Megasphaera elsdenii et Saccharomyces Cerevisiae en tant que microbes nourris directement lors d'un test d'acidose ruminale aiguë in vitro

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 7978 (2022) Citer cet article

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Cette étude visait à évaluer les effets de Saccharomyces cerevisiae et Megasphaera elsdenii en tant que microbiens nourris directement (DFM) dans les régimes de finition des bovins de boucherie pour atténuer l'acidose lactique ruminale aiguë in vitro. Un système de culture continue à double flux a été utilisé. Les traitements étaient un contrôle, pas de DFM ; YM1, S. cerevisiae et M. elsdenii souche 1 ; YM2, S. cerevisiae et M. elsdenii souche 2 ; et YMM, S. cerevisiae et la moitié des doses de M. elsdenii souche 1 et souche 2. Chaque dose de DFM avait une concentration de 1 × 108 UFC/mL. Quatre périodes expérimentales ont duré 11 jours chacune. Pour les jours sans acidose (jours 1 à 8), le régime alimentaire contenait un rapport fourrage/concentré de 50:50. Pour les jours de provocation (jours 9 à 11), le régime contenait un rapport fourrage/concentré de 10:90. L'acidose ruminale aiguë a été établie avec succès. Aucune différence de pH, de d-, de l- ou de lactate total n'a été observée entre les traitements. L'acide propionique a augmenté dans les traitements contenant du DFM. Pour le métabolisme de l'azote, le traitement au YMM a diminué la dégradation des protéines et la synthèse des protéines microbiennes. Aucun effet du traitement n'a été observé sur la concentration de NH3–N; cependant, l'efficacité de l'utilisation de N par les bactéries ruminales était supérieure à 80 % pendant la période de provocation et la concentration de NH3–N a été réduite à environ 2 mg/dL à mesure que la provocation progressait.

L'acidose ruminale aiguë est un trouble digestif majeur chez les ruminants et reste l'un des plus grands défis auxquels est confrontée l'industrie des bovins de boucherie1,2,3. L'augmentation brutale de la consommation de glucides fermentescibles rapidement associée à une diminution de la consommation de glucides fibreux (par exemple, lors de l'entrée en parc d'engraissement et du comportement de tri) provoque un déséquilibre de la fermentation ruminale1,4. Dans le rumen, les glucides fermentescibles rapidement sont convertis en acides gras volatils (AGV) et en acide lactique. Le métabolisme, l'absorption et l'écoulement de ces acides ne doivent pas être supérieurs à leur production3. Ainsi, l'accumulation d'acides, en particulier d'acide lactique, peut réduire le pH ruminal en dessous de 5,2, ce qui peut altérer la fermentation ruminale2.

L'acide lactique est un acide plus fort que les autres AGV trouvés dans le rumen (pKa de 3,9 contre 4,9, respectivement) et les bactéries ruminales qui métabolisent l'acide lactique (par exemple, Megasphaera elsdenii) ne se développent pas aussi vite que celles qui produisent de l'acide lactique (par exemple , Streptococcus bovis ; Nocek, 1997 ; Russell et Rychlik, 2001). Ainsi, une option pour surmonter l'acidose ruminale aiguë est de diminuer l'acide lactique non dissocié dans le rumen en complétant les additifs alimentaires microbiens qui peuvent métaboliser l'acide lactique. Saccharomyces cerevisiae a été l'un des principaux microbes nourris directement (DFM) étudiés pour réduire l'accumulation d'acide lactique non dissocié dans le rumen5. Dans une méta-analyse d'études utilisant S. cerevisiae comme DFM pour moduler la fermentation ruminale, Desnoyers et al. différentes espèces de ruminants. Étant donné que S. cerevisiae favorise un environnement plus réduit dans le rumen par piégeage de l'oxygène, l'acidose ruminale aiguë peut être atténuée par une supplémentation en S. cerevisiae en raison de la prolifération de bactéries fibrolytiques et de la fermentation des fibres dans le rumen5. Bien que S. cerevisiae contribue à la métabolisation de l'acide lactique, la concentration d'acide lactique non dissocié pendant l'acidose ruminale aiguë peut nécessiter plus d'un DFM pour améliorer efficacement l'environnement ruminal.

Des combinaisons possibles peuvent impliquer l'utilisation d'acide lactique utilisant des bactéries déjà présentes dans le rumen, telles que M. elsdenii7, Selenomonas ruminantium8 et Propionibacterium freudenreichii9. Plus précisément, M. elsdenii est la plus prometteuse puisque cette bactérie est déjà la principale bactérie utilisant l'acide lactique dans le rumen, représentant jusqu'à 80 % de toute la fermentation de l'acide lactique en acide propionique dans des conditions normales10. Il a été rapporté que Megasphaera elsdenii fermente l'acide lactique jusqu'à ce que ce dernier s'épuise, car l'acide lactique est fermenté environ 6 fois plus rapidement que le glucose par M. elsdenii11,12 ; faisant ainsi de cette bactérie un candidat DFM puissant à utiliser lors d'une acidose ruminale aiguë. Bien que certaines souches de M. elsdenii aient été brevetées en tant que DFM pour prévenir l'acidose13,14, peu d'autres souches ont réussi à améliorer les conditions d'acidose ruminale aiguë15,16.

Par conséquent, les objectifs de cette étude étaient de : (1) induire une acidose lactique ruminale aiguë dans un système de culture continue à double flux ; et (2) évaluer les effets de l'alimentation de S. cerevisiae en combinaison avec deux souches nouvellement isolées de M. elsdenii (isolées du rumen de bovins de boucherie sous acidose aiguë) comme DFM pendant des conditions d'acidose lactique ruminale aiguë. L'hypothèse était qu'un scénario d'acidose ruminale aiguë pouvait être induit avec succès in vitro en modifiant brusquement les régimes alimentaires des fermenteurs à culture continue à double flux. La deuxième hypothèse était qu'une combinaison de S. cerevisiae avec les deux souches de M. elsdenii diminuerait considérablement l'accumulation d'acide lactique lors de ce changement de régime alimentaire (challenge) et améliorerait la fermentation ruminale. Ici, nous présentons un modèle pour simuler l'acidose ruminale et décrivons des méthodes pour évaluer les effets possibles de la DFM pour améliorer ces conditions difficiles.

