Isolement de champignons filamenteux saprophytes à partir d'échantillons fécaux aviaires et évaluation de son activité prédatrice sur les oocystes coccidiens

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8965 (2023) Citer cet article

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Les souches fongiques utilisées dans la lutte biologique contre les parasites gastro-intestinaux animaux ont été principalement isolées du sol des pâturages, de la matière organique en décomposition et des matières fécales des herbivores et des carnivores. Cependant, leur isolement des oiseaux et l'évaluation de l'activité prédatrice contre les parasites gastro-intestinaux aviaires ont été rares jusqu'à présent. Cette recherche visait à isoler des champignons filamenteux à partir d'échantillons fécaux aviaires et à évaluer leur activité prédatrice contre les coccidies. Un pool de 58 échantillons fécaux de poulets, de poules pondeuses et de paons, précédemment collectés entre juillet 2020 et avril 2021, a été utilisé pour l'isolement de champignons filamenteux et l'évaluation de leur activité prédatrice in vitro contre les oocystes coccidiens, en utilisant un milieu Water-Agar et des coprocultures. La technique de flottation Willis a également été réalisée pour obtenir des suspensions concentrées d'oocystes. Un total de sept isolats de Mucor a été obtenu, étant les seuls taxons fongiques identifiés, et tous ont présenté une activité lytique contre les coccidies. Les isolats FR3, QP2 et SJ1 avaient des efficacités coccidiostatiques significatives (inhibition de la sporulation) supérieures à 70 %, tandis que les isolats FR1, QP2 et QP1 avaient des efficacités coccidicides (destruction des oocystes) de 22 %, 14 % et 8 %, respectivement, après 14 jours d'incubation, étant un processus graduel et dépendant du temps. À notre connaissance, il s'agit du premier rapport concernant l'isolement de champignons prédateurs indigènes à partir de matières fécales aviaires et la démonstration de leur activité lytique contre les coccidies.

La coccidiose aviaire est l'une des maladies parasitaires les plus importantes affectant les oiseaux domestiques et exotiques dans le monde, étant responsable de graves problèmes sanitaires et économiques dans les élevages de volailles, les parcs ornithologiques et les collections d'oiseaux privées1,2,3,4,5.

Le contrôle de cette maladie parasitaire est principalement réalisé par la chimiothérapie (par exemple, les anticoccidiens) et les vaccins. Cependant, en raison des préoccupations croissantes concernant la résistance aux médicaments antiparasitaires, des recherches approfondies ont été menées dans le but de développer de nouvelles stratégies alternatives ou complémentaires pour contrôler la coccidiose dans les collections d'oiseaux, y compris l'amélioration de l'alimentation, le nettoyage et la désinfection de la maison, ainsi que des solutions naturelles comme les extraits de plantes, les huiles essentielles, les probiotiques et les prébiotiques, et les algues5,6,7,8,9. Plus récemment, des chercheurs portugais, espagnols, brésiliens et danois ont proposé l'utilisation de champignons prédateurs (appelés aussi "champignons nématophages" ou "champignons helmintophages") aux caractéristiques larvicides et ovicides en complément des médicaments antiparasitaires pour le contrôle des parasitoses gastro-intestinales chez les oiseaux domestiques et exotiques10.

Le biocontrôle des infections parasitaires gastro-intestinales animales à l'aide de champignons prédateurs s'est déjà avéré être un complément précis et durable aux médicaments antiparasitaires, atteignant des efficacités allant jusqu'à 97% dans la réduction de l'excrétion d'œufs de parasites (nombre d'œufs par gramme de fèces, EPG) chez les chevaux et les ruminants11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Cependant, seules quelques études in vitro et in vivo ont évalué la performance des champignons prédateurs contre les parasites affectant d'autres hôtes animaux, à savoir les oiseaux, les chiens, les ratons laveurs et les wapitis10,19,24,25,26,27,28.

Les champignons prédateurs sont également connus pour leur ubiquité, ayant été principalement isolés du sol agricole, de la matière organique en décomposition et des excréments d'animaux29. Des études réalisées en Amérique, en Europe, en Asie, en Océanie et en Antarctique ont rapporté l'isolement de champignons filamenteux capables de précéder les formes parasitaires intestinales, à partir de matières fécales appartenant à une grande diversité d'espèces animales, notamment : ovins, caprins et bovins30,31,32,33,34 ; buffle d'eau35; ânes34 ; coati, raton laveur, lynx eurasien, ours brun, mouflon, gazelle, bison, dromadaire, guanaco et wallaby33 ; et chevaux31,33. Les taxons les plus couramment isolés de champignons prédateurs aux propriétés larvicides sont Duddingtonia flagrans (Dudd.) RC Cooke (1969), Arthrobotrys spp., et Monacrosporium spp., tandis que Pochonia chlamydosporia (Goddard) Zare & W. Gams (2001), Mucor circinelloides Tiegh (1875), Purpureocillium lilacinum (Thom) Luangsa- ard, Houbraken, Hywel-Jones et Samson (2011), Verticillium spp. et Trichoderma spp. ont montré qu'ils présentaient des propriétés ovicides17,29,36. Néanmoins, des études sur l'isolement de ces champignons à partir d'échantillons fécaux aviaires n'ont pas encore été rapportées dans la littérature scientifique.

