réduit le flux sanguin cortical, ce qui entraîne des anomalies vasculaires et exacerbe la pathologie cérébrale dans plusieurs modèles murins de la maladie d'Alzheimer [10, 11]. Nous avons observé que le sérum favorisait l'angiogenèse et diminuait les segments capillaires chez les souris APP/PS1 (Fig. 5G, H). Pour étudier le rôle de l'adhérence des neutrophiles dans les capillaires corticaux, nous avons administré des anticorps neutralisants Ly6G pour épuiser les neutrophiles périphériques chez des souris APP/PS1. Nos résultats ont montré que l'anticorps Ly6G imitait les effets bénéfiques du sérum en augmentant le nombre de capillaires (Fig. 5G, H). En effet, le traitement par anticorps Ly6G a entraîné une réduction d'environ 90 % du nombre de neutrophiles MPO+ adjacents aux capillaires corticaux (Fig. 5I, J ; Fig. 2D, F). Ces données suggèrent que le sérum peut augmenter la densité capillaire cérébrale en empêchant l'adhésion/l'infiltration des neutrophiles.

Nous avons ensuite testé l'hypothèse selon laquelle le VEGF-A dérivé du sérum était nécessaire pour le blocage de l'adhésion des neutrophiles et de la perte capillaire cérébrale in vivo. Par conséquent, nous avons appliqué la protéine VEGF-A recombinante à des souris APP / PS1 et avons découvert que le VEGF-A pouvait favoriser l'activité de Cdk5 et pCdk5 (Fig. 7A – F, I – N supplémentaires), augmenter l'angiogenèse cérébrale et diminuer les minuscules segments capillaires (Fig. 5G, H), suivie d'une diminution de l'adhérence des neutrophiles chez les souris APP/PS1 (Fig. 5I, J). De même, l'anticorps neutralisant Ly6G présentait des avantages similaires au sérum et à la protéine VEGF-A sur le nombre de capillaires et l'adhérence des neutrophiles adjacents aux capillaires corticaux (Fig. 5I, J). Notamment, nous n'avons observé aucune aggravation supplémentaire de la perméabilité et de l'intégrité de la BBB dans le cerveau des souris APP / PS1 traitées au VEGF-A par rapport aux souris APP / PS1 traitées au PBS (Fig. 8A – C supplémentaires). Ensemble, ces résultats indiquent que le VEGF-A dérivé du sérum supprime l'expression de CXCL1 via l'activité de Cdk5, ce qui entraîne l'inhibition du recrutement des neutrophiles dans le cerveau de la souris AD.

Ensuite, pour déterminer le rôle des neutrophiles migrateurs dans le cerveau dans les troubles cognitifs, nous avons évalué l'apprentissage spatial et les performances de la mémoire à l'aide du conditionnement contextuel de la peur et des tests de labyrinthe aquatique de Morris. Au cours de l'entraînement de conditionnement de la peur, tous les groupes ont montré un temps de congélation de base comparable (Fig. 9A supplémentaire). Cependant, nous avons constaté que les comportements de congélation étaient significativement augmentés pendant le test de mémoire de peur contextuel (Fig. 9B supplémentaire), mais non signalé (Fig. 9C supplémentaire) chez les souris APP / PS1 après l'épuisement des neutrophiles. Les performances étaient similaires à celles des souris WT et des souris APP / PS1 traitées au sérum (Fig. 9B supplémentaire). Dans le test MWM, l'administration d'anticorps Ly6G chez des souris APP / PS1 a également amélioré les performances de localisation de la plate-forme cachée pendant la phase d'acquisition (Fig. 9D supplémentaire). Au cours de la phase de sonde spatiale, les souris APP / PS1 avec épuisement des neutrophiles ont passé plus de temps et parcouru de plus grandes distances dans le quadrant cible (Fig. 9E, F supplémentaires; augmentations de 46, 7% et 53, 4% pour le temps et la distance dans le quadrant, respectivement) et avait un nombre significativement plus élevé de passages sur la plate-forme que les souris APP / PS1 (Fig. 9G supplémentaire; augmentation de 2 fois). De plus, nous n'avons observé aucune différence évidente dans la vitesse de nage de tous les groupes (Fig. 9H supplémentaire). L'efficacité de la délétion dans le sang périphérique, le cerveau et les méninges a été confirmée par analyse par cytométrie en flux et coloration par immunofluorescence (Fig. 2A – F; Supplémentaire Fig. 10A – F; Supplémentaire Fig. 11A – E). Cependant, l'administration d'anticorps Ly6G n'a eu aucune influence sur le pourcentage de lymphocytes T CD3 + (Fig. 11F – I supplémentaires) ou sur les conditions de santé des souris APP / PS1, comme en témoignent les capacités exploratoires et la vitesse de déplacement dans l'OFT (Fig. supplémentaire 11F – I). 11J–L). Ces résultats démontrent que le traitement avec l'anticorps Ly6G a des effets bénéfiques sur le comportement de la mémoire chez les souris APP/PS1.