Une méta-analyse récemment publiée avec 155 articles publiés a démontré la solidité du système de culture continue à double flux par rapport aux conditions in vivo17. Ainsi, l'un des objectifs de l'étude était de créer un scénario d'acidose ruminale aiguë dans les fermenteurs de culture continue à double flux. Malgré la solidité de cette méthodologie, les résultats doivent être soigneusement examinés avant de proposer des applications in vivo. D'autre part, parce que ce système permet un contrôle précis de la prise alimentaire et des taux de dilution ruminale (flux liquides et solides) qui ne sont pas réalisables in vivo, il nous permet d'isoler ces effets pour mieux évaluer ce trouble nutritionnel. Bien que les principales revues de la littérature diffèrent quant à ce qui est considéré comme un seuil de pH acceptable pour l'acidose ruminale aiguë (pH < 5,2 dans Owens et al.1 vs pH < 5,0 dans Nagaraja et Titgemeyer2), il existe un consensus sur le fait que l'acidose ruminale aiguë est caractérisée non seulement par l'occurrence, mais aussi par la mesure dans laquelle le pH est inférieur aux conditions normales de fermentation (pH moyen quotidien < 5,8)2,18,19. Sur la figure 1, il est montré que le pH a atteint les conditions d'acidose ruminale subaiguë (SARA) le jour où les régimes ont été modifiés et a atteint le seuil de 5,2 pendant les jours 1 et 2 de la période de provocation. Le pH moyen, les heures sous pH 5,2 et la zone sous pH 5,2 ont chuté en dessous des conditions normales de fermentation (pH < 5,6) tout au long de la période de provocation, restant dans des conditions d'acidose les jours 1 et 2 par rapport à la provocation. Ce sont des indicateurs importants dans le système de culture continue à double flux par rapport aux modèles in vivo car ils représentent une exposition prolongée au problème, qui in vivo aurait le potentiel de favoriser des réponses physiologiques considérables1,2,20. Dans l'ensemble, il n'y a pas eu d'interaction significative ou d'effet du traitement sur l'amélioration des conditions d'acidose ruminale aiguë, bien que le traitement YMM soit le seul traitement à dépasser numériquement les seuils de pH de l'acidose ruminale aiguë et subaiguë à la fin des jours 1 et 2 par rapport au défi. Étant donné que le métabolisme de M. elsdenii a été signalé comme étant plus régulé par le pH que par la concentration du substrat21, il est possible que le mélange YMM ait légèrement régulé à la baisse ce mécanisme et ait mieux fonctionné dans de telles conditions.

Dynamique du pH de fermentation après l'alimentation du matin, aire sous la courbe (AUC) et temps en SARA et en dessous de pH 5,2 les jours 8, 9, 10 et 11 de chaque période pour représenter les jours − 1, 0, 1 et 2 par rapport au défi ; le jour 7 a été utilisé comme covariable du modèle. Tous les traitements avaient le même régime de base (1 mL de chaque DFM était appliqué par jour à 1 × 108 ufc/mL) ; les traitements étaient : Témoin, porteur d'additifs sans DFM ; YM1, S. cerevisiae et M. elsdenii souche 1 ; YM1, S. cerevisiae et M. elsdenii souche 2 ; YMM, S. cerevisiae et M. elsdenii souche 1 (1/2 dose) et souche 2 (1/2 dose). Les différences statistiques ont été déclarées à P ≤ 0,05 ou comme une tendance à être différente si P > 0,05 et < 0,10.

Compte tenu de l'absence d'effets sur l'amélioration du défi de l'acidose, le S. cerevisiae et les nouvelles souches de M. elsdenii utilisées dans l'étude n'étaient probablement pas efficaces pour réduire la concentration de lactate pendant la fermentation. Les souches de M. elsdenii utilisées dans la présente étude ont été isolées du rumen au cours d'une acidose ruminale aiguë ; ainsi, on s'attendait à ce que ces souches aient amélioré ces conditions. La raison pour laquelle M. elsdenii n'était pas efficace pour diminuer la concentration de lactate peut être due à la difficulté de la population de M. elsdenii à s'établir dans le liquide ruminal, comme cela a été rapporté in vivo22. Des études antérieures ont rapporté que M. elsdenii peut ne pas bien s'établir dans le rumen même s'il a été isolé du rumen, peut-être en raison de la spécificité de l'hôte23. Parce que l'étude actuelle a été réalisée in vitro, le microbiome pendant la période de pré-provocation peut avoir établi une dynamique résistante au changement. De plus, la compétition pour les substrats avec le microbiote natif peut diminuer la probabilité de survie de M. elsdenii et S. cerevisiae, car ils sont en compétition pour les substrats avec d'autres groupes bactériens24. La population microbienne d'origine peut avoir empêché la prolifération d'autres populations telles que le DFM testé. Un autre facteur du manque d'établissement de la population de M. elsdenii peut avoir été la fréquence de dosage des fermenteurs. Dans Weimer et al.22, différents temps de dosage ont été testés, et même lorsque les souches de M. elsdenii ont été dosées 4 fois en 5 jours, les souches de M. elsdenii sont revenues à leur faible concentration ruminale d'origine rapidement après la perfusion. En essayant d'éviter ce problème, dans notre étude, les DFM ont été dosés dans l'étude deux fois par jour, ce qui n'était peut-être pas encore idéal. Enfin, il est important de reconnaître que d'autres micro-organismes peuvent également métaboliser l'acide lactique ruminal dans le rumen et que la contribution de M. elsdenii et S. cerevisiae à son métabolisme peut avoir été surestimée lors d'acidose ruminale aiguë2,3,21.