La recherche actuelle visait à isoler des champignons filamenteux indigènes à partir d'échantillons fécaux d'oiseaux domestiques et exotiques et à évaluer son activité prédatrice in vitro sur les oocystes coccidiens.

À partir du pool de 58 excréments de poules pondeuses et de paons, il a été possible d'obtenir sept isolats de champignons filamenteux : trois de poules (FR1, FR2 et FR3) et quatre de paons (SJ1 et SJ2 – collection d'oiseaux exotiques SJ ; QP1 et QP2 – collection d'oiseaux exotiques QP).

La caractérisation fongique macroscopique et microscopique a révélé des résultats similaires pour la plupart des isolats : conidies ovoïdes et hyalines, sans septa ; sporanges jaunâtres et non ramifiés, soutenus par une columelle ; hyphes sans septa ; colonies gris-blanches et duveteuses. Cependant, l'isolat QP1 avait des conidies de forme oblongue et des hyphes plus minces que les autres isolats (Fig. 1; Tableau 1). Ainsi, l'évaluation morphologique a permis d'identifier de manière présomptive tous les isolats comme Mucor sp. Aucun autre taxon fongique n'a été identifié.

Conidies, sporanges et hyphes des isolats de Mucor (FR1—M. circinelloides ; FR2—M. circinelloides ; FR3—M. circinelloides ; SJ1—M. circinelloides ; SJ2—M. circinelloides ; QP1—M. lusitanicus ; QP2—M. circinelloides ; originaux).

Le téléchargement des séquences ITS1-5.8S-ITS2 dans Blastn Suite a permis d'établir un Top 3 de similarité pour chaque isolat fongique : FR1 présentait plus de 99,5 % de similarité avec deux souches de Mucor circinelloides (numéros d'accession GenBank OW988287 et OW985400) ; FR2 avait plus de 99 % de similarité avec trois souches de M. circinelloides (FN598920, HQ914900 et KJ584557) ; FR3 présentait une similarité de 99,8 % avec deux souches de M. circinelloides (MK396486 et KT336541) ; SJ1 présentait une similitude de 100 % avec trois souches de M. circinelloides (KX620480, OW987678 et OW987665) ; SJ2 avait plus de 99,5 % de similarité avec trois souches de M. circinelloides (MT991775, NR_126116 et FJ713065) ; QP1 avait une similarité de 99,8 % avec Mucor sp. (MK164174), Mucor lusitanicus (OP163597) et Mucor racemosus (MN726736); et QP2 présentait une similitude de 100 % avec deux souches de M. circinelloides (MT603934 et OW988287) (tableau 2).

Analyse phylogénétique des séquences ITS1-5.8S-ITS2 de tous les isolats, en utilisant les souches Mucor circinelloides CBS 195.68, Mucor lusitanicus CBS 108.17, Mucor racemosus f. racemosus CBS 260.68 et Mucor fragilis, également obtenus par analyse BLAST, ont permis d'identifier les isolats FR1, FR2, FR3, SJ1, SJ2 et QP2 comme des séquences d'ADNr de Mucor circinelloides, tandis que l'isolat QP1 a été identifié comme Mucor lusitanicus (Fig. 2).

Arbre phylogénétique à vraisemblance maximale basé sur la région ITS1-5.8S-ITS2, y compris les séquences des isolats et des souches de référence GenBank. Le bootstrap de vraisemblance est indiqué dans chaque branche, et seules les valeurs supérieures à 50 ont été prises en compte. Les sept isolats de Mucor sont affichés en gras, suivis de leurs numéros d'accès GenBank respectifs. Les carrés de couleur représentent les collections d'oiseaux à partir desquelles les champignons ont été obtenus : bleu — poulets ; vert et orange - paons des collections exotiques SJ et QP, respectivement.

Des essais in vitro ont révélé que tous les isolats développaient une activité prédatrice contre les oocystes d'Eimeria, à la fois dans le milieu WA (Fig. 3) et dans les coprocultures (Fig. 4). Il a été possible d'observer que la présence d'oocystes déclenchait le développement d'hyphes de champignons et leur adhésion aux capsules des oocystes (activité de type 1). De plus, pendant 30 jours d'exposition fongique, les oocystes ont commencé à changer de morphologie, montrant leurs structures internes mal marquées et développant des vacuoles (type 2), jusqu'à ce que les spores commencent à proliférer dans la cellule de l'oocyste et conduisent finalement à sa perturbation (type 3).

Prédation développée par les isolats de Mucor contre les oocystes coccidiens, en milieu WA (FR1—M. circinelloides; FR2—M. circinelloides; FR3—M. circinelloides; SJ1—M. circinelloides; SJ2—M. circinelloides; QP1—M. lusitanicus; QP2 -M. circinelloides ; originaux).

Eimeria sp. oocystes présentant différents changements morphologiques, suite à des coprocultures avec des champignons (A, C, E—déformation de la capsule de l'oocyste ; B, D—rupture de l'oocyste et perte du contenu cytoplasmique ; F—oocyste sporulé ; originaux).