Pour déterminer davantage le rôle de la signalisation Cdk5 dans l'infiltration des neutrophiles et les déficits de mémoire dans le cerveau APP/PS1, nous avons utilisé AAV2-BR1-CMV-mCdk5-P2A-EGFP (BR1-mCdk5) pour induire une surexpression endothéliale cérébrale de Cdk5 et effectué l'analyse comportementale test selon le schéma expérimental (Fig. 6A–D). La RT-PCR a confirmé que l'ARNm de Cdk5 était augmenté dans les cellules endothéliales cérébrales après l'administration d'AAV (Fig. 6E, F). Des augmentations similaires des niveaux de protéine Cdk5 ont été observées dans l'hippocampe en utilisant une coloration immunofluorescente (Fig. 12A, B supplémentaires).

Un schéma des détails expérimentaux. L'expression systématique de l'AAV-mCdk5 a été déterminée chez des souris APP/PS1 âgées de 30 semaines (environ 7,5 mois). Après 2 semaines (8 mois), des souris transgéniques APP/PS1 mâles traitées à l'AAV ont été injectées par voie intraveineuse 9 fois avec 200 μL de sérum de souris C57BL/6 âgées de 4 semaines tous les 3 jours. Des analyses comportementales, comprenant des tests de conditionnement de la peur (FCT) et le test MWM, ont été réalisées après la dernière injection de sérum. Représentation schématique des constructions AAV2-BR1 indiquant les répétitions terminales inversées (ITR) aux deux extrémités et mCdk5 piloté par le promoteur CMV avec EGFP (BR1-mCdk5) ou EGFP piloté par le promoteur CMV (BR1-CON). B–D Diagramme schématique de la procédure de conditionnement de la peur. B Journée de formation (contexte I); C Journée test contextuelle (contexte I) ; D Jour du test indicé (contexte II). E, F Les niveaux relatifs d'ARNm de Cdk5 et CXCL1 dans les cellules endothéliales primaires de l'hippocampe ont été évalués chez des souris APP/PS1 injectées par BR1-mCdk5 et BR1-CON à l'âge de 32 semaines (n = 4 par groupe). Images confocales représentatives de l'expression de CXCL1 dans les microvaisseaux cérébraux (vert, G) et les neutrophiles (rouge, H) dans les ventricules latéraux de souris APP/PS1 injectées avec BR1-mCdk5 ou BR1-CON via la veine caudale. Barre d'échelle : 10 μm en G ; 50 μm dans H. I, J Analyse représentative par cytométrie en flux et quantification des neutrophiles (Ly6Ghi/Ly6Clo) dans le cerveau de souris APP/PS1 injectées avec BR1-Cdk5 ou BR1-CON (n = 4 à 5 souris par groupe). K Carte thermique représentative de la trajectoire d'échappement dans la phase de sonde de la tâche MWM. Des souris APP/PS1 injectées L BR1-mCdk5 ou BR1-CON (âgées de 8 mois) et des souris WT appariées selon l'âge ont été évaluées dans la tâche MWM. M, N La fréquence et le temps passé dans le quadrant cible (TQ) dans les groupes. O Test de gel contextuel. n = 7 ou 10 souris par groupe pour le test comportemental. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± sem ; ANOVA répétée bidirectionnelle, tests de comparaison multiple de Bonferroni ; *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001.