Il y avait un effet constant du jour dans l'étude; la plupart des états acidosiques aigus ont été établis juste un jour après le début de la provocation [jours 1 et 2 par rapport à la provocation (Fig. 1)]. L'établissement de conditions acidotiques un jour après le changement de régime alimentaire peut s'être produit pour plusieurs raisons : premièrement, l'un des avantages du système de culture continue à double flux est qu'il régule avec précision les débits de fluide et de particules hors du fermenteur (par exemple, modèle de rumen). Nous avons sélectionné ces débits en fonction des taux de dilution ruminale des bovins de boucherie rapportés. Bien que le système régule avec précision les débits de digesta pour imiter les conditions in vivo basées sur des modèles animaux spécifiques, une telle régulation précise minimise également les effets individuels des animaux qui pourraient subir de tels défis plus rapidement ou plus lentement. L'avantage est qu'en contrôlant les apports alimentaires et les débits de digesta, nous sommes en mesure d'isoler la fonction ruminale, ce qui était notre objectif principal et ne peut se faire in vivo. Ainsi, comme dans un modèle in vivo, la réponse aux traitements peut être variable en raison de changements dans l'apport alimentaire, les débits de digesta, les facteurs environnementaux et autres, ici nous avons pu isoler et tester de manière unique ces traitements dans un scénario d'acidose ruminale aiguë . La deuxième raison concerne l'effet de dilution de la présence de résidus de NDF dans les restes de fermentation du régime non acidotique (tableau 1). Bien que le NDF alimentaire soit associé à une plus grande activité de mastication et à une plus grande capacité tampon du rumen19,25,26, le système utilisé dans cette étude comportait une infusion continue de salive artificielle tout au long de l'expérience. Par conséquent, ces conditions peuvent avoir contribué à la présence d'un tapis encore observé le premier jour du défi. Ce tapis fonctionne comme un micro-environnement avec un pH élevé qui peut optimiser la dégradation des glucides structuraux25. Le tapis était visible au jour 0 mais absent les jours 1 et 2 par rapport au défi (voir les figures supplémentaires 1 et 2).

Une autre explication possible de l'établissement de conditions acidotiques un jour après le changement de régime concerne le moment où le pic de concentration de lactate total s'est produit, qui malgré la petite différence entre les jours de provocation, il a été observé principalement le jour 1 par rapport au provocation mais pas jour 0 (Fig. 2). D'après la littérature antérieure, on s'attend à ce qu'au cours d'une acidose ruminale, les bactéries qui fermentent les glucides non structuraux en acide lactique (p. ex., les bactéries productrices d'acide lactique) se reproduisent rapidement dans des conditions favorables27,28. D'autre part, les bactéries qui fermentent le lactate en d'autres AGV tels que l'acide propionique (par exemple, les bactéries utilisant l'acide lactique) devraient avoir un temps de doublement plus long dans le rumen27,29 ; ce manque de synchronisation entre ces groupes bactériens se traduit par une accumulation de lactate (acide plus fort lorsqu'il n'est pas dissocié) et, par conséquent, une chute du pH2. Il est possible que les bactéries aient besoin de s'adapter à l'augmentation du substrat pour réguler positivement leur métabolisme et produire un changement mesurable, ce qui pourrait expliquer le retard dans l'établissement de telles conditions. De plus, les résultats actuels suggèrent que malgré une augmentation possible des bactéries productrices d'acide lactique pendant la fermentation, la concentration totale en AGV (Fig. 3) a été réduite au cours des jours de provocation, ce qui représente un plus grand manque de synchronisation entre les groupes bactériens au fur et à mesure que la provocation progressait.

Dynamique de la concentration de d-lactate, de l-lactate et de lactate total après l'alimentation du matin les jours 8, 9, 10 et 11 de chaque période pour représenter les jours - 1, 0, 1 et 2 par rapport au défi ; le jour 7 a été utilisé comme covariable du modèle. Tous les traitements avaient le même régime de base (1 mL de chaque DFM était appliqué par jour à 1 × 108 ufc/mL) ; les traitements étaient : Témoin, porteur d'additifs sans DFM ; YM1, S. cerevisiae et M. elsdenii souche 1 ; YM1, S. cerevisiae et M. elsdenii souche 2 ; YMM, S. cerevisiae et M. elsdenii souche 1 (1/2 dose) et souche 2 (1/2 dose). Les différences statistiques ont été déclarées à P ≤ 0,05 ou comme une tendance à être différente si P > 0,05 et < 0,10.

Dynamique de la concentration en acides gras volatils (AGV) après l'alimentation du matin aux jours 8, 9, 10 et 11 de chaque période pour représenter les jours − 1, 0, 1 et 2 par rapport au défi ; le jour 7 a été utilisé comme covariable du modèle. Tous les traitements avaient le même régime de base (1 mL de chaque DFM était appliqué par jour à 1 × 108 ufc/mL) ; les traitements étaient : Témoin, porteur d'additifs sans DFM ; YM1, S. cerevisiae et M. elsdenii souche 1 ; YM1, S. cerevisiae et M. elsdenii souche 2 ; YMM, S. cerevisiae et M. elsdenii souche 1 (1/2 dose) et souche 2 (1/2 dose). Les différences statistiques ont été déclarées à P ≤ 0,05 ou comme une tendance à être différente si P > 0,05 et < 0,10.

Fait intéressant, étant donné que le système de culture continue à double flux élimine les produits finaux de la fermentation au même rythme, la concentration des produits finaux de la fermentation devrait être similaire à la production de ces produits finaux. Par conséquent, ce système permet de mieux comprendre la production d'isomères d'acide lactique dans des conditions acidotiques, qui a été proposée comme étant plus importante pour l'acide l-lactique par rapport à l'acide d-lactique30. Pendant le pic de production d'acide lactique (jour 1 par rapport à la provocation), le traitement témoin avait une concentration de l-lactate supérieure à la concentration de d-lactate (Fig. 2). Cependant, les traitements contenant du DFM avaient le schéma opposé et la concentration de d-lactate était supérieure à la concentration de l-lactate. Bien qu'aucune interaction ou effet de traitement pour la concentration de lactate n'ait été observé, les données suggèrent que les traitements contenant du DFM avaient une production d'acide lactique plus importante et plus prolongée par rapport au témoin, ce qui était principalement dû à la plus grande production d'acide d-lactique. Selon Harmon et al.31, l'acide l-lactique peut avoir un taux d'absorption plus élevé dans le rumen par rapport à l'acide d-lactique, ce qui suggère que si leurs proportions sont inversées pendant la fermentation, ce dernier peut s'accumuler et affecter négativement le pH dans un milieu in vivo. paramètre. Il est important de noter; cependant, bien que l'acide lactique soit un composant important affectant le pH ruminal, en particulier dans les conditions d'acidose ruminale2,21, et un acide plus fort par rapport aux autres AGV ruminaux (pKa de l'acide lactique = 3,9 vs AGV ruminaux = 4,9), nous nous attendions à une plus grande concentration de ce métabolite dans notre étude. Ainsi, la faible concentration globale d'acide lactique que nous avons trouvée dans ce système qui isole d'autres facteurs tels que l'apport alimentaire, les débits de digesta, le volume de salive, la variation du taux de recyclage de l'urée et d'autres, suggère qu'une telle contribution de l'acide lactique à l'acidose ruminale aiguë pourrait ont été surestimées dans des études in vivo antérieures et justifient des recherches supplémentaires.

