Livraison de protéines programmable avec un système d'injection contractile bactérien

Nature volume 616, pages 357–364 (2023)Citer cet article

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Les bactéries endosymbiotiques ont développé des systèmes de livraison complexes qui permettent à ces organismes de s'interfacer avec la biologie de l'hôte. Un exemple, les systèmes d'injection contractile extracellulaire (eCIS), sont des complexes macromoléculaires en forme de seringue qui injectent des charges utiles de protéines dans les cellules eucaryotes en entraînant une pointe à travers la membrane cellulaire. Récemment, il a été découvert que les eCIS ciblaient les cellules de souris1,2,3, ce qui soulève la possibilité que ces systèmes puissent être exploités pour l'administration de protéines thérapeutiques. Cependant, la capacité des eCIS à fonctionner dans les cellules humaines reste inconnue et le mécanisme par lequel ces systèmes reconnaissent les cellules cibles est mal compris. Ici, nous montrons que la sélection de la cible par la cassette de virulence de Photorhabdus (PVC) - un eCIS de la bactérie entomopathogène Photorhabdus asymbiotica - est médiée par la reconnaissance spécifique d'un récepteur cible par un élément de liaison distal de la fibre de queue en PVC. De plus, en utilisant l'ingénierie guidée par la structure in silico de la fibre de la queue, nous montrons que les PVC peuvent être reprogrammés pour cibler des organismes non ciblés nativement par ces systèmes, y compris les cellules humaines et les souris, avec des efficacités proches de 100 %. Enfin, nous montrons que les PVC peuvent charger diverses charges utiles de protéines, y compris Cas9, des éditeurs de base et des toxines, et peuvent les délivrer de manière fonctionnelle dans les cellules humaines. Nos résultats démontrent que les PVC sont des dispositifs programmables d'administration de protéines avec des applications possibles en thérapie génique, en cancérologie et en lutte biologique.

Pour les bactéries endosymbiotiques, il est souvent avantageux de sécréter des facteurs qui modulent la biologie de l'hôte en faveur de la forme physique des symbiotes4. Cependant, bon nombre de ces facteurs ne peuvent pas facilement traverser les membranes cellulaires; cela a conduit au développement de systèmes complexes qui délivrent activement des protéines de charge utile dans les cellules5. Un exemple est les systèmes d'injection contractile (CIS), une classe de nanomachines en forme de seringue ressemblant à des queues de bactériophages6,7.

Les CIS sont des complexes macromoléculaires contenant une structure de tube rigide logée dans une gaine contractile, qui est ancrée à une plaque de base et aiguisée par une protéine de pointe8,9,10,11,12,13,14. On pense que les charges utiles se chargent dans la lumière du tube interne derrière la pointe, forment des protéines de fusion avec le tube ou s'associent à la pointe elle-même, qui, lors de la reconnaissance de la cellule cible, est forcée à travers la membrane via la contraction de la gaine2,3,15,16,17. Cette stratégie s'est avérée remarquablement efficace dans toute la biosphère, car il a été démontré que les SIC ciblent des organismes des trois domaines de la vie12,18,19. Les CIS peuvent être ancrés à la membrane bactérienne, ce qui donne un système de délivrance dépendant du contact connu sous le nom de système de sécrétion de type VI8,20 (T6SS), ou peuvent être attachés à la membrane thylakoïde des cyanobactéries (tCIS) pour être activés lors d'une réponse au stress cellulaire13 ; enfin, ils peuvent être produits sous forme de complexes libres (eCIS) et libérés de manière extracellulaire pour délivrer des charges utiles indépendantes du producteur bactérien21,22,23,24. Les eCIS sont largement distribués dans les bactéries et les archées, et il a été démontré qu'ils se regroupent en au moins six sous-familles, dont seulement deux contiennent des exemples caractérisés21,22,23. Il a été démontré que les charges utiles eCIS présentent une variété de fonctions naturelles, y compris la modulation du cytosquelette de l'hôte18,24, le clivage de l'ADN1, l'induction de la métamorphose15,25 et la toxicité de l'hôte22,24,26, indiquant que ces systèmes ont été adaptés à plusieurs niches biologiques. Récemment, il a été découvert que les eCIS ciblaient les cellules de souris1,2,3, ce qui soulève la possibilité que ces systèmes puissent être exploités comme outils de délivrance de protéines. Cependant, l'activité des eCIS n'a pas encore été démontrée dans les cellules humaines, et le mécanisme par lequel les eCIS reconnaissent les cellules cibles - une nécessité si ces systèmes doivent être développés en dispositifs de délivrance ciblés - reste à élucider.

Pour nos études sur l'activité des eCIS, nous nous sommes concentrés sur un sous-type d'eCIS : les PVC. Les PVC sont des eCIS produits par des membres du genre Photorhabdus, qui existent en tant qu'endosymbiontes au sein des nématodes entomopathogènes24. Les PVC consistent en un opéron d'environ 20 kb contenant 16 gènes centraux (pvc1–16) nécessaires à l'assemblage d'un système d'injection fonctionnel (Fig. 1a). Immédiatement en aval de pvc1–16 se trouvent les charges utiles Pdp1 et Pnf, qui, comme pour tous les eCIS, sont censées pénétrer dans les cellules cibles via la contraction de la gaine en PVC et le démontage ultérieur du complexe pointe-tube (Fig. 1b).

a, Schéma du locus P. asymbiotica PVCpnf contenant 16 gènes structuraux et accessoires (en bleu et violet, respectivement) suivis de deux gènes de charge utile (Pdp1 et Pnf, en rouge) et de quatre gènes régulateurs putatifs (en orange). Les illustrations en PVC sont des approximations et ne sont pas dessinées à l'échelle. b, Mécanisme proposé de délivrance de protéines médiée par le PVC. Les PVC reconnaissent probablement les cellules cibles via les fibres de la queue (Pvc13), entraînant une contraction du mécanisme de la gaine qui entraîne une pointe à travers la membrane cellulaire. On pense alors que les protéines de charge utile pénètrent dans la cellule via le démontage du complexe pointe-tube. c, les PVC peuvent être purifiés à partir d'E. coli. Le locus PVCpnf a été transformé en E. coli et des particules de PVC intactes ont été isolées. Les préparations de PVC résultantes ont ensuite été passées sur un gel SDS – PAGE dénaturant et imagées avec un TEM à coloration négative. Barres d'échelle, 100 nm. d, les PVC peuvent être visualisés se liant aux cellules cibles. Des particules de PVC contenant des protéines de gaine marquées par un épitope (Pvc2) ont été incubées avec des cellules Sf9 et la liaison a été visualisée par immunofluorescence. Barre d'échelle, 100 μm. e, les charges utiles non natives peuvent être chargées dans des particules de PVC. Le domaine d'encapsidation (PD) de Pdp1 (Extended Data Fig. 3b, c) a été fusionné à de nouvelles protéines et la charge a été déterminée par western blot dénaturant. Pvc12 (embase) a servi de contrôle de chargement. WT, type sauvage. f, les particules de PVC de type sauvage tuent les cellules d'insectes cultivées. La cytotoxicité médiée par le PVC nécessitait à la fois l'action du gène de reconnaissance de cible putatif (pvc13; fibre de queue) et du chargeur de charge utile (pvc15; ATPase). Barre d'échelle, 200 μm. g, les PVC peuvent fournir une charge utile non native (chargée comme en e) dans les cellules cibles. Barre d'échelle, 200 μm. Les données en f,g sont moyennes ± sd avec n = 3 réplicats biologiques ; ANOVA unidirectionnelle avec test post hoc de Bonferroni. ****P < 0,0001.