Conformément aux résultats in vitro, l'expression de CXCL1 dans les vaisseaux cérébraux a diminué après la surexpression de Cdk5 chez les souris APP / PS1, comme le montre la coloration immunofluorescente (Fig. 6G). De plus, la surexpression de Cdk5 endothélial a entraîné une diminution des neutrophiles migrateurs vers le cerveau (Fig. 6H – J), raccourci la latence d'échappement (Fig. 6L), augmenté la fréquence des passages à travers la plate-forme (Fig. 6K, M) et la durée dans le quadrant cible dans le test MWM (Fig. 6N), et l'augmentation du temps de congélation dans le test de mémoire contextuelle mais non indicée (Fig. 6O). Ainsi, ces résultats sont largement cohérents avec les données in vitro et démontrent que la surexpression de Cdk5 diminue la sécrétion de CXCL1 dans les cellules endothéliales cérébrales.

Ensemble, nos résultats confirment que la signalisation Cdk5 améliorée inhibe l'infiltration des neutrophiles et sauve les déficits de mémoire, ce qui suggère les effets bénéfiques du traitement sérique dans un modèle de souris AD.

La perte synaptique est généralement détectée précocement chez les patients atteints de MA [51] et dans des modèles murins de la maladie [52]. Ainsi, nous avons ensuite déterminé l'effet du sérum sur le marqueur présynaptique synaptophysine et le récepteur AMPA GluA1. Conformément aux études précédentes [53, 54], le modèle de souris mâle APP/PS1 de 8 à 9 mois a montré une diminution significative de l'expression de la synaptophysine et de GluA1 dans le DG et le CA3, mais pas dans le CA1 de l'hippocampe, par rapport aux observations. chez les témoins WT appariés selon l'âge (Fig. 7A – E; pour la synaptophysine, diminutions de 32, 6% et 47, 8% dans le DG et CA3, respectivement; diminutions de 42, 5% dans CA3 pour GluA1). Après la surexpression de Cdk5 induite par le virus, nous avons constaté que les diminutions des protéines synaptiques étaient significativement restaurées chez les souris APP/PS1 (Fig. 7E, F), ce qui est cohérent avec les résultats chez les souris APP/PS1 traitées avec du sérum et l'anticorps Ly6G (Supplémentaire Fig. 13A–H). De plus, aucune différence d'expression de GluA1, de synaptophysine ou de PSD95 dans le cortex n'a été observée dans les différents groupes par analyse Western blot (Fig. 13I, J supplémentaires).

Images confocales représentatives (A–D) et quantification (E) de la synaptophysine et de GluA1 dans CA1, CA3 et DG dans l'hippocampe de souris WT, de souris APP/PS1 traitées avec AAV-Cdk5 et des témoins. IR : immunoréactivité ; Barre d'échelle, 100 μm. F Analyse Western blot des protéines synaptiques, notamment GluA1, PSD95 et la synaptophysine dans l'hippocampe. Les données sont représentées par la moyenne ± sem ; Tests de comparaisons multiples ANOVA et LSD unidirectionnels, n = 4 souris par groupe (plus de 10 champs d'image de 5 tranches de cerveau par animal ont été analysés et moyennés en tant que valeur); *p < 0,05 ; **p < 0,01, ns non significatif. G Schéma des expériences de H–K. H Images confocales et reconstruction 3D des processus microgliaux (Cx3cr1-GFP) engloutissant les points lacrymaux GluA1+, le pourcentage de points lacrymaux engloutis par la microglie a été évalué. Les données sont représentées par la moyenne ± sem ; tests de comparaison multiple ANOVA et LSD unidirectionnels, n = 5 souris par groupe (plus de 34 microglies provenant de 5 tranches de cerveau par animal ont été analysées et moyennées comme valeur); *p < 0,05 ; **p < 0,01. I Points ponctuels engloutis distribués à l'intérieur de la microglie, la distance est inférieure à 0 μm de la surface microgliale ; et des points lacrymaux contactés distribués à l'extérieur de la microglie, mais la distance est inférieure à 0,25 μm de la surface microgliale. Des points lacrymaux violets ont été montrés en I (ci-dessous). J La reconstruction 3D des processus microgliaux et des points lacrymaux GluA1+ chez les souris WT, ainsi que les plaques Aβ (bleues) chez les souris APP/PS1, et les points lacrymaux GluA1 contactés (moins de 0,25 μm) ont été analysés (n = 25–44 cellules de 7 souris) . Analyse K Sholl de la microglie reconstruite en 3D (n = 14–21 cellules de 3 souris par groupe). *p < 0,05 ; **p < 0,01. Barre d'échelle : 1 μm en H, I ; 5 μm en J, 10 μm en K. L Traces représentatives de mEPSC dans les neurones pyramidaux DG de souris de type large, souris APP/PS1 et souris APP/PS1 traitées avec AAV-Cdk5, barre d'échelle : 1 s, 20 pA. M Fréquences moyennes des mEPSC. N Amplitudes moyennes des mEPSC ; essai de Kolmogorov-Smirnov ; *p < 0,05 ; ***p < 0,001 ; n = 19 ou 20 cellules de 3 souris/groupe en M et N.