Malgré l'absence d'effets du traitement sur la concentration d'acide lactique, la concentration finale d'acide acétique était supérieure pour le contrôle par rapport aux traitements DFM, alors que l'inverse s'est produit pour la concentration d'acide propionique (tableau 2). Le rapport de l'acide acétique à l'acide propionique était également affecté par l'inclusion de DFM, dont le témoin avait le rapport le plus élevé par rapport aux autres traitements. En fait, les traitements de la présente étude avaient pour objectif de métaboliser le lactate en AGV, en particulier l'acide propionique10,32. Cependant, nous pensons que ces traitements n'ont eu qu'un léger effet sur la réduction de la concentration d'acide lactique et la production d'acide propionique, car aucun effet du traitement n'a été observé sur les concentrations de lactate (Fig. 2) et des effets mineurs ont été observés sur les concentrations d'acide acétique et propionique lors des collectes d'instantanés. pendant le défi (Fig. 3).

Une autre caractéristique unique à étudier dans les fermenteurs à culture continue à double flux est la possibilité d'isoler l'effet du recyclage de l'urée de la concentration ruminale de NH3–N. Le recyclage de l'urée a été simulé dans ce système grâce à un débit constant d'infusion d'urée avec la salive artificielle ; ainsi, les changements dans la concentration de NH3–N pendant la fermentation n'étaient pas dus à des changements dans le taux de recyclage de l'urée. Ici, un changement dans la concentration de NH3–N a été observé lorsque les régimes ont été changés, de 5 à 10 mg/dL avec le régime non acidotique, à 3 à 8 mg/dL au jour 0, et plus tard allant de 1 à 3 mg/dL. dL après l'établissement des conditions acidotiques (jours 1 et 2 ; Fig. 4). Selon Satter et Slyter33, un minimum de 2 mg de NH3–N/dL est nécessaire pour que la fermentation microbienne se déroule. Des niveaux de concentration d'ammoniac-N inférieurs aux conditions normales de fermentation peuvent réduire la synthèse des protéines et la croissance de certains micro-organismes (par exemple, les bactéries fibrolytiques)33. Bien que l'efficacité de l'utilisation de N par les micro-organismes ruminaux ait été élevée dans l'étude (> 80 % ; tableau 3), certains micro-organismes tels que les bactéries productrices d'acide lactique (LAB) qui se développent dans des conditions de pH bas2 peuvent avoir une efficacité accrue dans l'utilisation de NH3–N pour la synthèse des protéines. Étant donné que les micro-organismes dont la croissance peut être altérée dans de telles conditions produisent des AGV plus faibles (par exemple, l'acide acétique et l'acide butyrique) par rapport à l'acide lactique des bactéries LAB, une augmentation du taux de recyclage de l'urée serait fondamentale pour maintenir la croissance des anciennes populations microbiennes. . Dans un contexte in vivo, la faible concentration de NH3–N dans le rumen serait théoriquement compensée par une augmentation du recyclage de l'urée par la salive et le sang34,35. Ces résultats suggèrent qu'une certaine variation animale dans le déclenchement de l'augmentation rapide du recyclage de l'urée peut représenter un risque plus élevé d'acidose ruminale aiguë ; une condition qui peut mériter une évaluation plus approfondie.

Dynamique de la concentration de NH3–N après l'alimentation du matin aux jours 8, 9, 10 et 11 de chaque période pour représenter les jours − 1, 0, 1 et 2 par rapport au défi ; le jour 7 a été utilisé comme covariable du modèle. Tous les traitements avaient le même régime de base (1 mL de chaque DFM était appliqué par jour à 1 × 108 ufc/mL) ; les traitements étaient : Témoin, porteur d'additifs sans DFM ; YM1, S. cerevisiae et M. elsdenii souche 1 ; YM1, S. cerevisiae et M. elsdenii souche 2 ; YMM, S. cerevisiae et M. elsdenii souche 1 (1/2 dose) et souche 2 (1/2 dose). Les différences statistiques ont été déclarées à P ≤ 0,05 ou comme une tendance à être différente si P > 0,05 et < 0,10.

De même, la faible disponibilité de N pendant la période de provocation peut avoir modifié le schéma d'utilisation du substrat par M. elsdenii12,21,22. Bien que M. elsdenii fermente l'acide lactique plus rapidement que le glucose, il a été rapporté que cette bactérie a un meilleur rendement de croissance sur le glucose que l'acide lactique12. Combiné à la faible disponibilité de N, un changement dans le schéma de fermentation du substrat peut également s'être produit dans l'étude actuelle, diminuant l'efficacité de M. elsdenii sur l'amélioration de l'acidose et réduisant la charge d'acide lactique non dissocié pendant la fermentation.