Données source

Nous avons d'abord conçu Escherichia coli pour produire des PVC à partir de P. asymbiotica ATCC 43949 (PVCpnf) (Extended Data Fig. 1a) en utilisant une méthode similaire à celle décrite précédemment9. Pour faciliter la manipulation en aval, nous avons divisé le système PVC en plasmides distincts structurels et accessoires (pPVC) et charge utile et réglementaire (pPayload). Lorsqu'ils ont été examinés à l'aide d'une microscopie électronique à transmission (TEM) à coloration négative, les complexes protéiques résultants ressemblaient à des eCIS canoniques contenant des plaques de base et des structures de gaine intactes présentant une longueur d'environ 116 nm (Fig. 1c et Extended Data Fig. 1b). Nous avons observé que pPayload était nécessaire pour produire des particules de PVC détectables (Extended Data Fig. 1c – h), suggérant que de petits gènes dans la région de charge utile (marqués en orange sur la Fig. 1a et supposés ailleurs9 être impliqués dans la régulation des gènes) sont essentiels pour la formation de PVC dans E. coli. Enfin, nous avons également constaté que lorsque ces complexes purifiés étaient brièvement exposés à des cellules d'insectes Sf9 en culture (choisies en raison de la relation de cette lignée cellulaire avec l'insecte ciblé de manière endogène par PVCpnf24), ils se lient solidement à la surface cellulaire (Fig. 1d et Extended Data Fig. 2). Ces résultats démontrent que E. coli peut être utilisé pour fabriquer des complexes de PVC présentant à la fois un assemblage et un ciblage appropriés.

Pour développer les PVC en dispositifs de distribution de protéines programmables, nous avons ensuite tenté de charger de nouvelles charges utiles non natives dans le PVC (Fig. 1e et Extended Data Fig. 3a). Bien que le mécanisme par lequel les PVC recrutent des charges utiles ne soit pas entièrement compris, il a été récemment montré que des régions hautement désordonnées sur les extrémités N des protéines de charge utile PVC endogènes (Extended Data Fig. 3b) sont impliquées dans le processus de chargement3. Nous avons confirmé que les charges utiles modifiées dépourvues de cette région désordonnée ne se chargeaient pas dans les PVC (données étendues Fig. 3c, d), indiquant que cette région représente un «domaine de conditionnement» nécessaire au chargement d'une charge utile dans le complexe PVC. Nous avons donc fusionné ce domaine d'emballage à diverses protéines qui ne sont pas naturellement chargées dans le PVC (GFP, Cre et une nucléase à doigt de zinc) et testé si les charges utiles résultantes étaient chargées dans les PVC (Fig. 1e). Nous avons constaté qu'en présence de pvc15 (une ATPase également nécessaire pour le chargement de la charge utile3), les trois nouvelles charges utiles sont co-purifiées avec les PVC, confirmant que cette méthode (fusion N-terminale d'un domaine d'emballage) est une stratégie généralisable pour charger de nouvelles protéines dans des particules de PVC.

Enfin, nous avons testé si la livraison de protéines médiée par le PVC - avec des charges utiles endogènes et artificielles - pouvait être directement observée dans des cellules d'insectes en culture. Après avoir incubé des cellules Sf9 avec des PVC non modifiés abritant des charges utiles de toxine native, nous avons observé une cytotoxicité robuste (Fig. 1f). Notamment, nous avons constaté que ce phénotype nécessitait la présence de plusieurs gènes PVC critiques, y compris ce que nous avons supposé être l'élément de ciblage du PVC (pvc13, codant pour la fibre de la queue) et un gène précédemment suggéré comme étant le payload loader3 (pvc15). De plus, l'administration de charges utiles purifiées séparément ou de complexes PVC déchargés était insuffisante pour reproduire ce phénotype (données étendues Fig. 4a, b), indiquant que l'activité observée nécessitait les actions du complexe PVC et des charges utiles de toxine. De plus, lorsqu'ils sont administrés à des cellules Sf9 hébergeant un système rapporteur Cre (loxP – GFP), les PVC chargés artificiellement de Cre (en utilisant la méthode décrite à la Fig. 1e) produisent un signal GFP (Fig. 1g et données étendues Fig. 4c), démontrant qu'une nouvelle charge utile protéique peut être délivrée de manière fonctionnelle via le PVC. Ensemble, ces résultats montrent que les PVC recombinants sont biologiquement actifs contre les cellules d'insectes en culture et peuvent être reprogrammés pour charger et délivrer des protéines non natives dans les cellules cibles afin d'obtenir de nouvelles activités biologiques.

Le mécanisme par lequel les PVC se lient aux cellules cibles n'est pas connu. Cependant, la reconnaissance de la cible par les phages contractiles de la queue (qui ressemblent aux PVC) est bien comprise. Le phage T4 possède six longues fibres de queue qui s'étendent du complexe de la plaque de base et forment des interactions réversibles avec des molécules de lipopolysaccharide ou des protéines de la membrane externe à la surface des cellules hôtes27,28,29. Ce processus positionne le phage dans la bonne orientation au-dessus de la cellule cible et permet à la plaque de base de se rapprocher suffisamment de la surface de la cellule pour se lier de manière irréversible et initier l'injection du génome du phage dans la cellule29,30. Un certain nombre d'études ont démontré que les modifications des fibres de la queue des phages et d'autres CIS ciblant les bactéries sont suffisantes pour modifier la spécificité de la cible de manière prévisible31,32,33,34, indiquant que ces protéines sont des déterminants importants de la spécificité de la cible dans ces systèmes. Bien que l'on ne sache pas actuellement comment les PVC et les autres eCIS ciblent les cellules et initient le processus d'injection, nous avons proposé qu'il soit possible de modifier la spécificité de la cible PVC en utilisant une technique similaire. En particulier, les locus PVC contiennent un gène de fibre de queue (pvc13) qui possède un domaine prédit similaire à la pointe de liaison au récepteur de la fibre de queue courte du phage T4 (données étendues Fig. 5a). Il convient de noter que les fibres de queue de PVC divergent des fibres de queue de phage en ce qu'elles contiennent souvent également des régions qui correspondent aux protéines de liaison aux récepteurs des virus eucaryotes (en particulier celles des adénovirus), ce qui appuie l'hypothèse selon laquelle la fibre de queue de PVC est impliquée dans la reconnaissance d'un organisme eucaryote. Il a également été démontré que les fibres de queue en PVC se connectent à la plaque de base et se replient vers le haut le long de la gaine de la même manière que chez les phages9. Dans l'ensemble, ces observations suggèrent que la fibre de la queue est probablement impliquée dans la reconnaissance de la cible et pourrait être exploitée pour manipuler la spécificité de la cible des PVC.