La microglie favorise l'élagage des synapses de manière dépendante du complément [52]. La perte synaptique observée chez les souris AD peut être due à une augmentation de la phagocytose microgliale [27, 52]. Pour tester si la microglie interagit directement avec les synapses neuronales dans la présente étude, nous avons étudié l'association de microglies exprimant des reporters fluorescents avec des points synaptiques (GluA1 +) à l'aide d'images de reconstruction 3D de l'hippocampe chez des souris APP / PS1 (Fig. 7G). Nous avons classé les synapses GluA1 + en deux sous-ensembles: points ponctuels engloutis (distribués à l'intérieur de la microglie à une distance inférieure à 0 μm de la surface microgliale; points ponctuels jaunes sur la Fig. 7H; points ponctuels violet clair sur la Fig. 7I) et points ponctuels en contact (distribués à l'extérieur de la microglie avec une distance inférieure à 0,25 μm de la surface microgliale ; points lacrymaux violets sur la figure 7I, ci-dessous). Nos données ont révélé que des diminutions significatives des taches synaptiques GluA1 + englouties ou contactées par la microglie Cx3cr1GFP ont été sauvées chez des souris APP / PS1 surexprimées par Cdk5 (Fig. 7H – J). L'analyse Sholl a montré que la réduction de la complexité de la ramification microgliale chez les souris APP / PS1 était normalisée par la surexpression de Cdk5 dans les cellules endothéliales cérébrales (Fig. 7K).

Pour examiner plus en détail si la fonction synaptique altérée chez les souris APP/PS1 a été sauvée après le traitement par AAV-Cdk5, nous avons examiné les propriétés synaptiques des neurones pyramidaux dans le DG. Des enregistrements de cellules entières à partir de neurones pyramidaux ont montré que la fréquence, mais pas l'amplitude, du mEPSC spontané était considérablement réduite chez les souris APP / PS1, alors que ces effets étaient restaurés à des niveaux de type large après la surexpression de Cdk5 (Fig. 7L – N). Avec les données de la synapse GluA1 +, ces données ont indiqué que la surexpression de Cdk5 a restauré les entrées synaptiques réduites dans les neurones pyramidaux DG chez les souris APP / PS1.

Comme prévu, la microglie chez les souris APP / PS1 ayant reçu un anticorps isotype IgG présentait une morphologie amiboïde, exprimait des niveaux élevés de CD68 et présentait des volumes plus petits (Fig. 14A – C supplémentaires). Notamment, la surexpression de Cdk5, le traitement par le sérum et les anticorps Ly6G ont non seulement atténué de manière significative l'activation excessive de la microglie (Iba-1 + / CD68 +), mais ont également partiellement déplacé la durée et le volume du processus de la microglie vers la forme homéostatique (Fig. 14A – F supplémentaire) . Le sérum n'a modifié ni les distributions d'Aβ (Fig. 15A – D supplémentaires), ni les Aβ40 et Aβ42 solubles dans le RIPA et le SDS dans le cerveau (Fig. 15E – L supplémentaires), ce qui suggère que ces effets sur la microglie sont indépendants des plaques d'Aβ. De plus, nous avons identifié les niveaux de phosphore-Tau et de Tau total dans le cerveau après traitement au sérum, qui n'avaient aucune influence sur les niveaux de Tau total et de phosphore-Tau dans l'hippocampe et le cortex du cerveau APP/PS1 (Fig. 16A supplémentaire). -D). Par ailleurs, des multimères Tau de 140 kDa (bande de haut poids moléculaire) ont également été mesurés après injection de sérum. De même, les niveaux de Tau de poids moléculaire élevé sont restés inchangés par rapport aux témoins (Fig. 16A – D supplémentaire). Dans l'ensemble, nos résultats ont révélé que l'inhibition de l'infiltration des neutrophiles par le sérum améliorait les troubles cognitifs, en partie en atténuant la perte synaptique et la neuroinflammation dans l'hippocampe du cerveau APP/PS1.