Les isolats fongiques ont montré des performances lytiques différentes lorsqu'ils étaient exposés au microenvironnement fécal (essai de gobelets en plastique), en termes de réduction de la sporulation des coccidies et d'endommagement de la structure des oocystes : les isolats FR3, QP2, SJ1, SJ2 et FR2 avaient des efficacités de réduction significatives de 85 % (p < 0,001), 85 % (p < 0,001), 73 % (p = 0,001), 69 % (p = 0. 001) et 65 % (p = 0,003), respectivement, sur la limitation de la sporulation des oocystes, tandis que les isolats FR1, QP2 et QP1 avaient des efficacités de réduction significatives de 22 % (p < 0,001), 14 % (p < 0,001) et 8 % (p = 0,01), respectivement, sur la destruction des oocystes, mais seulement après 14 jours d'exposition. De plus, l'efficacité ovicide était dépendante du temps, puisque la viabilité des oocystes différait significativement entre la première et la deuxième semaine de l'essai, après exposition aux isolats FR1 (p < 0,001) et QP1 (p = 0,001). La viabilité des oocystes est restée stable dans la cupule témoin pendant le test, avec des pourcentages de viabilité égaux à 97 % et 94 %, après 1 et 2 semaines d'incubation, respectivement (tableau 3), sans qu'aucune différence statistique n'ait été enregistrée entre les deux semaines (p = 0,302).

Les champignons prédateurs sont un groupe de champignons filamenteux saprophytes connus pour leur capacité à précéder et à détruire les larves, les œufs et les oocystes des parasites affectant les animaux et les plantes. Outre ces caractéristiques fonctionnelles, ils sont également connus pour d'autres attributs, à savoir la possibilité d'être isolés d'une grande diversité d'échantillons environnementaux, y compris les sols agricoles, la matière organique en décomposition et les excréments d'animaux. Leur isolement des matières fécales, qui hébergent fréquemment des formes environnementales de parasites intestinaux, prouve que les champignons et les parasites établissent naturellement des relations dans le microenvironnement fécal et du sol, les premiers étant une source nutritionnelle pour les champignons prédateurs17,29,36. Aussi, l'isolement de ce type de champignons à partir de fèces d'animaux sains démontre l'équilibre dans lequel ces micro-organismes se trouvent au sein du milieu intestinal, et donc leur innocuité pour les animaux immunocompétents17,19,20,28,37,38,39.

A notre connaissance, cette étude a permis d'isoler pour la première fois des champignons filamenteux dotés de capacités prédatrices à partir d'échantillons fécaux d'oiseaux, suggérant que les oiseaux sont également des "excréteurs naturels" de ce type de champignons, comme précédemment rapporté par plusieurs auteurs pour les espèces de mammifères, à savoir les ruminants, les chevaux et les carnivores détenus dans les fermes et les parcs zoologiques30,31,32,33,34,35.

Pour cette recherche, l'utilisation d'échantillons fécaux aviaires positifs pour les parasites intestinaux, ainsi que leur inoculation initiale sur un milieu pauvre comme le Water-Agar, ont permis de restreindre les groupes de champignons capables de se développer dans ce milieu et de stimuler la croissance des seuls champignons prédateurs potentiels. De plus, outre le milieu WA, les étapes d'isolement comportaient également de la gélose à la farine de blé pour une croissance, une purification et un stockage rapides des hyphes12. L'utilisation de ces deux milieux, sans supplémentation antibiotique, a permis d'isoler et de stocker avec précision les champignons prédateurs, dans une approche plus rapide et économique par rapport à d'autres milieux plus nutritifs comme la Sabouraud Agar, la Corn Meal Agar, la Potato Dextrose Agar ou la Malt Extract Agar, qui sont souvent supplémentées en Chloramphénicol pour ces procédures.

Des isolats de champignons filamenteux ont été obtenus dans tous les sites sélectionnés et à partir des deux espèces modèles d'oiseaux utilisées, bien qu'aucun isolat n'ait été obtenu à partir d'échantillons de poules pondeuses. L'analyse morphologique a permis de conclure que tous les isolats appartiennent au genre Mucor, les résultats qualitatifs et quantitatifs suivis pour les conidies, les sporanges et les hyphes étant conformes à la littérature publiée concernant ce genre40,41. De plus, l'évaluation moléculaire basée sur les séquences d'ADNr ITS1-5.8S-ITS2 a conduit à l'identification de deux espèces fongiques, Mucor circinelloides (FR1, FR2, FR3, SJ1, SJ2 et QP2) et Mucor lusitanicus (QP1), et prouvant ainsi que ces séquences cibles sont bien adaptées pour être utilisées dans l'identification moléculaire des champignons prédateurs, comme démontré dans d'autres études34,42,43,44,45.