Nous avons testé si des modifications de la protéine de fibre de queue de PVC (Pvc13) pouvaient produire des altérations du tropisme et permettre le ciblage des cellules humaines. Nous avons utilisé AlphaFold35,36,37 pour prédire la structure 3D de la pointe distale putative de Pvc13 - la région qui, selon nous, établirait le contact initial avec les cellules cibles (Fig. 2a et Données étendues Fig. 5b – d). Lorsqu'elle est interrogée en tant que trimère, l'extrémité C-terminale de Pvc13 forme une structure de tube hélicoïdal prédite avec une pointe globulaire que nous pensons être le domaine de liaison de la fibre de queue globale. Nous avons émis l'hypothèse que la modification des caractéristiques de liaison de ce domaine de liaison distal pourrait entraîner des changements prévisibles du tropisme PVC, comme c'est le cas avec les fibres de queue d'autres CIS. Pour tester cela, nous avons inséré un nouveau domaine de liaison spécifique aux cellules humaines (le domaine du bouton trimérique de l'adénovirus humain 5 (Ad5)38 ou la protéine de répétition de l'ankyrine (DARPin) E0139 conçue spécifiquement pour le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR)) dans la région de liaison C-terminale putative de Pvc13 (pour générer Pvc13-Ad5-knob ou Pvc13-E01-DARPin, respectivement) et testé si les PVC résultants pouvaient cibler cellules humaines. Pour cette expérience, nous avons utilisé des cellules d'adénocarcinome pulmonaire humain A549 comme lignée cellulaire modèle car elle est connue pour surexprimer l'EGFR et est sensible à l'infection par Ad5. Nous avons constaté que les PVC équipés de Pvc13 – Ad5-knob ou Pvc13 – E01-DARPin tuaient efficacement les cellules A549 lorsqu'ils étaient chargés avec les toxines natives Pdp1 et Pnf (Fig. 2a et données étendues Fig. 6a – d) ou produisaient une expression efficace de la GFP dirigée par Cre dans les cellules A549 loxP-GFP lorsqu'elles étaient chargées avec Pdp1-NTD – Cre (le domaine N-terminal (NTD) de Pdp1 te thered to Cre) comme décrit dans la Fig. 1e (Fig. 2a). Notamment, cette activité a été abolie lorsque les PVC étaient équipés soit de domaines de bouton Ad5 mutants (Δ491/492 - précédemment montrés pour réduire la liaison de l'Ad5 aux cellules cibles 40 ; données étendues Fig. 6e, f) ou d'une DARPin non ciblée (anti-lysozyme DARPin A4 (Protein Data Bank : 5OP1)), indiquant que l'activité du PVC dans les cellules humaines dépend de la présence de fibres de queue qui peuvent se lier correctement aux cellules humaines. Enfin, nous avons constaté que les PVC hébergeant Pvc13 – Ad5-knob ou Pvc13 – E01-DARPin se regroupaient à la surface des cellules humaines (Fig. 2a, en bas), ce qui suggère que l'activité observée était le résultat d'une nouvelle interaction de liaison entre les PVC modifiés et les cellules cibles. Ces résultats démontrent que Pvc13 est un élément déterminant du tropisme du PVC et que cette protéine peut être modifiée pour produire des changements prévisibles de la spécificité cible de ce système.

a, l'ingénierie guidée par AlphaFold de Pvc13 (fibre de queue) donne des PVC présentant une activité de délivrance efficace dans les cellules humaines. En haut, le domaine de reconnaissance cible putatif de Pvc13 (acides aminés 403–476) a été supprimé (produisant Pvc13 (tronqué)) et remplacé soit par le domaine de liaison à la cible de l'adénovirus humain 5 (produisant Pvc13 – Ad5-knob) soit par un DARPin spécifique de l'EGFR humain (produisant Pvc13 – E01-DARPin). Des variants de Pvc13 contenant des domaines de liaison non ciblés (Pvc13–Ad5-knob(Δ491/492) et Pvc13–A4-DARPin) ont également été inclus comme témoins négatifs. En bas, les particules de PVC ont été chargées de charges utiles de toxine de type sauvage (WT) ou d'une nouvelle charge utile (Cre), et l'apport de protéines induites par le PVC a été mesuré en tant que cytotoxicité ou expression de GFP, respectivement. En bas, de nouvelles conceptions de PVC peuvent être observées se liant aux cellules humaines (dans ce cas, U2OS pour faciliter l'imagerie par immunofluorescence). La liaison des cellules cibles nécessitait la présence de Pvc13–Ad5-knob ou Pvc13–E01-DARPin ; Les PVC hébergeant le Pvc13 de type sauvage, le Pvc13 tronqué ou une protéine de fusion non ciblant ne se sont pas regroupés à la surface des cellules. Barres d'échelle, 300 μm. b, les conceptions de PVC ciblant l'homme peuvent délivrer la protéine SpCas9 dans les cellules HEK 293FT, permettant l'édition de gènes médiée par le PVC dans les cellules humaines. La formation d'Indel nécessitait la présence d'un domaine de bouton Ad5 non muté dans Pvc13, indiquant que cette activité nécessitait l'action du PVC. Les conditions sont répertoriées au format PVC (conception Pvc13)–charge utile. c, les conceptions en PVC ciblant l'homme peuvent fournir des ZFD dans les cellules HEK 293FT, permettant l'édition de base dans les cellules humaines. La substitution de base G à A sur cible n'a été observée que lorsque chaque moitié de ZFD (ZFD-L et ZFD-R) a été délivrée par un PVC correctement ciblé ; les PVC non ciblant ont produit une activité négligeable. d, les conceptions en PVC ciblant l'homme peuvent tuer les cellules leucémiques (Jurkat). La cytotoxicité n'a été produite que lorsque les PVC ont été reciblés vers un récepteur des lymphocytes T connu pour être exprimé par les cellules Jurkat (CD4), mais pas lorsqu'ils ont été reciblés vers un récepteur myéloïde introuvable sur les cellules Jurkat (CD11b). Les données sont moyennes ± écart-type avec n = 3 réplicats biologiques ; ANOVA unidirectionnelle avec test post hoc de Bonferroni.