La sortie de nutriments de la fermentation a également été mesurée pendant le défi pour comprendre si le DFM améliorerait la digestibilité des nutriments. Les sorties de nutriments sont rapportées dans le tableau 1 ; aucune interaction ou effet du traitement n'a été observé. À l'exception de la sortie d'amidon, tous les autres nutriments ont eu un effet diurne (données non présentées) peut-être à cause des résidus du régime non acidotique présents dans les premières heures de la journée de provocation. L'absence d'effet jour pour le flux d'amidon était attendue, car les glucides non fibreux devraient être rapidement dégradés dans le rumen1,2. Pour DM, OM et CP, le jour 0 a eu le plus grand écoulement, tandis que pour NDF et ADF, l'écoulement a continuellement diminué pendant les jours de provocation. La sortie de DM, OM, CP et glycogène microbiens était plus élevée pour les jours 1 et 2 par rapport au jour 0, peut-être en raison d'une plus grande efficacité d'utilisation de l'azote car des glucides plus facilement fermentescibles étaient disponibles. Il y avait un schéma de diminution de la digestibilité du CP lorsque le traitement YMM était utilisé, comme en témoignent le CP réel plus élevé et les écoulements microbiens inférieurs d'OM et de CP de la fermentation (tableau 1), ainsi qu'une diminution de l'efficacité microbienne (tableau 3). La littérature est rare sur l'effet de l'acide lactique utilisant des bactéries sur le métabolisme de l'azote ruminal. Cependant, comme ces nouvelles souches de M. elsdenii n'avaient pas encore été évaluées davantage en raison d'une extraction et d'une culture récentes à partir d'un rumen acidotique, une explication possible est la compétition de ces souches envers les substrats utilisés par d'autres groupes bactériens24. Ces nouvelles souches peuvent avoir concouru pour les protéines avec d'autres groupes bactériens ; expliquant peut-être la dégradation réduite des protéines pour ce traitement. De plus, avoir un traitement sans levure (ou uniquement avec de la levure) donne une image plus claire des effets spécifiques de M. elsdenii seul ou même de leur complémentarité ; cependant, étant donné les limites de l'étude actuelle, celle-ci n'a pas été évaluée et des recherches supplémentaires sont justifiées.

En conclusion, cette étude a réussi à induire une acidose ruminale aiguë in vitro, comme le montre la diminution du pH de fermentation en dessous de 5,2 pendant une période prolongée dans des fermenteurs à culture continue à double flux. De plus, en isolant les facteurs qui ne peuvent être isolés in vivo en raison de la variation individuelle des animaux, nous avons pu évaluer plus clairement le début de l'acidose ruminale aiguë et proposer des lacunes potentielles dans les connaissances, qui sont moins susceptibles d'être observées in vivo. Les traitements DFM avaient un modèle différent de production d'acide lactique par rapport au témoin ; plus d'acide d-lactique a été produit que d'acide l-lactique pendant la fermentation. Les traitements ont favorisé une légère augmentation de l'acide propionique pendant la provocation, mais aucune réduction des concentrations de lactate n'a été observée. Étant donné que la concentration d'acide lactique était inférieure à ce à quoi nous nous attendions dans l'étude actuelle, les données indiquent que d'autres facteurs que l'acide lactique peuvent avoir plus d'importance dans l'apparition de l'acidose ruminale aiguë que précédemment rapporté. Ce système in vitro a permis d'observer une concentration réduite de NH3–N, proche de la carence ; une situation qui n'est pas toujours observée in vivo en raison de la stimulation du recyclage de l'urée et qui a de fortes chances de faire partie de la survenue d'une acidose ruminale aiguë. Enfin, malgré l'absence d'effets majeurs du DFM testé dans notre étude, le mélange de YMM contenant tous les micro-organismes utilisés comme DFM a réduit la dégradation des protéines tout en étant le seul traitement surmontant le défi au dernier jour de fermentation. Les résultats rapportés dans cette étude concernant l'importance de N sur l'acidose ruminale aiguë mettent en évidence une fois de plus d'autres facteurs importants en plus de l'acide lactique qui pourraient devoir être pris en compte dans les recherches futures visant à améliorer un tel trouble nutritionnel pertinent dans l'industrie bovine et laitière.

Toutes les procédures expérimentales impliquant les animaux utilisés comme donneurs de liquide ruminal dans l'étude ont été menées selon des protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Floride (IACUC #202009849). De plus, toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux directives et réglementations de l'IACUC. L'étude suivante est rapportée conformément aux directives ARRIVE.

Huit fermenteurs à culture continue à double flux (1820 ml) similaires à ceux développés par Hoover et al.36 et modifiés par Del Bianco Benedeti et al.37, Silva et al.38, et Paula et al.39 ont été utilisés dans l'étude pour simuler la fermentation ruminale. Chacun des fermenteurs a été considéré comme une unité expérimentale et ils ont été disposés selon une conception en carré latin 4 × 4 reproduite. Il y avait 4 périodes expérimentales, chacune consistant en 11 jours de fermentation. Des conditions d'acidose ruminale aiguë ont été créées dans les fermenteurs en les nourrissant des jours 1 à 8 avec un régime qui ne provoquerait pas d'acidose ruminale aiguë (régime non acidotique), et des jours 9 à 11 en nourrissant les fermenteurs avec un régime riche en céréales (défi diète) pour favoriser les conditions acidosiques. Les deux régimes ont été formulés de manière similaire à ceux des bouvillons de boucherie de finition19 et sont présentés dans le tableau 4.

Un jour avant de changer de régime (jour 8), les traitements expérimentaux (microbiens alimentés directement) ont été infusés dans les fermenteurs pendant l'heure d'alimentation du matin et à chaque heure d'alimentation par la suite jusqu'au jour 11. Les traitements étaient un contrôle, contenant uniquement le support utilisé. dans tous les traitements (solution aqueuse à 15 % de glycérol) ; YM1, le porteur plus S. cerevisiae et M. elsdenii souche 1 ; YM2, le porteur plus S. cerevisiae et M. elsdenii souche 2 ; et YMM, le porteur plus S. cerevisiae et la moitié des doses de M. elsdenii souche 1 et souche 2. Chaque dose de DFM avait une concentration de 1 × 108 UFC/mL. Tous les traitements et leur composition sont présentés dans le tableau 5.

Les ingrédients alimentaires utilisés tout au long de l'expérience ont été acquis à partir du même lot d'aliments et broyés plus tard le même jour. Les ingrédients ont été broyés pour passer un tamis de 2 mm à l'aide d'un broyeur Wiley (Arthur H. Thomas Co., Philadelphie, PA), et un sous-échantillon de 500 g de chacun des ingrédients a été broyé pour passer un tamis de 1 mm pour les analyses chimiques. . Tous les ingrédients alimentaires ont été correctement stockés dans un environnement à température et humidité contrôlées. Pour chaque heure d'alimentation, les régimes ont été préparés individuellement pour chaque fermenteur en pesant séparément les ingrédients alimentaires et en les stockant dans des sacs en plastique scellés (14 × 8 cm).