Tous les isolats fongiques ont développé une activité lytique contre les oocystes coccidiens dans le milieu WA et dans le microenvironnement fécal, permettant d'identifier toutes les étapes de l'activité prédatrice. En ce qui concerne le premier test, les efficacités antérieures différaient entre les souches, FR1 et QP2 ayant été les plus précises sur la destruction d'Eimeria spp. oocystes (efficacités de 22% et 14%, respectivement), tandis que les souches FR3, QP2 et SJ1 présentaient des efficacités coccidiostatiques significatives, supérieures à 70%. Ces résultats sont conformes aux études antérieures réalisées par des chercheurs portugais et espagnols27,33, qui ont démontré une activité prédatrice in vitro développée par M. circinelloides contre les œufs et les oocystes de parasites intestinaux affectant différents hôtes animaux. De plus, il constitue le premier article de recherche original rapportant l'activité coccidicide et coccidiostatique de Mucor spp. contre les coccidies aviaires. Aussi, les recherches en cours révèlent pour la première fois les compétences prédatrices développées par M. lusitanicus contre les formes parasitaires, qui ont eu un impact significatif sur la viabilité des oocystes après 14 jours d'incubation (8%), malgré une efficacité inférieure à celles obtenues pour les autres souches. La capacité de Mucor spp. antidater les formes parasitaires intestinales aviaires est l'une des lignes de recherche d'auteurs espagnols et portugais appartenant respectivement au groupe de recherche COPAR (Faculté de médecine vétérinaire - Université de Saint-Jacques-de-Compostelle) et à la LPPD (Faculté de médecine vétérinaire - Université de Lisbonne).

La détection de résultats significatifs pour l'activité coccidicide fongique seulement après 14 jours d'incubation, et les différences significatives entre les données de 7 et 14 jours, pour les isolats FR1 et QP1, confirment que l'activité prédatrice développée par ce type de champignons est un processus graduel et dépendant du temps. C'est la présence du parasite qui déclenche le développement des hyphes des champignons vers lui et leur adhésion à sa capsule17,27,29,33,36. La migration des hyphes fongiques vers les œufs de parasites et les oocystes peut être considérée comme l'une des étapes les plus critiques du processus prédateur. Les hyphes doivent croître et atteindre le parasite, un processus qui peut être retardé par des facteurs biotiques et abiotiques natifs dans le microenvironnement fécal, affectant ainsi les performances et la vitesse d'action fongique. Le microbiote fécal aviaire, composé d'une grande diversité de micro-organismes natifs, à savoir les bactéries des Phyla Firmicutes et Proteobacteria46, les champignons des Phyla Ascomycota et Basidiomycota47, et d'autres micro-organismes, peut avoir influencé négativement les performances de chaque souche fongique, en raison de la concurrence des ressources et de la dégradation des souches fongiques. Il a été suggéré que la survie des champignons prédateurs dans le sol et le microenvironnement fécal est affectée par des facteurs biotiques tels que la présence de micro-organismes aux caractéristiques fongistatiques48. Par ailleurs, une étude réalisée au Danemark49 a démontré que les performances de prédation dans le sol de Pochonia chlamydosporia et Metarhizium brunneum, deux espèces de champignons ovicides, contre les œufs d'ascarides aviaires (Ascaridia galli et Heterakis gallinarum), sont affectées par le microbiote du sol. Tous ces facteurs doivent être pris en compte lors de la planification d'un test de biocontrôle, à savoir le dosage optimal de spores pour contrer ces facteurs limitants.

Enfin, puisque toutes les souches de Mucor ont été isolées à partir d'échantillons fécaux frais aviaires, et ont montré une activité lytique intéressante sur les oocystes coccidiens, on peut suggérer que ces souches ont résisté au passage gastro-intestinal chez les poulets et les paons, et ont conservé à la fois leurs capacités germinatives et prédatrices, comme précédemment démontré chez les oiseaux pour le champignon ovicide P. chlamydosporia50 et les champignons larvicides D. flagrans et Monacrosporium thaumasium51. Le fait que tous les isolats de Mucor aient été obtenus à partir de fèces d'oiseaux sains, permet également de suggérer leur innocuité pour les oiseaux immunocompétents, comme l'ont démontré d'autres chercheurs pour les chevaux37, les moutons20, les chiens28 et les wapitis19.

À notre connaissance, cette étude a été la première réalisée dans le monde visant à isoler et à identifier les champignons prédateurs indigènes des excréments d'oiseaux et à tester leur efficacité in vitro contre les Eimeria spp. oocystes. Les résultats suggèrent que les souches FR1 et QP2 de Mucor circinelloides sont les plus prometteuses pour être utilisées dans de futurs essais de lutte biologique in vitro et in vivo.

Un total de 89 échantillons fécaux de poulets et de poules pondeuses (Gallus gallus domesticus ; n = 46) et de paons (Pavo cristatus ; n = 43) ont été précédemment évalués à l'aide de plusieurs techniques coprologiques, telles que McMaster, Mini-FLOTAC et Coprocultures, dans le cadre d'une étude récente réalisée au Laboratoire de parasitologie et maladies parasitaires (LPPD) de la Faculté de médecine vétérinaire de l'Université de Lisbonne 3, qui a rapporté que 58 échantillons (65%) étaient positifs pour au moins un taxon de parasite gastro-intestinal, à savoir les coccidies du genre Eimeria et les nématodes comme Capillaria sp., Trichostrongylus tenuis et Strongyloides pavonis. Les échantillons appartenaient à des animaux sains, qui ne présentaient aucun signe clinique de troubles gastro-intestinaux, à savoir diarrhée et/ou matières fécales avec du sang.