Données source

Pour caractériser davantage le PVC en tant qu'outil de délivrance de protéines, nous avons étendu les résultats de la figure 2a en établissant plusieurs applications de délivrance utiles dans les cellules humaines. Nous avons d'abord testé si les PVC pouvaient être reprogrammés pour charger et délivrer Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) afin d'effectuer l'édition de gènes dans les cellules humaines (Fig. 2b). Nous avons constaté que lorsque les PVC reciblés avec Pvc13 – Ad5-knob étaient chargés avec Cas9 (en utilisant une stratégie similaire à celle de la Fig. 1e), les particules résultantes produisaient des insertions et des suppressions ciblées (indels) dans les cellules HEK 293FT hébergeant un ARN guide. Cette expérience est remarquable car Cas9 est beaucoup plus grande que les charges utiles chargées nativement par ce PVC (170 kDa pour Pdp1-NTD-Cas9 contre 37 kDa pour Pdp1 et Pnf), démontrant que les PVC peuvent fournir diverses charges utiles de tailles variables (confirmant des conclusions similaires d'autres études3,22). Pour réaliser l'édition de gènes sans ARN guide avec des PVC, nous avons ensuite tenté de fournir des désaminases à doigts de zinc (ZFD), un système récemment décrit composé de domaines à doigts de zinc attachés à des désaminases fractionnées41. Lorsque les PVC reciblés avec le bouton Pvc13 – Ad5 ont été chargés avec le bras gauche ou droit d'un ZFD ciblant le locus TRAC humain (ZFD-L ou ZFD-R, respectivement) et ont été co-administrés à des cellules HEK 293FT, nous avons observé une substitution de base G à A sur la cible (Fig. 2c et données étendues Fig. 6g), indiquant que les PVC peuvent fournir des ZFD pour effectuer l'édition de base dans les cellules humaines. Enfin, inspirés par la fonction biologique endogène des PVC (élimination ciblée par délivrance de toxines), nous avons testé si les PVC pouvaient être utilisés pour tuer spécifiquement les cellules cancéreuses humaines. Nous avons constaté que les PVC chargés de toxines endogènes (Pdp1 et Pnf) produisaient une cytotoxicité efficace dans les cellules Jurkat lorsqu'ils étaient reciblés avec une DARPin spécifique d'un récepteur des lymphocytes T (CD4; Fig. 2d). Notamment cependant, les PVC ciblant un récepteur myéloïde non produit par les cellules Jurkat (CD11b) ont entraîné une mort cellulaire négligeable, ce qui suggère que la cytotoxicité médiée par le PVC dans les cellules cancéreuses humaines est spécifique au récepteur.

Une caractéristique notable des bactériophages est leur étroite spécificité de cible42. On pense que la spécificité de phage est conférée par des interactions de liaison hautement évoluées entre les fibres de queue de phage et les récepteurs affichés par les bactéries hôtes27,43. Bien que cela puisse rendre difficile le traitement des infections bactériennes par des phages, la spécificité est une caractéristique essentielle des thérapeutiques ciblées modernes et est essentielle pour le traitement du cancer et des maladies génétiques. Notre découverte que la spécificité du PVC est conférée par la fibre de la queue et que le tropisme du PVC peut être façonné via une modification rationnelle de cette protéine soulève la possibilité que les PVC (similaires aux phages) présentent également un degré élevé de spécificité de cible.

Pour étudier la spécificité de la cible du PVC, nous avons d'abord construit un panel de types de cellules artificielles dérivées de HEK 293FT présentant des récepteurs non natifs définis qui pourraient être facilement ciblés par des PVC modifiés (Figs. 3a, b). Pour plus de simplicité, nous avons choisi comme récepteurs un panel d'anticorps (scFvs et nanobodies) spécifiques aux étiquettes d'épitopes commerciales. Nous avons ensuite inséré le panel associé d'étiquettes d'épitopes dans le domaine de liaison distal de la fibre de queue (comme sur la figure 2a) et administré les PVC modifiés résultants à ces `` types de cellules '' pour comprendre l'efficacité avec laquelle les PVC subissent une sélection de cible. Nous avons constaté que les PVC reciblés avec des étiquettes d'épitopes n'étaient capables de délivrer efficacement des charges utiles que dans des cellules affichant les partenaires de liaison appropriés pour ces étiquettes d'épitopes (Fig. 3b). Ce résultat indique que la spécificité du PVC est largement conférée par l'interaction entre la fibre de queue et son récepteur cible, et que cette interaction peut être conçue pour permettre la reconnaissance spécifique de nouveaux types de cellules.

a,b, Test de spécificité pour les PVC basé sur des récepteurs artificiels. a, Schéma de l'expérience. Un panel d'étiquettes d'épitopes a été inséré dans le domaine de liaison distal de la fibre de queue (acides aminés 403 à 476 de Pvc13), et un panel des récepteurs associés (anticorps anti-étiquettes d'épitopes) a été affiché à la surface des cellules HEK 293FT. Comme dans les Fig. 1g et 2a, l'activité PVC a été mesurée en tant qu'expression de GFP après administration de Cre dans des cellules hébergeant loxP-GFP. b, Seuls les appariements corrects épitope-anticorps ont entraîné une administration efficace de Cre médiée par le PVC, ce qui indique que l'activité du PVC nécessite une interaction spécifique entre la fibre de queue et la cellule cible. Barre d'échelle, 500 μm. c, Essai de spécificité pour les PVC basé sur un récepteur endogène. À droite, les PVC chargés de Pdp1 et Pnf ont été redirigés vers l'EGFR humain (avec Pvc13 – E01-DARPin, comme sur la Fig. 2a) et administrés aux lignées cellulaires EGFR + (A431 et A549) et EGFR− (Jurkat et 3T3). La cytotoxicité n'a été observée que dans les lignées cellulaires EGFR + et uniquement lorsque Pvc13 contenait la DARPin anti-EGFR. Aucune cytotoxicité n'a été observée avec les PVC hébergeant Pvc13 tronqué dépourvu de domaine de liaison (acides aminés 403 à 476) (à gauche). d, L'affichage d'un récepteur cible est suffisant pour sensibiliser les cellules aux PVC. Une lignée cellulaire (3T3) immunisée contre l'administration de PVC (c) a été transfectée avec un plasmide contenant de l'EGFR humain et a été exposée à des PVC ciblant l'EGFR ; cette fois, les cellules ont présenté une perte de viabilité. Les données sont moyennes (b,c) ou moyennes ± sd (d) avec n = 2 (b,c) ou n = 3 (d) réplicats biologiques ; ANOVA bidirectionnelle avec test post hoc de Bonferroni. NS, non significatif.