Trois bouvillons Black Angus pesant en moyenne 630 kg de poids corporel et équipés de canules ruminales permanentes de 10 cm (Bar Diamond, Inc., Parma, ID) ont été utilisés comme donneurs de contenu ruminal. Les animaux ont été maintenus à partir de 2 semaines avant la première collecte jusqu'à la fin de l'étude dans le même régime non acidotique donné aux fermenteurs. Le jour de l'inoculation, le contenu ruminal a été recueilli sur les 3 bouvillons canulés 2 h après l'alimentation du matin dans les zones antérieure, postérieure, caudale et ventrale du rumen. Le contenu ruminal a été filtré à travers 4 couches d'étamine dans des récipients isolés préchauffés et apporté au laboratoire (~ 5 min). Au laboratoire, le contenu ruminal de tous les animaux a été également homogénéisé avant d'être inoculé dans les fermenteurs. Le contenu ruminal a ensuite été versé dans les fermenteurs préchauffés jusqu'à la limite de l'effluent. Les conditions de fermentation ont été maintenues en réglant les fermenteurs sur une agitation de 100 tr/min, une température de 39 °C et une infusion de N2 dans le contenu de la fermentation et dans l'espace de tête des fermenteurs de 200 mL de N2/min.

Indépendamment du régime alimentaire, les fermenteurs ont reçu 107 g de MS par jour répartis également en deux repas (7h00 et 21h00). La salive artificielle a été préparée selon Weller et Pilgrim40 et a été infusée en continu dans les fermenteurs comme tampon pour la fermentation ruminale. Pour simuler le recyclage de l'urée dans le rumen, de l'urée a été ajoutée à la salive artificielle à raison de 0,4 g/L. Comme le système de culture continue à double flux permet de prédéterminer les taux de passage du contenu ruminal hors des fermenteurs, le taux de dilution a été fixé à un taux de 10 %/h tandis que le taux de passage des solides a été fixé à un taux de 5 %/h ; tous basés sur le volume du fermenteur et similaires à ceux observés dans les bouvillons de finition. Ces taux ont été ajustés par deux mécanismes : (1) l'infusion continue de salive artificielle à travers une pompe péristaltique (portion liquide) avec le régime (portion solide) dans les fermenteurs ; et (2) la sortie continue du contenu de la fermentation à travers deux orifices, étant le premier l'élimination du liquide de fermentation filtré (treillis métallique de 500 µm) des fermenteurs à un taux de 5 %/h du volume du fermenteur par une autre pompe péristaltique, et le second étant l'écoulement continu par gravité du contenu de fermentation de la différence entre le mécanisme 1 et l'évacuation du liquide de fermentation filtré du fermenteur. Le contenu des deux orifices de sortie de chaque fermenteur a été recueilli dans deux récipients en plastique séparés de 4,3 L.

Tout au long de l'expérience, le pH de la fermentation a été mesuré manuellement toutes les heures pendant 14 h pour représenter une journée de fermentation complète, commençant juste avant l'heure du repas du matin (07 h 00) et s'arrêtant juste avant l'heure du repas du soir (21 h 00). Les heures d'alimentation ont été effectuées en considérant un intervalle de 14 h pendant la journée (0700 à 2100 h) et 10 h pendant la nuit (2100 à 0700 h) pour que le pH le plus bas d'une journée complète ait lieu 3 à 4 h après le matin. temps d'alimentation (basé sur un pré-essai que nous avons effectué avant l'étude). Ces mesures de pH ont été effectuées avec un pH-mètre portable (Thermo Scientific Orion Star A121) à travers un orifice dans l'espace de tête des fermenteurs. À l'exception des jours d'échantillonnage, le contenu des effluents dans les récipients en plastique était pesé et jeté quotidiennement juste avant l'heure du repas du matin.

Juste avant l'heure du repas du matin au jour 5 de chaque période, les conteneurs d'effluents de chaque fermenteur ont été mélangés et un échantillon de 500 g a été prélevé pour une analyse de l'abondance naturelle 15N ; cet échantillon a été nommé background. Ensuite, les fermenteurs ont été enrichis en 15N comme marqueur de la synthèse des protéines microbiennes en amenant d'abord la concentration de 15N à un état stable dans les fermenteurs et plus tard en maintenant l'infusion de 15N constante dans ceux-ci40. Par conséquent, une dose d'impulsion de 10,2 % d'excès de (15NH4) 2SO4 a été infusée dans les fermenteurs avant l'heure du repas du matin le jour 5, et l'urée dans la salive artificielle a été partiellement remplacée par une quantité isoazotée de (15NH4) 2SO4 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO); cette salive artificielle marquée au 15N a été utilisée du jour 5 jusqu'à la fin de chaque période expérimentale.

Au jour 6 et pendant toute la période de collecte, les conteneurs d'effluents ont été conservés dans un bain d'eau réfrigérée (< 4 ° C) pour arrêter l'activité microbienne du contenu de l'effluent chaque fois que celui-ci quittait les fermenteurs. Au jour 7, sous le régime non acidotique et un jour avant l'application des traitements, le pH a été mesuré toutes les heures entre les heures d'alimentation du matin et du soir (14 h), et deux échantillons (10 et 2 ml) ont été prélevés à l'intérieur. les fermenteurs juste avant l'alimentation du matin et à 1, 2, 3, 4, 5, 8, 11 et 14 h après l'alimentation pour les analyses de concentration en NH3–N, AGV et lactate dans les fermenteurs. L'échantillon pour NH3–N et VFA (10 mL) a été recueilli en filtrant le contenu de la fermentation dans 4 couches d'étamine et en acidifiant immédiatement le liquide dans 0,1 % d'une solution de H2SO4 à 50 %. L'échantillon de lactate (2 ml), bien que non acidifié, a également été recueilli en filtrant le contenu de la fermentation dans 4 couches d'étamine ; les deux échantillons ont été stockés à – 20 °C pour une analyse plus approfondie. Ces échantillons ont été utilisés comme covariable pour leurs variables respectives plus tard dans les analyses statistiques.