Ces échantillons ont été collectés entre juillet 2020 et avril 2021, dans une ferme avicole (PF) et deux collections d'oiseaux exotiques situées dans les districts de Lisbonne (SJ) et de Santarém (QP) (Portugal). La ferme avicole est située au nord-ouest de Lisbonne (39°13′54.373″ N 9°17′2.235″ W) et abrite deux populations distinctes de 200 poulets élevés en liberté et 200 poules pondeuses, tandis que les collections d'oiseaux exotiques SJ et QP ont 20 et 3 paons, étant situées dans le centre de Lisbonne (38°42′50.241″ N 9° 8′2.182″ O) et Abrantes (39°26′52.595″ N 8°10′24.949″ O), respectivement.

Les échantillons fécaux ont été immédiatement prélevés après l'excrétion, emballés dans des sacs en plastique et transportés au LPPD, étant stockés dans un réfrigérateur (4 ° C) pendant une durée maximale d'une semaine, jusqu'à un traitement ultérieur.

Un total de 58 échantillons fécaux aviaires positifs pour les parasites gastro-intestinaux ont été utilisés pour l'isolement et l'identification des champignons filamenteux, à la fois au LPPD et au Laboratoire de Mycologie de la Faculté de Médecine Vétérinaire - Université de Lisbonne (Portugal). L'idée d'utiliser uniquement ces échantillons était basée sur la prémisse que ce type de champignons a comme capacité principale la prédation et la destruction des œufs, des oocystes et des larves de parasites, et donc cette procédure stimulerait la croissance de champignons prédateurs potentiels et limiterait le développement d'autres groupes fongiques.

A cet effet, environ 1 g de chaque échantillon fécal a été placé sur la surface du milieu Water-Agar (WA, 2%), puis incubé à 26 ° C pendant 3 semaines. Une fois la croissance des champignons filamenteux enregistrée, les colonies individuelles ont été soumises à 3 à 4 passages, en utilisant de la gélose à la farine de blé (WFA, 2%) et des cycles d'incubation de 26 ° C pendant 1 semaine, jusqu'à l'obtention de cultures pures. Deux répétitions ont été utilisées pour chaque échantillon fécal33.

Tous les isolats ont été soumis à une identification morphologique au niveau du genre, basée sur Hernández et al.33, Arroyo-Balán et al.34, Ocampo-Gutiérrez et al.42 et Cooke et Godfrey52. Des mesures (longueur et largeur) et une description de la morphologie ont été effectuées pour un total de 10 sporanges et hyphes (grossissement total 200X et 400X) et conidies (grossissement total 1000X, dans de l'huile d'immersion), à l'aide d'un bleu de coton au lactophénol et d'un microscope optique. De plus, une caractérisation macroscopique des colonies a été effectuée pour chaque isolat, en ce qui concerne sa texture et sa couleur.

Des suspensions de spores ont été établies pour chaque isolat à l'aide d'eau distillée et leur concentration finale a été calculée à l'aide de la chambre de Neubauer. Toutes les suspensions fongiques ont été normalisées à 106 spores/mL.

Les isolats fongiques ont été conservés dans des boîtes de Pétri et des flacons en verre avec WFA à température ambiante, et 850 μL de chaque suspension aqueuse fongique ont été stockés à - 20 ° C dans des cryotubes avec 15% (v/v) de glycérol stérile40.

L'extraction d'ADN de tous les isolats fongiques a été réalisée à l'aide du kit EZNA® Fungal DNA Mini (Omega Bio-Tek, Norcross, GA). Un écouvillon calibré de 1 μL a été utilisé pour collecter des mycéliums frais de chaque isolat fongique. Cette procédure a été répétée 5 fois et le volume total de mycélium a été placé dans les tubes de microcentrifugeuse respectifs de 2 mL, auxquels 600 μL de tampon de lyse FG1 ont également été ajoutés. Le mélange a été vortexé pour disperser tous les amas et incubé à 65°C pendant 10 min. Ensuite, 140 μL de tampon FG2 (acide acétique glacial) ont été ajoutés et la suspension a été vortexée. Les tubes ont été incubés sur de la glace pendant 5 min, puis centrifugés à 10 000 × g pendant 10 min. Les surnageants ont été transférés dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuse, auxquels ont également été ajoutés 0,7 volume d'isopropanol. Après vortex, les suspensions ont été centrifugées à 10 000 × g pendant 2 min. Les surnageants ont été évacués et 300 μL d'eau distillée stérile ont été ajoutés à chaque culot d'ADN, puis vortexés. Un total de 4 μL de RNase A a été ajouté à chaque tube, suivi de 150 μL de tampon FG3 (chlorhydrate de guanidine) et 300 μL d'éthanol à 100%, en utilisant toujours le vortex pour mélanger les suspensions. D'autres étapes ont été réalisées à l'aide des mini-colonnes d'ADN HiBind® pour éliminer les polysaccharides, les composés phénoliques et les inhibiteurs d'enzymes des lysats fongiques, en raison de sa liaison réversible aux acides nucléiques. L'ADN pur a été élué dans 200 μL d'eau distillée stérile, et sa pureté et sa concentration ont été vérifiées à l'aide de NanoDrop™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA). Les tubes ont finalement été conservés à -20°C.