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Nous avons ensuite évalué la spécificité du PVC vis-à-vis de l'EGFR, un récepteur naturel présent de manière endogène sur certains types de cellules humaines (Fig. 3c). Dans cette expérience, nous avons testé si un PVC programmé pour cibler l'EGFR cible spécifiquement les cellules connues pour exprimer l'EGFR. Nous avons constaté que les PVC reciblés avec une DARPin anti-EGFR (E01) et chargés de toxines (Pdp1 et Pnf) n'étaient capables de tuer efficacement que les lignées cellulaires EGFR+ (A549 et A431) et non les lignées cellulaires EGFR− (Jurkat et 3T3). De plus, nous avons constaté que la transfection d'EGFR dans une lignée cellulaire EGFR− de l'expérience précédente (3T3) sensibilise ces cellules à ce PVC (Fig. 3d), indiquant que la présence d'un récepteur cible approprié est suffisante pour permettre la délivrance médiée par le PVC. Ces résultats, en plus du test de spécificité avec les récepteurs artificiels de la Fig. 3a, b, prouvent que les PVC présentent un degré élevé de spécificité de cible et ne peuvent délivrer efficacement des charges utiles que dans des cellules affichant un récepteur cible approprié.

Pour comprendre si les PVC pourraient éventuellement être utilisés chez l'homme, nous avons ensuite tenté de délivrer des protéines à une souris vivante. Pour produire des variantes de PVC qui ciblent les cellules de souris, nous avons de nouveau utilisé l'ingénierie guidée par AlphaFold de Pvc13 (Fig. 4a). Nous avons criblé deux nouveaux domaines de liaison : (1) un domaine de bouton Ad5 modifié (Ad5-knob(RGD/PK7)) qui était auparavant utilisé44 pour étendre la gamme d'hôtes d'Ad5 aux tissus de souris, et (2) un nanocorps ciblant un récepteur de souris45 (MHC classe II). Après avoir équipé Pvc13 de ces nouveaux domaines de liaison, les PVC résultants ont produit une activité considérablement améliorée dans les lignées cellulaires de souris et les cellules primaires (Fig. 4b). Notamment, nous avons observé que bien que les PVC reciblés avec Ad5-knob (RGD/PK7) aient montré un large tropisme (comme c'est le cas pour les virus Ad5 RGD/PK744), les PVC ciblant le CMH de classe II ont montré une forte préférence pour les cellules immunitaires du CMH+, fournissant une preuve supplémentaire que l'activité du PVC dépend de la présence d'un récepteur cible approprié.

a, Structures prédites par AlphaFold de nouvelles conceptions Pvc13 (fibre de queue) ciblant la souris. Nous avons remplacé le domaine de liaison de type sauvage de Pvc13 par une variante de tropisme élargi du domaine de liaison Ad5 (Ad5-knob(RGD/PK7)) ou un nanocorps (Nb) ciblant la protéine MHC de classe II de souris (MHCII). b, les nouvelles conceptions de PVC ciblant la souris présentent une activité accrue dans les lignées cellulaires de souris et les cellules primaires. Des PVC déficients pour la protéine de pointe de pointe (Pvc10) ont été utilisés comme témoins négatifs pour les deux nouvelles conceptions de Pvc13. c, à gauche, schéma montrant l'apport de protéines dans le cerveau de la souris avec des PVC. À droite, les PVC équipés du bouton Pvc13–Ad5 (RGD/PK7) produisent un signal tdTomato dans l'hippocampe des souris Ai9 (loxP-tdTomato). La fluorescence a été abolie lorsque la protéine de pointe de pointe (Pvc10) a été supprimée, confirmant que l'activité observée était médiée par le PVC. Les sites d'injection sont indiqués par des flèches blanches. Barres d'échelle, 500 μm. d, les PVC ciblent les neurones in vivo. Des injections intracrâniennes ont été réalisées comme en c et des extraits unicellulaires de cerveaux traités ont été analysés par cytométrie en flux. Le schéma de déclenchement de la cytométrie en flux est illustré dans les données étendues de la figure 8a. MFI, intensité moyenne de fluorescence. e, Les injections intracrâniennes de PVC n'induisent pas la migration des cellules immunitaires vers le SNC. Le schéma de déclenchement de la cytométrie en flux est illustré dans les données étendues Fig. 8d. f, les PVC sont transitoires dans le cerveau de la souris. Les particules intactes peuvent être facilement purifiées à partir de cerveaux de souris traités après 0 ou 1 jour, mais pas après 7 jours, ce qui indique que les PVC ne persistent pas dans les tissus cérébraux pendant de longues périodes. Barre d'échelle, 500 nm. Les données sont moyennes (b) ou moyennes ± sd (d,e) avec n = 2 (b) ou n = 3 (d,e) répétitions biologiques ; ANOVA bidirectionnelle avec test post hoc de Bonferroni (d, e).

Données source

Après avoir identifié de nouvelles conceptions de PVC capables de cibler les cellules de souris, nous avons ensuite tenté de réaliser la livraison de protéines in vivo. Nous avons chargé Cre dans des PVC hébergeant Pvc13 – Ad5-knob (RGD / PK7) et effectué des injections intracrâniennes avec les particules résultantes chez des souris reporters loxP-tdTomato. Nous avons également injecté à des souris séparées des PVC similaires dépourvus de pointe de pointe (Pvc10), une protéine que nous avons jugée nécessaire pour l'administration par PVC in vitro (Fig. 4b); nous avons choisi cette conception comme contrôle négatif pour les expériences in vivo car les PVC Δpvc10 forment toujours des particules intactes et des charges utiles (données étendues Fig. 7a – c) et se sont avérés produire moins d'activité non spécifique dans les macrophages que les PVC Δpvc13 (données étendues Fig. 7d, e). Après des injections intracrâniennes avec les particules Pvc13 – Ad5-knob (RGD / PK7), nous avons observé l'expression de tdTomato médiée par Cre dans l'hippocampe (Fig. 4c), indiquant que les PVC sont actifs in vivo. De plus, nous avons extrait des suspensions unicellulaires de cerveaux traités et quantifié le signal tdTomato dans les neurones et la microglie par cytométrie en flux (Fig. 4d et Extended Data Fig. 8a, b); nous avons trouvé un enrichissement significatif du signal tdTomato dans les neurones (mais pas dans la microglie), indiquant que les PVC hébergeant Pvc13 – Ad5-knob (RGD / PK7) peuvent cibler les neurones in vivo (nous avons confirmé ce résultat in vitro contre les neurones primaires; Extended Data Fig. 8c). Nous avons également constaté que le traitement au PVC ne produisait aucune activation significative des cellules immunitaires (Fig. 4e et données étendues Fig. 8d), production de cytokines inflammatoires (données étendues Fig. 8e), perte de poids corporel (données étendues Fig. 8f) ou toxicité cellulaire (données étendues Fig. 8g), indiquant que le traitement au PVC n'était ni immunogène ni toxique au cours de cette période expérimentale. Enfin, nous avons également constaté que les PVC intacts pouvaient être facilement purifiés à partir de cerveaux traités à t = 0 ou 1 jour mais pas après t = 7 jours (Fig. 4f), ce qui indique que les PVC sont transitoires dans le cerveau et ne persistent pas pendant de longues périodes de temps ; cela suggère que ce système est parfaitement adapté aux thérapies censées être temporaires ou de courte durée. Ensemble, ces résultats démontrent que les PVC peuvent délivrer des protéines in vivo, ce qui suggère que ce système est bien positionné pour une utilisation éventuelle comme outil de délivrance à usage humain.