Le système immunitaire inné, y compris les neutrophiles périphériques et la microglie centrale, joue un rôle important dans les troubles neurodégénératifs [4, 6, 39, 55]. Les neutrophiles sont les cellules effectrices clés de l'immunité innée précoce et contribuent à l'inflammation du cerveau [10, 56] et de la périphérie [6]. Dans cette étude, nous avons constaté que l'injection de sérum bloquait le recrutement de neutrophiles hyperréactifs dans le cerveau et réduisait les pièges extravasculaires de neutrophiles (NET), améliorant ainsi les troubles de la mémoire chez les souris AD. Mécaniquement, notre étude a élucidé les mécanismes de trafic sous-jacents à l'infiltration de neutrophiles liée au facteur sérique VEGF-A, qui a médié l'activité endothéliale de Cdk5 dans la diminution de la sécrétion de CXCL1 dans le cerveau AD. Nous avons en outre révélé que l'inhibition de l'infiltration des neutrophiles dans le cerveau AD par la surexpression sérique et endothéliale de Cdk5 améliorait les déficits de mémoire, au moins partiellement en réduisant l'élagage des synapses par la microglie et en augmentant l'activité synaptique dans l'hippocampe.

Des recherches antérieures ont montré que le blocage de la signalisation Ly6G, un marqueur spécifique des neutrophiles, diminuait la migration des neutrophiles vers les sites inflammatoires vasculaires et neuraux [57]. En conséquence, nous avons démontré que l'injection de sérum réduisait considérablement l'adhérence des neutrophiles, en particulier près des vaisseaux cérébraux et de la plaque Aβ, et améliorait les troubles de la mémoire chez les souris AD. De plus, après l'injection de sérum, les segments capillaires cérébraux ont été restaurés et l'infiltration des neutrophiles a été bloquée, augmentant le flux sanguin cérébral et la perfusion [10], ce qui a amélioré les capacités cognitives. L'analyse PPI basée sur les DEP a également montré une cytokine dérivée du sérum VEGF-A et une chimiotaxie médiée par CXCL1. De manière constante, le VEGF-A recombinant a eu des effets similaires à l'anticorps Ly6G en bloquant l'infiltration des neutrophiles dans le cerveau AD. Nous avons donc conclu que le VEGF-A dans le sérum dérivé de type sauvage améliorait les troubles de la mémoire chez les souris AD, probablement en raison d'une diminution de l'infiltration des neutrophiles.

La signalisation VEGF est nettement réduite dans le cerveau avec le vieillissement, tandis que l'augmentation de la signalisation VEGF protège contre la perte capillaire liée à l'âge, la perfusion compromise et l'oxygénation tissulaire réduite [22], qui sont également observées chez les patients atteints de MA [58,59,60]. De plus, le VEGF dans le LCR est associé aux performances de la mémoire longitudinale, en particulier chez les individus amyloïdes et Tau-positifs [61], et les variants liés au VEGF pourraient sembler influencer le risque de MA [62]. Par conséquent, ces rapports suggèrent que la signalisation VEGF est impliquée dans le développement de la MA. Des études antérieures ont indiqué que l'inhibition de l'activité de Cdk5 dans les cellules hypophysaires de rat réduisait l'expression du VEGF-A [63, 64], ce qui implique qu'un lien sous-jacent existe entre le VEGF-A et le Cdk5 dans l'endothélium. Fait intéressant, dans la présente étude, le VEGF-A recombinant a directement empêché l'inhibition de Cdk5 médiée par Aβ et favorisé la prolifération des cellules endothéliales dans les cellules bEnd.3, et a empêché la perte capillaire cérébrale dans un modèle de souris AD.