L'amplification de l'ADNr a été réalisée pour chaque isolat ciblant la région ITS1-5.8S-ITS2, en utilisant 10 à 66 ng d'ADN génomique et les amorces ITS1 (TCC GTA GGT GAA CCT GCG G) et ITS4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC). Ces procédures ont suivi les directives décrites par Arroyo-Balán et al.34 et Lau et al.53, et la réaction PCR a été réalisée dans un volume de 25 μL, composé de : 0,4 μL ITS1 (0,8 μM), 0,4 μL ITS4 (0,8 μM), 10 μL DNA template, 10 μL NZYTaq II Green Master Mix (NZYTech, Lisbon , Portugal) et 4,2 μL d'eau de biologie moléculaire. Un contrôle négatif a également été utilisé, en remplaçant l'ADN par de l'eau.

Les conditions de thermocyclage étaient les suivantes : une étape de dénaturation initiale à 95 °C pendant 10 min, suivie de 60 cycles composés d'une étape de dénaturation à 94 °C pendant 15 s, d'une étape d'hybridation à 55 °C pendant 30 s et d'une étape d'extension à 72 °C pendant 30 s. Enfin, une étape d'extension a été réalisée à 72 °C pendant 5 min. Les amplicons ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (1, 5%), colorés avec 2, 5 μL de GreenSafe Premium (NZYTech) et comprenant le NZYDNA Ladder VI (50–1500 pb; NZYTech). Le gel a été exécuté à 85 V pendant 40 min et visualisé à l'aide de l'équipement ChemiDoc et du logiciel Image Lab™ (Bio-Rad Laboratories, Inc., Californie, USA).

Chaque produit de PCR a été purifié à l'aide de billes magnétiques (MCLAB, Californie, États-Unis) pour la précipitation de l'ADN, suivi d'un lavage des pastilles avec de l'éthanol à 85 % et d'une élution ultérieure dans de l'eau MiliQ. Les surnageants obtenus ont été utilisés pour un séquençage ultérieur. Les produits de PCR purifiés ont été séquencés à l'aide de l'amorce ITS1 et du kit de séquençage de cycle BigDye™ Terminator version 3.1, ainsi qu'avec l'équipement DNA Analyzer 3730 XL (Thermo Fisher Scientific Inc.).

Les séquences ont été évaluées à l'aide du logiciel Chromas, version 2.6.6 (Technelysium Pty, Ltd., South Brisbane, Australie), et leur qualité a été vérifiée sur la base de pics bien définis des nucléotides dans les chromatogrammes. Les séquences ont ensuite été dynamitées à l'aide de la suite Blastn (BLAST®) du National Center for Biotechnology Information (NCBI), pour effectuer une analyse préliminaire des alignements significatifs des séquences et sélectionner les taxons fongiques à des fins de comparaison dans l'analyse phylogénétique. Pour chaque isolat fongique, un Top 3 de similarité de séquence a été établi sur la base des résultats de Blastn Suite.

Les séquences ont été éditées manuellement à l'aide du logiciel MEGA, version 11.0.1154, pour vérifier la qualité des séquences et des nucléotides non détectés, supprimer les amorces, ainsi que pour effectuer leur alignement à l'aide de l'algorithme MUSCLE. Sur la base de la recherche BLAST®, les séquences de la région ITS1-5.8S-ITS2 des isolats Mucor circinelloides CBS 195.68 (numéro d'accès : NR_126116.1), Mucor lusitanicus CBS 108.17 (numéro d'accès : NR_126127.1), Mucor racemosus f. racemosus CBS 260.68 (numéro d'accès : NR_126135.1) et Mucor fragilis (numéro d'accès : FJ904925.1) ont également été inclus. Le serveur web IQ-TREE55 a été utilisé pour générer un arbre phylogénétique à maximum de vraisemblance à partir de 1000 réplications. L'option ModelFinder d'IQ-TREE a été définie pour l'auto-détermination du meilleur modèle56. L'outil de bootstrap ultra-rapide (1000 alignements bootstrap) a été choisi pour obtenir des statistiques de support de nœuds, ses branches n'étant supportées que par des valeurs de bootstrap supérieures à 5057. L'arbre phylogénétique a été visualisé et édité à l'aide du logiciel MEGA, et M. racemosus a été choisi pour enraciner l'arbre, puisque dans l'arbre phylogénétique initial à maximum de vraisemblance, cette souche de référence était nettement plus éloignée phylogénétiquement des autres isolats fongiques et souches de référence, et à la fois enracinant l'arbre sur cette souche et sur Le point médian a donné des arbres phylogénétiques identiques.

Les séquences nucléotidiques ITS1-5.8S-ITS2 des sept isolats fongiques ont été déposées dans la base de données GenBank sous les numéros d'accès suivants : ON150886 (M. circinelloides, FR1), ON150887 (M. circinelloides, FR2), ON150888 (M. circinelloides, FR3), ON150889 (M. lusitanicus, QP1), ON150890 (M circinelloides, QP2), ON150891 (M. circinelloides, SJ1) et ON150892 (M. circinelloides, SJ2).