En résumé, nous avons démontré qu'un eCIS (PVCpnf) est un dispositif d'administration de protéines programmable qui peut être modifié à la fois pour charger des charges utiles non natives (Fig. 1e, g) et pour cibler de nouveaux organismes (Figs. 2a et 4b et Extended Data Figs. 5, 6, 9 et 10). Nos études sur l'élément de ciblage du PVC (pvc13; fibre de queue) ont en outre montré que les PVC sont hautement spécifiques à la cible et que l'activité du PVC dépend de la liaison réussie de la fibre de queue avec un récepteur sur la cellule cible (Figs. 2a, d et 3b – d et Données étendues Figs. 5d et 6e, f). Enfin, nous avons démontré l'application des PVC comme outils d'administration dans divers contextes, tels que la destruction spécifique des cellules cancéreuses ou comme médiateurs de l'édition du génome (Fig. 2a – d), et nous avons montré que le système fonctionne comme prévu dans les cellules d'insectes (Fig. 1f, g), les cellules humaines (Fig. 2 et 3), les cellules primaires (Fig. 4b et Extended Data Fig. 8c) et chez les souris vivantes (Fig. 4c, d et Extended Data Fig. 8b). Ensemble, ces travaux constituent le développement d'une classe polyvalente d'outils de livraison de protéines programmables qui sont bien adaptés pour une utilisation dans une variété d'applications allant du biocontrôle à la thérapie génique humaine.

La région structurelle et accessoire PVCpnf (pvc1-16) et la région de charge utile et de régulation (Pdp1, Pnf et gènes régulateurs PAU_RS16570-RS24015) ont été synthétisées de novo (GenScript) et clonées dans les squelettes pAWP78 et pBR322, respectivement. Toutes les manipulations impliquant la charge utile et les plasmides régulateurs (pPayload) impliquaient une amplification PCR standard avec Phusion Flash 2x Master Mix (ThermoFisher), un assemblage avec Gibson Assembly Master Mix (NEB E2611L) ou Golden Gate Assembly avec AarI et T4 DNA Ligase (ThermoFisher ER1582 ; NEB M0202) et transformation en cellules Stbl3 chimiquement compétentes. Les plasmides PVC structuraux et accessoires (pPVC) ont été amplifiés avec l'ADN polymérase KOD Xtreme Hot Start (Sigma-Aldrich 71975) avec plusieurs modifications du protocole du fabricant : 100 ng d'ADN matrice, 16 cycles et 30 min de temps d'extension. Ces plasmides ont ensuite été assemblés à l'aide de Gibson Assembly Master Mix avec des périodes d'incubation de 2 à 4 h à 50 ° C et électroporés dans des cellules électrocompétentes EPI300 (Lucigen EC300110). Un résumé des plasmides générés au cours de ce travail se trouve dans le tableau supplémentaire 7 ; les séquences plasmidiques annotées peuvent être trouvées dans les données supplémentaires 1.

Pour chaque condition de PVC, une variante de pPVC et de pPayload ont été électroporées dans des cellules EPI300 et les particules de PVC ont été purifiées à l'aide d'une version modifiée d'une méthode utilisée précédemment9. Les colonies ont été inoculées dans 2 ml de Terrific Broth (US Biological T2810) et secouées à 37 ° C pendant 16 h avant d'être inoculées (à 1: 1 000) dans 500 ml de milieu TB et secouées à 30 ° C pendant 24 h supplémentaires. Les cultures ont ensuite été centrifugées pendant 30 min à 4 000 g et remises en suspension dans 28 ml de tampon de lyse (Tris-HCl 25 mM pH 7,5 (ThermoFisher 15567027), NaCl 140 mM (AmericanBio AB01915), KCl 3 mM (Sigma-Aldrich P9541), MgCl2 5 mM (Sigma-Aldrich M4880), 200 μg ml-1 lysozyme (ThermoFisher 89833), 50 μg ml-1 DNase I (Sigma-Aldrich DN25), 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich 93443) et 1 × Protease Inhibitor Cocktail (MedChem Express HY-K0010)) et ont ensuite été secoués à 37 ° C pendant 90 min pour favoriser la lyse. Les lysats ont ensuite été granulés à 4 000 g pendant 30 min à 4 ° C pour éliminer le lysat cellulaire en vrac. Les surnageants ont ensuite été extraits et centrifugés dans une ultracentrifugeuse à 120 000 g pendant 2 h à 4 ° C pour sédimenter les complexes de protéines PVC. Les culots ont été remis en suspension dans 1 ml de PBS (Life Technologies 10010049) et centrifugés à 16 000 g pendant 15 min à 4 ° C pour éliminer le lysat solide résiduel. Les surnageants ont ensuite été appliqués sur 28 ml de PBS froid avant de répéter l'essorage de l'ultracentrifugeuse (120 000 g pendant 2 h) et l'essorage de clarification (16 000 g pendant 15 min) encore 2 fois. Les pastilles finales ont été remises en suspension dans 50 ul de PBS et le rendement en PVC a été quantifié par la mesure A280 sur un instrument NanoDrop (ThermoFisher). Pour les expériences sur la souris, le lipopolysaccharide a ensuite été retiré des échantillons de PVC finaux à l'aide d'une méthode à base de détergent46 ; en bref, les échantillons ont été dilués dans 1 ml de PBS froid et 20 ul de Triton X-114 (Sigma-Aldrich X-114) ont été ajoutés. Les échantillons ont ensuite été incubés à 4 ° C dans un tourne-tube pendant 30 min, transférés à 37 ° C pendant 10 min pour permettre au détergent de sortir de la solution, et centrifugés à 20 000 g pendant 20 min à 37 ° C pour séparer les phases protéique et détergente. La phase supérieure (contenant la protéine) a été extraite et la procédure a été répétée 2 fois de plus (c'est-à-dire que le Triton X-114 a été ajouté 3 fois au total) et la phase protéique finale a été incubée avec 300 mg de Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad 1523920) à 4 °C dans un tourne-tube pendant la nuit. Des échantillons de protéines ont ensuite été extraits des billes, passés à travers un filtre stérile de 0,2 μm (Pall 4612) et concentrés jusqu'à 50 μl de PBS avec une centrifugation finale par ultracentrifugeuse ; les niveaux d'endotoxines ont ensuite été quantifiés à l'aide d'un kit Pierce Chromogenic Endotoxin Quant (ThermoFisher A39552). Tous les échantillons de PVC ont été stockés dans du PBS à 4 ° C pendant un maximum de 1 semaine avant utilisation.