CDK5, membre de la famille des kinases cycline-dépendantes, régule la prolifération, la migration et l'angiogenèse des cellules endothéliales et est impliquée dans les principales caractéristiques pathologiques de la MA [65,66,67,68]. Dans notre étude, la surexpression endothéliale de Cdk5 a inhibé la sécrétion de CXCL1 et l'infiltration périphérique de neutrophiles dans le cerveau AD. En effet, une étude antérieure a rapporté que l'inactivation de Cdk5 spécifique de l'endothélium entraînait des crises spontanées chez la souris en régulant à la hausse l'astrogliose induite par CXCL1 [48]. Associés aux découvertes d'une expression plus faible de l'ARNm de Cdk5 dans l'hippocampe [69] et d'une expression accrue du gène CXCL1 dans les microvaisseaux corticaux préfrontaux des patients atteints de MA liée à Tau [70], ces résultats indiquent qu'une déficience en Cdk5 dans les cellules endothéliales cérébrales favorise la sécrétion de CXCL1 [71] . Ainsi, notre étude démontre que le VEGF-A dérivé du sérum supprime la sécrétion de CXCL1 en modulant l'activité de Cdk5 et en empêchant ainsi la migration des neutrophiles dans le cerveau.

L'interaction des neutrophiles et de la microglie a été rapportée dans un modèle inflammatoire induit par le LPS en utilisant la microscopie intravitale à deux photons [72]. De plus, l'IL-1β dérivé de la microglie et la chimiokine CXCL1 recrutent des neutrophiles dans un SNC infecté par un champignon, d'une manière dépendante de l'adaptateur Syk CARD9 [45]. Ici, nous avons montré que l'activation microgliale et la perte synaptique étaient empêchées par le sérum, la surexpression endothéliale de Cdk5 ou le blocage de l'infiltration des neutrophiles. Ainsi, les neutrophiles peuvent fournir des signaux pro-inflammatoires pour favoriser l'élagage microglial dans un modèle de souris AD. Fait intéressant, nous avons démontré que les neutrophiles infiltrants libéraient des NET dans plusieurs zones du cerveau dans un modèle de souris AD, ce qui était prévenu par un anticorps anti-Ly6G et un traitement au sérum. Cette interaction peut représenter un mécanisme intrigant pour l'activation microgliale médiée par les NET et l'élagage des synapses neuronales [73]. Des études futures sont nécessaires pour explorer les rôles des TNE productrices de neutrophiles dans l'activation microgliale et l'élagage synaptique dans un modèle de souris AD.

Fait important, nous avions précédemment démontré que le recrutement de monocytes dans le cerveau via l'activation immunitaire pouvait exercer des effets bénéfiques contre la MA [27, 74, 75]. Dans la présente étude, bien que les monocytes périphériques aient augmenté après le traitement au sérum, nous avons constaté que l'infiltration des neutrophiles, plutôt que celle des monocytes/macrophages, était significativement réduite dans le cerveau des souris APP/PS1. C'est la raison pour laquelle nous nous concentrons spécifiquement sur les rôles cruciaux des neutrophiles infiltrants dans les pathologies de la MA. Le rajeunissement sanguin pourrait également moduler l'expression de divers gènes impliqués dans les voies de signalisation neuronales vers des niveaux normaux. Par exemple, il existe des facteurs systémiques dans le plasma jeune qui sont nécessaires aux bénéfices thérapeutiques, notamment l'activation de la signalisation Notch en fonction de la régénération [76], la restauration de la voie du facteur de différenciation de croissance 11 [12, 77], la régulation à la hausse des niveaux d'ocytocine [78] et activation de la protéine de liaison à l'élément de réponse à l'AMP cyclique.

Le VEGF-A est une cytokine neuroprotectrice qui favorise la neurogenèse et l'angiogenèse dans le cerveau [79, 80]. De manière cohérente, nous avons fourni des preuves que le sérum a sauvé le niveau insuffisant de VEGF-A circulant chez les souris AD. Le VEGF-A recombinant a favorisé la prolifération des cellules endothéliales in vitro et a empêché la perte capillaire in vivo. Ainsi, le VEGF-A peut être important pour améliorer la perfusion cérébrale et le flux sanguin pour une oxygène sanguin suffisant, en particulier chez les personnes âgées [22, 79] et la maladie d'Alzheimer [81]. Par conséquent, la signalisation endothéliale VEGF-A/Cdk5 peut être une stratégie thérapeutique potentielle pour améliorer la pathologie de la MA en régulant l'infiltration des neutrophiles.