Deux types d'essais de lutte biologique ont été menés visant à tester l'activité prédatrice de tous les isolats fongiques contre les coccidies aviaires : un test qualitatif dans des boîtes de Pétri contenant du milieu WA et un test de coproculture quantitatif-qualitatif33.

Pour obtenir des suspensions concentrées d'oocystes, des échantillons fécaux de poulets, de poules pondeuses et de paons, positifs pour Eimeria spp., ont été traités en utilisant la technique de flottation Willis. En bref, deux grammes de matières fécales ont été mélangés avec 28 ml de solution saturée de saccharose (densité 1,2) ; la suspension fécale a été filtrée et versée dans des tubes à essai de 10 mL, jusqu'à la formation d'un ménisque convexe, sur lequel une lamelle a été placée ; les tubes à essai ont été laissés sur le banc de laboratoire pendant 10 min, et la lamelle a ensuite été lavée avec de l'eau distillée dans de nouveaux tubes à essai, qui ont été centrifugés à 2000 tr/min pendant 10 min ; le surnageant a été partiellement retiré, ne laissant que 1 mL dans chaque tube ; le sédiment et le surnageant ont été mélangés à l'aide d'une pipette Pasteur, et 100 μL de la suspension d'oocystes ont été visualisés à l'aide d'un microscope optique, à un grossissement total de 400X. Deux lectures ont été effectuées et le nombre total d'oocystes a été multiplié par 10 pour calculer la concentration de coccidies (c.-à-d. oocystes/mL).

Dans le premier essai, un volume total de 500 μL de chaque isolat fongique (106 spores/mL) a été inoculé à la surface du milieu WA, auquel 1 mL de suspension d'oocystes a également été ajouté, avec une concentration moyenne de 140 oocystes/mL. Deux répliques ont été utilisées pour chaque isolat, et un contrôle positif a également été utilisé pour évaluer la survie des oocystes sans inoculation fongique et tester la contamination par d'autres espèces fongiques. Les plaques ont été scellées avec Parafilm et incubées à température ambiante pendant 30 jours. Ensuite, des plaques ont été observées pour l'identification de l'activité prédatrice, qui a été caractérisée comme suit : attachement des hyphes à la capsule des oocystes mais sans dommage morphologique (type d'activité 1) ; la capsule et les structures internes des oocystes présentant des modifications morphologiques, mais sans pénétration fongique (type 2) ; les hyphes pénètrent dans le cytoplasme de l'oocyste, s'y développent et le détruisent (type 3)27,33,58.

Le deuxième test visait à évaluer l'efficacité des isolats fongiques sur la dégradation des oocystes, suite à une exposition au microenvironnement fécal. Quatre grammes d'échantillons fécaux de paon de la collection exotique SJ, positifs pour Eimeria spp. (n = 20), ont été délicatement mélangés et placés dans huit gobelets en plastique. Un total de 4 mL de suspensions fongiques (106 spores/mL) ont été ajoutés aux tasses de test respectives (une par isolat fongique, n = 7), tandis que 4 mL d'eau distillée ont été versés sur la tasse témoin (n = 1). Ensuite, les coupelles ont été recouvertes d'une feuille d'aluminium perforée et laissées en incubation pendant deux semaines, à 26 °C. Après une et deux semaines d'incubation, deux flottations ont été effectuées dans chaque coupelle de test et de contrôle, en utilisant 2 g de matières fécales prélevées au hasard dans des parties distinctes de l'échantillon et en les mélangeant avec 28 ml de solution de saccharose saturée (densité 1,2), visant à calculer la proportion d'oocystes sporulés/non sporulés et viables/non viables (après une semaine) et la proportion d'oocystes viables/non viables (dans chaque semaine). Deux lectures ont été effectuées dans chaque cupule et chaque période, en comptant un total de 100 oocystes par lecture.

Pour chaque isolat fongique et chaque période (7 et 14 jours), la réduction de la viabilité des oocystes fécaux (FOVR) (1) et la réduction de la sporulation des oocystes fécaux (FOSR) (2) ont été calculées comme suit19,20,59 :

La caractérisation de l'aspect des oocystes a été adaptée des procédures établies pour les œufs d'ascaris par Cazapal-Monteiro et al.27, les oocystes étant considérés comme non viables si au moins une des caractéristiques suivantes était observée : structures internes mal marquées, forme anormale des oocystes, cytoplasme contenant des vacuoles et/ou rupture capsulaire.

De plus, comme la plupart des espèces d'Eimeria affectant les Galliformes sporulent en moins de 2 jours, à des températures comprises entre 20 et 30 °C5,60, l'évaluation FOSR a été réalisée selon les critères suivants : à la fin de la première semaine d'incubation, l'identification d'oocystes non sporulés dans les cupules de test a été attribuée à une activité coccidiostatique développée par l'exposition aux isolats fongiques respectifs.