Pour déterminer si les charges utiles PVC endogènes (Pdp1 et Pnf) produisaient une cytotoxicité indépendante du complexe PVC, nous avons purifié chacune de ces protéines de manière isolée. Chaque charge utile a été marquée avec une étiquette d'affinité et de solubilité (6 × His – Strep – SUMO) et a été transformée dans des cellules compétentes E. coli BL21 (DE3) (Sigma-Aldrich CMC0016). Les colonies ont été inoculées dans 5 ml de milieu TB et secouées à 37 ° C pendant 16 h avant d'être inoculées (à 1: 200) dans 1 l de TB supplémentaire. Ces cultures ont ensuite été secouées à 37 ° C jusqu'à ce qu'elles atteignent un A600 de 0, 6 à 0, 8, après quoi elles ont été induites avec 0, 5 mM d'IPTG (Goldbio I2481C) et secouées à 37 ° C pendant 4 h supplémentaires. Les cultures ont ensuite été centrifugées à 4 000 g pendant 30 min et remises en suspension dans 50 ml de tampon de lyse froid (Tris-HCl 50 mM pH 7,5 (ThermoFisher 15567027), NaCl 280 mM (AmericanBio AB01915), KCl 3 mM (Sigma-Aldrich P9541), MgCl2 5 mM (Sigma-Aldrich M4880 ), 1 µl de benzonase (Sigma-Aldrich E1014) pour 50 ml de tampon et 1 comprimé cOmplete (Sigma-Aldrich 11836170001) pour 50 ml de tampon) ; les cellules remises en suspension ont été agitées pendant 30 min pour assurer un mélange homogène, puis ont été passées deux fois à travers un microfluidiseur Microfluidics M110P. Les lysats ont ensuite été centrifugés à 9 000 g pendant 30 min à 4 ° C et les surnageants ont été appliqués à 2, 5 ml d'une suspension à 50% (dans un tampon de lyse) de résine Strep-Tactin Superflow Plus (Qiagen 30004) et agités à 4 ° C pendant 30 min. La résine a ensuite été granulée à 2 000 g pendant 3 min à 4 ° C, lavée deux fois avec 40 ml de tampon de lyse et enfin appliquée sur une colonne (ThermoFisher 29922) et laissée s'égoutter. Avec la colonne coiffée, nous avons ensuite ajouté 12,5 ml de tampon d'élution à froid (25 mM Tris-HCl pH 7,5 (ThermoFisher 15567027), 140 mM NaCl (AmericanBio AB01915), 3 mM KCl (Sigma-Aldrich P9541), 5 mM MgCl2 (Sigma-Aldrich M4880) et 100 µl par colonne de SU MO protéase (un cadeau de J. Strecker)) et incubé la colonne pendant une nuit à 4 ° C pour libérer la protéine de la résine. La protéine purifiée a ensuite été concentrée à l'aide d'un filtre Amicon Ultra de 10 kDa (Sigma-Aldrich UFC901024), quantifiée par mesure A280 sur un instrument NanoDrop (ThermoFisher) et vérifiée pour une expression et une purification appropriées par SDS – PAGE suivi d'une coloration de Coomassie. Des versions brutes et non recadrées de tous les gels de protéines peuvent être trouvées dans la Fig. 1 supplémentaire.

Pour déterminer si une protéine était chargée dans des PVC, nous avons exploité la tendance de notre procédure de purification de PVC à purifier préférentiellement les complexes de poids moléculaire élevé par rapport aux protéines libres (Extended Data Fig. 3a). Les protéines de charge utile (clonées dans pPayload) ont été marquées avec des étiquettes HiBiT C-terminales et les particules de PVC contenant les charges utiles marquées ont été purifiées. La plaque de base du PVC (codée par pvc12) a également été étiquetée avec HiBiT pour servir de contrôle de chargement pour le western blot. Vingt microgrammes des PVC résultants (contenant des charges utiles chargées) ont ensuite été mélangés avec le tampon d'échantillon NuPAGE LDS (ThermoFisher NP0008) et l'agent réducteur d'échantillon NuPAGE (ThermoFisher NP0009), tous deux à une concentration finale de 1 ×, et ont ensuite été bouillis à 95 ° C pendant 10 min. Les échantillons de charge utile en PVC dénaturés ont ensuite été exécutés sur des gels de protéines NuPAGE Bis-Tris 1–12% (ThermoFisher NP0321) pendant 30 min à 200 V dans un tampon 1 × MOPS (ThermoFisher NP000102) et ont été transférés sur des membranes PVDF à l'aide d'un instrument iBlot 2 (ThermoFisher). Pour visualiser les charges utiles de faible poids moléculaire (comme cela a été fait dans Extended Data Fig. 3c, d), nous avons plutôt analysé les échantillons de protéines dénaturées sur des gels de protéines NuPAGE Bis-Tris à 12% (ThermoFisher NP0342) dans un tampon 1 × MES (ThermoFisher B0002). Enfin, les bandes de charge utile ont été visualisées à l'aide du système de transfert Nano-Glo HiBiT (Promega N2410) et les images ont été capturées avec un instrument Bio-Rad ChemiDoc. Une séquence d'acides aminés représentative d'une protéine non native chargée via un domaine d'emballage en PVC peut être trouvée dans le tableau supplémentaire 5.