En plus du VEGF-A, d'autres facteurs sanguins enrichis, tels que VCAM1, HGF et la clustérine, qui sont impliqués dans la fonction des cellules endothéliales vasculaires, peuvent également améliorer les fonctions cérébrales. En effet, une déficience du gène endothélial cérébral VCAM1 contrecarre les effets néfastes du plasma âgé sur les jeunes cerveaux, notamment la réactivité microgliale et la fonction de mémoire [16]. Il a récemment été démontré que le HGF a des effets bénéfiques sur la neurogenèse hippocampique et la fonction cognitive chez les souris SAMP8, un autre modèle murin de la MA [82]. La clustérine, un inhibiteur de la cascade du complément, peut se lier aux cellules endothéliales cérébrales et réduire la neuroinflammation chez les souris mThy-1-hAPP751 [83]. On ne sait toujours pas si d'autres facteurs sériques fonctionnent avec le VEGF-A, mais nos travaux étendent l'application des facteurs transmissibles par le sang pour restaurer les fonctions cérébrales de la MA. Une thérapie plus ciblée ou combinée utilisant des facteurs sériques justifie des études supplémentaires.

Le VEGF a de larges fonctions dans de multiples voies de signalisation dans une variété de types de cellules. Par exemple, le blocage de l'effet du VEGF sur les astrocytes a inversé la dégradation de la BHE [84], tout en inhibant la signalisation luminale du VEGF, l'intégrité de la BBB et le flux sanguin cérébral ont augmenté et la densité capillaire réduite chez les souris APP/PS1 [85]. Dans cette étude, nous avons observé qu'une injection de VEGF-A à faible dose a restauré la densité capillaire cérébrale dans la même souche du modèle de souris AD, ce qui est cohérent avec les données montrant que le traitement anti-VEGF réduisait la densité capillaire dans le travail d'Ali. Cependant, aucun changement significatif dans l'intégrité et la perméabilité de la BBB n'a été observé dans notre modèle de souris AD après l'injection de VEGF-A. La raison possible est que le modèle de souris APP/PS1 (8 mois) que nous utilisons est plus jeune que les animaux (10 à 14 mois) utilisés dans l'étude d'Ali. Une autre explication est qu'une augmentation transitoire de la perméabilité à la BHE peut survenir après un traitement à faible dose de VEGF-A, qui peut être restaurée en quelques heures [86]. Par conséquent, de manière compréhensible, la perméabilité et l'intégrité de la BBB n'ont pas été davantage aggravées chez les souris APP/PS1 traitées au VEGF-A.

De plus, de nombreuses protéines circulantes ont été identifiées comme étant impliquées dans la régulation de la perméabilité de la BHE, telles que l'endothéline-1 (EDN1) et le fibrinogène (FG), qui seraient augmentées dans le cortex frontal des patients atteints de MA [87]. Par conséquent, le rôle particulier du VEGF-A dans la perméabilité de la BBB, la densité capillaire et le flux sanguin en fonction des types de cellules, des modèles de maladie et des stades de la maladie doit être élucidé. De plus, la question de savoir si le sérum de 8 mois pouvait avoir les mêmes effets positifs sur la MA que le sérum de 4 à 6 mois n'était toujours pas résolue. Il s'agit d'une limite de la présente étude qui devra être abordée à l'avenir.

Il a été proposé que les facteurs transmissibles par le sang provenant du sérum/plasma jeune ou d'exercice profitent aux fonctions cérébrales, y compris la neurogenèse, la plasticité synaptique et l'inflammation ainsi que l'apprentissage et la mémoire, à la fois chez les animaux âgés et dans les modèles de souris AD. Ainsi, l'application de facteurs sanguins dans d'autres maladies neurodégénératives mérite d'être envisagée. Nos données fournissent la preuve que la signalisation endothéliale VEGF-A/Cdk5 médie les molécules trafiquant les neutrophiles, soulignant que le VEGF-A/Cdk5 endothélial cérébral peut servir de cible thérapeutique potentielle pour la maladie d'Alzheimer (Fig. 8).

Le rôle proposé de la signalisation endothéliale VEGF-A/Cdk5/CXCL1 dans le processus d'infiltration des neutrophiles dans le cerveau chez les souris AD. Le VEGF-A dérivé du sérum de type sauvage supprime l'expression de CXCL1 endothéliale vasculaire cérébrale via une régulation à la hausse de l'activité de Cdk5, arrêtant ainsi le recrutement des neutrophiles dans le cerveau chez les souris AD et améliorant les troubles de la mémoire. VEGF-AR Récepteur VEGF-A, CXCR2 CXC motif récepteur de chimiokine 2.