Du 8e au 11e jour, les traitements ont ensuite été appliqués à chaque heure d'alimentation. Les traitements ont été conservés dans des flacons à bouchon à vis séparés par temps d'alimentation et stockés dans un congélateur à - 80 ° C jusqu'au moment où chaque flacon a été utilisé. Quinze minutes avant chaque heure d'alimentation, les flacons à utiliser pendant ce temps spécifique ont été décongelés dans de l'eau tiède, et la culture de chaque flacon a été remise en suspension 5 fois à l'aide d'un embout de pipette stérile. Ensuite, suivant les doses rapportées dans le tableau 5, chaque traitement a été appliqué à leurs fermenteurs respectifs avec le régime alimentaire. Pour le jour 8, les mêmes collectes de pH, NH3–N, AGV et lactate ont été effectuées, et les données ont été utilisées comme un aperçu du schéma de fermentation pour les fermenteurs pendant le régime non acidotique (ligne de base).

Enfin, des jours 9 à 11, le régime non acidotique a été remplacé par le régime de provocation et donné aux fermenteurs tout en recevant leurs traitements respectifs. Le même programme d'échantillonnage des jours 7 et 8 pour le pH, le NH3–N, les AGV et le lactate a été effectué pour évaluer à la fois le scénario d'acidose ruminale aiguë et la réponse de fermentation aux traitements. Aussi, dans le but d'évaluer comment les traitements pouvaient affecter le métabolisme de l'azote ruminal et la véritable digestibilité des nutriments après une journée complète de fermentation, un échantillon de 500 g a été prélevé dans l'effluent de chaque fermenteur (mélange des deux récipients) et stocké à -20 °C pour une analyse plus approfondie. De même, un échantillon de 10 ml a été prélevé en suivant la même préparation d'échantillon décrite précédemment pour le NH3–N et les AGV afin d'explorer davantage le débit quotidien final de NH3–N et la concentration en AGV représentant un jour de fermentation. Ces collectes ont été effectuées à partir des effluents avant l'heure du repas du matin suivant pour tenir compte d'une journée expérimentale complète.

À la fin du dernier jour de chaque période expérimentale, tout le contenu de chaque fermenteur a été utilisé pour l'isolement bactérien en suivant les procédures décrites par Krizsan et al.41 et Brandão et al.42. En bref, le contenu a été mélangé avec une solution de NaCl de 200 ml pendant 30 s, puis filtré à travers 4 couches d'étamine et les solides retenus ont été rincés avec 200 ml supplémentaires de la solution de NaCl. Le contenu filtré a ensuite été centrifugé trois fois sous 4 °C jusqu'à l'obtention d'un culot bactérien propre. Le culot a également été stocké à - 20 ° C pour une analyse plus approfondie.

Les échantillons pour les analyses NH3-N et VFA ont été centrifugés à 10 000 xg pendant 15 min à 4 °C. Un sous-échantillon du surnageant a été utilisé pour la détermination de NH3–N. L'analyse NH3–N a été réalisée selon Broderick et Kang43 avec une adaptation pour les lecteurs de plaques44. Le surnageant restant a été centrifugé à nouveau à 10 000 x g pendant 15 min à 4 ° C, le surnageant le plus récent étant filtré à travers un filtre seringue en acétate de cellulose (SF14485, Tisch Scientific®) pour analyse VFA. La concentration en AGV a été analysée à l'aide d'un chromatographe liquide à haute performance (HPLC ; Hitachi L2400, Tokyo, Japon)45.

Les échantillons non acidifiés ont été bouillis à 100 ° C pendant 10 min pour dénaturer les enzymes et volatiliser les VFA de l'échantillon. Ensuite, les échantillons ont été centrifugés à 10 000 × g pendant 15 min à 4 ° C, et le surnageant transféré dans un nouveau tube de microcentrifugeuse utilisé pour la détermination des concentrations de d-lactate, de l-lactate et de lactate total. Les concentrations de lactate ont été analysées par réactions enzymatiques avec un kit R-Biopharm46. En bref, il s'agissait d'une méthode enzymatique divisée en deux étapes, qui ont été utilisées pour la détermination de la concentration de d- et l-lactate, respectivement. La concentration de lactate a été déterminée en utilisant les enzymes d- et l-lactate déshydrogénase, et la concentration totale de lactate a été calculée à partir de la somme des deux concentrations de lactate.

Le contenu de l'effluent et les culots bactériens ont été lyophilisés à l'aide d'un Labconco FreeZone 6 (Labconco Corporation, Kansas City, MO, USA). Les ingrédients alimentaires, le bruit de fond, le contenu de l'effluent et les culots bactériens ont été analysés pour le DM (méthode 934.01 ; AOAC, 1990), les cendres (méthode 924.05)47 et l'enrichissement en N total et en 15N [analyseur CHNS couplé à un spectromètre de masse à rapport isotopique ( méthode de combustion sèche dumas)48. La MO a été considérée comme la différence entre les teneurs en MS et en cendres. La concentration de CP a été calculée à partir de la teneur en N total (N total × 6,25 ; base MS). Les ingrédients alimentaires, le contenu des effluents et les granulés bactériens ont été analysés pour le glucose total à l'aide d'une méthode enzymatique-colorimétrique49 dans le but de déterminer la teneur en amidon des nutriments alimentaires et du contenu des effluents, ainsi que la concentration en glycogène dans les cellules bactériennes. Les ingrédients alimentaires et le contenu des effluents ont été analysés pour NDF25 et ensuite analysés pour ADF50, tous deux avec une adaptation pour l'Ankom200 Fiber Analyzer (Ankom Technology, Macedon, NY). Les ingrédients alimentaires ont également été analysés pour l'extrait d'éther (EE ; méthode 920.85)51. La teneur en nutriments digestibles totaux (TDN) a été calculée à l'aide des équations suivantes :

Les données de pH ruminal ont été utilisées pour calculer le temps pendant lequel le pH se situait dans certains seuils entre les heures d'alimentation [temps d'acidose ruminale subaiguë (SARA ; temps pendant lequel le pH était compris entre 5,2 et 5,6) ; et le temps pendant lequel le pH était inférieur à 5,2 (indicateur d'acidose ruminale aiguë)]. Ensuite, pour quantifier les différences majeures de pH, l'aire sous la courbe de pH (aire sous la courbe ; AUC) a été calculée pour les seuils susmentionnés en utilisant la règle trapézoïdale20,52, comme suit :

où pH0 et pH1 sont deux mesures de pH dans un intervalle de pH t0 et t1, respectivement.