Le logiciel Microsoft® Excel® pour Microsoft 365 MSO (Microsoft Corporation, Redmond, WA, États-Unis) a été utilisé pour le stockage des données et l'édition de tableaux et de graphiques.

Le logiciel IBM® SPSS® Statistics version 27 pour Windows (IBM Corporation, Armonk, NY, EUA) a été utilisé pour les statistiques descriptives initiales (moyenne et erreurs standard). Aussi, ce logiciel a été utilisé pour construire des tables 2 × 2 à partir des données de l'essai in vitro (viabilité et sporulation), visant à réaliser un test du Chi-2, pour comparer les résultats obtenus entre les oocystes exposés à chaque isolat fongique (gobelets test) et à l'eau (gobelet témoin). De plus, ce test a été utilisé pour évaluer la dépendance temporelle de l'activité ovicide développée par chaque isolat fongique sur les oocystes. Un niveau de signification de p < 0,05 a été utilisé pour tous les tests.

Les ensembles de données générés et/ou analysés au cours de la présente étude appartiennent au Centre de recherche interdisciplinaire en santé animale (CIISA), Faculté de médecine vétérinaire, Université de Lisbonne. Les séquences d'ADNr obtenues à partir des sept isolats de Mucor ont été téléchargées dans la base de données GenBank, le 5 avril 2022, les numéros d'accession étant fournis dans la section Méthodes. Toutes les données peuvent être mises à disposition en en faisant la demande auprès de l'auteur correspondant.

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Cette recherche a été financée par le projet CIISA/FMV UIDB/00276/2020 et LA/P/0059/2020—AL4AnimalS (tous deux financés par FCT), ainsi que par le projet ED431B 2021/07 (Consellería de Cultura, Educación e Universidades, Xunta de Galicia). De plus, João Lozano et Mariana Louro détiennent respectivement les bourses de recherche doctorale 2020.09037.BD et UI/BD/152818/2022 (toutes deux financées par FCT). Nous tenons à remercier les Laboratoires de Parasitologie et Maladies Parasitaires, et de Microbiologie et Immunologie (CIISA-FMV, Lisbonne, Portugal), et leurs dirigeants, les Professeurs Docteurs Isabel Fonseca et Luís Tavares, respectivement, pour avoir soutenu cette recherche et permis de la réaliser dans les installations respectives. Merci également au groupe de recherche COPAR (Faculté de médecine vétérinaire, Université de Saint-Jacques-de-Compostelle, Lugo, Espagne) pour tout le soutien concernant l'isolement et l'identification des champignons prédateurs et les essais in vitro. Enfin, nous tenons à remercier STAB VIDA, Lda. (Caparica, Portugal) pour la purification et le séquençage des produits PCR fongiques.

CIISA—Centre de recherche interdisciplinaire en santé animale, Faculté de médecine vétérinaire, Université de Lisbonne, Avenida da Universidade Técnica, 1300-477, Lisbonne, Portugal

João Lozano, Mariana Louro, Ana Cláudia Victório, Manuela Oliveira & Luís Madeira de Carvalho

Laboratoire associé des sciences animales et vétérinaires (AL4AnimalS), 1300-477, Lisbonne, Portugal

João Lozano, Mariana Louro, Ana Cláudia Victório, Manuela Oliveira & Luís Madeira de Carvalho

Exoclinic – Clinique vétérinaire pour oiseaux et exotiques, Quinta de Santo António, 1495-049, Miraflores, Portugal

Cristina Almeida

Vetnatura – Serviços Veterinários, Lda., Calçada de Palma de Baixo, 1600-176, Lisbonne, Portugal

Pedro Melo

Écorce – Biopark Barquinha, 2260-999, Vila Nova da Barquinha, Portugal

João Paulo Rodrigues

Groupe de recherche sur le contrôle des parasites (COPAR, GI-2120), Département de pathologie animale, Faculté de médecine vétérinaire, Université de Saint-Jacques-de-Compostelle, 27142, Lugo, Espagne

Adolfo Paz Silva

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JL a conçu l'étude, fourni les ressources, réalisé les expériences, organisé les données, analysé les résultats et rédigé le brouillon original du manuscrit. ML a fourni des ressources, analysé les résultats et révisé le manuscrit. CA a fourni des ressources et révisé le manuscrit. ACV a fourni des ressources et révisé le manuscrit. PM a fourni des ressources. JPR a fourni des ressources. MO a fourni des ressources, collaboré aux expériences, révisé le manuscrit et co-supervisé l'étude. APS a fourni des ressources, collaboré aux expériences, révisé le manuscrit et co-supervisé l'étude. LMC a fourni des ressources, collaboré aux expériences, révisé le manuscrit et supervisé l'étude. Tous les auteurs ont lu ce manuscrit et ont accepté de le soumettre.

Correspondance à Joao Lozano.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Lozano, J., Louro, M., Almeida, C. et al. Isolement de champignons filamenteux saprophytes à partir d'échantillons fécaux aviaires et évaluation de son activité prédatrice sur les oocystes coccidiens. Sci Rep 13, 8965 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36120-5

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Reçu : 24 décembre 2022

Accepté : 30 mai 2023

Publié: 02 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36120-5

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