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Nous remercions Mme Lin Zhang, le Dr Hongyang Zhang et Bs. Zhenyan Yu pour leur aimable soutien. Nous remercions également Mme Qunfang Yuan et le Dr Juntao Zou pour les suggestions d'expériences liées à l'immunité innée. Nous remercions la plate-forme Core Lab pour les sciences médicales de l'école de médecine de Zhongshan, Université Sun Yat-sen.

Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation of China (82271473, 81971021, 81901339, 82172547 et 82172636), le Fundamental Research Funds for the Central Universities (19ykpy99), le Science Innovation 2030-Brain Science and Brain-Inspired Intelligence Technology Major Project (2021ZD0201100 et 2021ZD0201102), le projet de planification scientifique et technologique de Guangzhou (202002030441) et la Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (2019A1515011184, 2020A151501001).

Fangfang Qi

Adresse actuelle : Department of Neurology, Mayo Clinic, Rochester, MN, 55905, USA

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Fangfang Qi, Zejie Zuo, Kaishun Hu, Shengwen Wang, Long-Jun Wu, Kaihua Guo.

Département d'anatomie et de physiologie, Laboratoire clé de la fonction cérébrale et des maladies de la province du Guangdong, Centre de technologie médicale avancée, Premier hôpital affilié, École de médecine de Zhongshan, Université Sun Yat-sen, Guangzhou, 510080, Chine

Fangfang Qi, Rui Wang, Tong Wu, Hao Liu, Jiaoling Tang, Qingbo Wang, Yunjie Yang, Jie Xu, Zhibin Yao et Kaihua Guo

Département éditorial du Journal de l'Université Sun Yat-sen, Guangzhou, 510080, Chine

Fangfang Qi

Département de médecine de réadaptation, troisième hôpital affilié, Université Sun Yat-sen, Guangzhou, 510630, Chine

Zejie Zuo

Guangdong Provincial Key Laboratory of Malignant Tumour Epigenetics and Gene Regulation, Guangdong-Hong Kong Joint Laboratory for RNA Medicine, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou, 510120, Chine

Kaishun Hu

Programmes quinquennaux de médecine clinique en 2017, École de médecine, Université Sun Yat-sen, Shenzhen, 528406, Chine

Yufeng Xie

Département de neurologie, Hôpital Sun Yat-sen Memorial, Université Sun Yat-sen, Guangzhou, 510120, Chine

Liren Tan

Centre de biologie des cellules souches et d'ingénierie tissulaire, Laboratoire clé pour les cellules souches et l'ingénierie tissulaire, Ministère de l'éducation, Université Sun Yat-sen, Guangzhou, 510080, Chine

Xiaoran Zhang

Département de neurologie, Mayo Clinic, Rochester, MN, 55905, États-Unis

Jiaying Zheng et Long-Jun Wu

Département de neurochirurgie, Hôpital Sun Yat-sen Memorial, Université Sun Yat-sen, Guangzhou, 510120, Chine

Shengwen Wang

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KG, KH, L-JW et FQ ont contribué à la conception de cette étude et à l'analyse des données. SW, L-JW et FQ ont rédigé le manuscrit. FQ, SW, ZZ, RW, YX, HL, JT et TW ont effectué la plupart des expériences, y compris l'évaluation du comportement, le microscope confocal à balayage laser et les expériences de biochimie. Sérum administré par XZ et QW. LT a réalisé les expériences in vitro. Tous les auteurs restants ont participé à la génération des données originales et ont fourni une évaluation critique du manuscrit. Tous les auteurs ont approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Shengwen Wang, Long-Jun Wu ou Kaihua Guo.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Qi, F., Zuo, Z., Hu, K. et al. Le VEGF-A dans le sérum protège contre les troubles de la mémoire chez les souris transgéniques APP/PS1 en bloquant l'infiltration des neutrophiles. Mol Psychiatrie (2023). https://doi.org/10.1038/s41380-023-02097-w

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Reçu : 28 juillet 2022

Révisé : 17 avril 2023

Accepté : 27 avril 2023

Publié: 06 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41380-023-02097-w

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