Pour la digestibilité des nutriments, étant donné que des résidus de nutriments provenant du régime non acidotique (jours 1 à 8) étaient encore présents les jours 9 à 11, nous avons signalé un flux réel de nutriments alimentaires hors des fermenteurs, ce qui signifie que plus la valeur du flux de nutriments était élevée. ça aurait été moins digéré. Le véritable flux de nutriments alimentaires a été calculé comme le nutriment total quittant le fermenteur corrigé par la concentration de ce nutriment dans les bactéries et la salive artificielle. Le N total dans le contenu de l'effluent a été partagé en NH3–N et N non ammoniac (NAN ; N d'alimentation non dégradé et N bactérien). Le débit de chacune de ces fractions de la fermentation a été calculé selon les équations décrites par Calsamiglia et al.53 et Bach et Stern54. Le flux d'azote alimentaire, l'efficacité bactérienne et l'efficacité d'utilisation de l'azote (ENU) ont été calculés selon Calsamiglia et al.53. Les calculs étaient les suivants :

Les données ont été analysées à l'aide de la procédure MIXTE de SAS sous la forme d'un plan en carré latin 4 × 4 répliqué. Le modèle principal utilisé pour nos analyses de données était le suivant :

où Yijkl est la variable de réponse, µ est la moyenne globale, Li est l'effet du carré latin (i = 1 ou 2), Pj est l'effet aléatoire de la période (j = 1–4), F(S)ki est l'effet aléatoire effet du fermenteur (F) dans le carré (k = 1–4), TRl est l'effet du traitement, Dm est l'effet du jour, T × Dlm est l'interaction entre le traitement et le jour, et Eijkl est l'erreur résiduelle.

Les acides gras volatils et les variables liées au pH calculées à partir de la dynamique du pH, telles que le pH moyen, les heures sous certains seuils et l'AUC ont été analysés à l'aide du modèle suivant :

ijkl est la variable de réponse, µ est la moyenne globale, Cov est la covariable (données recueillies au jour 7 de chaque période avant l'application des traitements), Li est l'effet du carré latin (i = 1 ou 2), Pj est l'effet aléatoire de période (j = 1–4), F(S)ki est l'effet aléatoire du fermenteur (F) dans le carré (k = 1–4), TRl est l'effet du traitement, Dm est l'effet du jour, T × Dlm est l'interaction entre le traitement et le jour, et Eijkl est l'erreur résiduelle. Les données de pH ruminal et les concentrations de NH3–N, de d-lactate, de l-lactate et de lactate total ont été analysées au fil du temps sous forme de mesures répétées dans un agencement de tracé en bande des variables JOUR et HEURE, incluses plus loin dans le modèle. Les structures de covariance testées dans tous les modèles étaient : AR (1), ARH (1), CS, TOEP, TOEPH, UN et VC ; la structure avec l'AIC le plus bas a été choisie. La signification a été déclarée à P ≤ 0,05 et les tendances à 0,05 < P ≤ 0,10. Le test de Tukey a été utilisé pour comparer les moyennes chaque fois que des différences ont été observées.

Toutes les figures ont été produites en utilisant le logiciel DataGraph de Visual Data Tools (https://www.visualdatatools.com). Toutes les données brutes sont disponibles sur demande auprès des auteurs.

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Bach, A. & Stern, MD Effets de différents niveaux de méthionine et de protéines non dégradables dans le rumen sur le profil d'acides aminés de l'effluent des fermenteurs à culture continue. J. Anim. Sci. 77, 3377–3384 (1999).

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Les auteurs tiennent à remercier Erin Mullin-Garcia et Emory Burda pour leur aide dans les procédures expérimentales et les analyses. Les auteurs expriment également leur gratitude pour les contributions et les discussions des Drs. Edzard van Santen et José Eduardo P. Santos de l'Université de Floride, et Luiz F. Ferraretto de l'Université du Wisconsin, Madison. Les auteurs sont également reconnaissants pour le financement disponible pour les expériences de l'Institut des sciences alimentaires et agricoles (IFAS) de l'Université de Floride.

Département de la santé de la population et de la reproduction, École de médecine vétérinaire, Université de Californie, Davis, CA, 95616, États-Unis

Hugo F. Monteiro

Département des sciences animales, vétérinaires et alimentaires, Université de l'Idaho, Moscou, ID, 83844, États-Unis

Bruna C. Agustinho

Département des sciences animales, Université de Floride, Gainesville, FL, 32611, États-Unis

Hugo F. Monteiro, Bruna C. Augustine, James R. Vinyard, Takoha Harden, Sarah L. Bennett, Jose A. Maple-Lamb, Efstathios Sarmikasoglou, Anay D. Ravelo, Aneesa Bahman, Sarong So, Elis R. Vieira & Antonio P. Faciola

Département des sciences agricoles et environnementales, Université de Tuskegee, Tuskegee, AL, 36088, États-Unis

Bonus de durcissement

Département des sciences animales, Penn State University, University Park, PA, 16803, États-Unis

Sarah L. Bennett

Département de médecine vétérinaire des populations, Université du Minnesota, St. Paul, MN, 55108, États-Unis

Anay D. Ravelo

Département des sciences animales, Université de Khon Kaen, Khon Kaen, Thaïlande

Paréo So

Département des sciences animales, Université fédérale de Tocantins, Palmas, Brésil

Elis R. Vieira

Département des sciences animales, Université nationale de Battambang, Battambang, Cambodge

Paréo So

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Cette étude a été conçue par HM et AF L'expérience a été menée par HM, BA, JV, TH, SB, JA, ES, AR, AB et EV Le traitement et les analyses des échantillons ont été effectués par HM, BCA, ES, AR et SS Données l'analyse et la préparation du manuscrit ont été effectuées par HM La révision du matériel a été effectuée par HM et AF

Correspondance à Antonio P. Faciola.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Monteiro, HF, Agustinho, BC, Vinyard, JR et al. Megasphaera elsdenii et Saccharomyces Cerevisiae en tant que microbes nourris directement lors d'un test d'acidose ruminale aiguë in vitro. Sci Rep 12, 7978 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11959-2

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Reçu : 25 septembre 2021

Accepté : 27 avril 2022

Publié: 13 mai 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-11959-2

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