Une liste des lignées cellulaires utilisées dans cette étude se trouve dans le tableau supplémentaire 8. Les lignées cellulaires n'ont pas été authentifiées ni testées pour Mycoplasma avant utilisation car elles ont été principalement obtenues auprès de sources commerciales. Sauf indication contraire, les cellules de mammifères ont été maintenues dans des flacons T75 (ThermoFisher 156499) à 37 °C avec 5 % de CO2 dans du DMEM-GlutaMAX (ThermoFisher 10569044) ou du RPMI-GlutaMAX (ThermoFisher 61870127), et les cellules d'insectes ont été doucement secouées dans des flacons agitateurs de 125 ml (Sigma-Aldrich CLS431 143) à 28 °C dans ESF921 (VWR 100000-000). Tous les milieux ont été complétés avec 10 µg ml-1 de gentamicine (Sigma-Aldrich G1397) et 1 × pénicilline-streptomycine (ThermoFisher 15140122) ; des milieux de mammifères ont également été complétés avec 10 % de FBS (VWR 97068-085). Pour la croissance des splénocytes primaires, le milieu a également été additionné d'IL-2 de souris (Peprotech 212-12) et de 2-mercaptoéthanol 50 µM (ThermoFisher 21985023).

Pour détecter la délivrance de protéines médiée par le PVC in vitro, les cellules cibles ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à fond transparent à 96 puits (VWR 89091-012) et laissées croître jusqu'à environ 80 % de confluence. Les PVC ont ensuite été ajoutés à une concentration finale de 150 ng µl-1 dans 50 µl de milieu de culture cellulaire par puits. Pour les tests impliquant la co-transfection d'un plasmide rapporteur Cre ou d'un plasmide ARN guide, l'ADN a été transfecté immédiatement après l'ajout de PVC à l'aide du réactif de transfection GeneJuice (Sigma-Aldrich 70967) pour les cellules humaines ou du réactif de transfection Insect GeneJuice (Sigma-Aldrich 71259) pour les cellules Sf9. Pour les essais impliquant la transfection d'un récepteur cible (par exemple, l'EGFR ou les anticorps anti-étiquette anti-épitope affichés en surface sur la figure 3), cela a été effectué 24 h avant l'ajout de PVC. Pour les expériences d'administration de toxines, la cytotoxicité a été évaluée à l'aide du test de viabilité cellulaire CellTiter-Glo 2.0 (Promega G9241) et/ou d'une coloration avec un colorant de viabilité (8 ng µl-1 FDA (Sigma-Aldrich F7378) + 20 ng µl-1 PI (Sigma-Aldrich P4170)) et imagerie sous un microscope Zeiss Observer D1 ; ces analyses ont été réalisées à t = 24 h pour les cellules de mammifères et t = 2 jours (CellTiter-Glo)/4 jours (coloration FDA/PI et imagerie) pour les cellules Sf9. Pour les tests CellTiter-Glo, tous les puits présentant une luminescence plus élevée que le puits témoin (PBS) se sont vu attribuer une valeur de cytotoxicité de 0 % pour éviter une cytotoxicité négative. Pour les tests impliquant l'expression de la GFP induite par Cre, les cellules ont été incubées pendant quatre jours, puis imagées avec un microscope confocal Leica DMi8 et analysées par cytométrie en flux (voir « Analyse par cytométrie en flux pour les expériences PVC in vitro »). Pour les expériences d'édition de gènes, les cellules ont été incubées pendant 4 jours, l'ADN génomique a été extrait avec 50 µl de solution d'extraction d'ADN QuickExtract (Lucigen QE09050) et les indels ou substitutions de bases ont été quantifiés avec NGS (voir « Séquençage en profondeur »). Toutes les données numériques des expériences PVC ont été tracées avec Prism (9.3.1) et les figures ont été assemblées graphiquement dans Adobe Illustrator (25.2.3).

Pour prédire la structure de nouvelles conceptions de fibre de queue en PVC, nous avons utilisé ColabFold, une implémentation d'AlphaFold basée sur Google Colab235,36,37. Pour toutes les conceptions de fibre de queue, les séquences ont été interrogées en tant que trimères dans AlphaFold2_mmseqs2 (v1.2) avec les paramètres de modèle/MSA par défaut et num_recycles défini sur 12. Les exécutions étaient prises en charge par les machines virtuelles Google Cloud exécutant les GPU NVIDIA Tesla A100. Les structures résultantes ont été visualisées et recolorées avec PyMOL (2.5.2).

Une analyse TEM de routine à coloration négative de particules de PVC purifiées a été effectuée soit au Koch Institute Nanotechnology Materials Core Facility, soit au MIT Materials Research Laboratory. En bref, 5 à 10 µl de chaque échantillon de PVC (dilué à 100–500 ng µl−1) ont été appliqués sur une grille TEM en cuivre revêtue de carbone de 200 mesh à décharge luminescente (VWR 100489-722) pendant 60 s avant d'éliminer l'excès de liquide avec un Kimwipe. Les grilles ont ensuite été traitées deux fois avec 10 µl de colorant à l'acétate d'uranyle à 2 % (en tamponnant le premier immédiatement et le second après 30 s) ou 5 fois traitées avec un colorant au formiate d'uranyle à 2 % (en incubant sous agitation douce pendant 5 s, 5 s, 10 s, 30 s et 30 s) et laissées sécher à température ambiante. Les grilles ont ensuite été imagées dans un (1) microscope JEOL 2100 FEG à 200 kV équipé d'une caméra Gatan 2k × 2k UltraScan CCD, ou un (2) microscope FEI Tecnai (G2 Spirit TWIN) à 120 kV équipé d'une caméra Gatan Orius SC1000B.

Pour déterminer si les particules de PVC se lient aux cellules cibles, nous avons utilisé une méthode TEM à coloration négative modifiée. Les cellules A549 ont été autorisées à adhérer à haute densité sur des grilles TEM en or recouvertes de carbone de 200 mesh (VWR 76499-704) dans des plaques à 24 puits avant d'être exposées à une forte dose d'échantillon de PVC (1,8 µg µl −1 concentration finale) pendant 3 h. Les cellules ont ensuite été fixées pendant 10 min avec du paraformaldéhyde à 4 % (Electron Microscopy Sciences 1574), lavées une fois avec du PBS, colorées 5 fois avec du formiate d'uranyle à 2 % (via la même méthode que ci-dessus) et laissées sécher à température ambiante. Les cellules ont ensuite été imagées avec un microscope FEI Tecnai (G2 Spirit TWIN) à 120 kV équipé d'une caméra Gatan Orius SC1000B.

L'imagerie à haute résolution de cellules humaines traitées au PVC a été réalisée à l'aide de la microscopie électronique à balayage (MEB). Les cellules A549 ont été cultivées à 80–90 % de confluence sur des lamelles en verre de 12 mm (VWR 354087) dans des plaques à 24 puits avant d'être exposées à une dose modérée d'échantillon de PVC (500 ng µl−1) pendant 3 h. Les cellules ont ensuite été fixées pendant 1 h avec 2,5 % de glutaraldéhyde/2 % de paraformaldéhyde/100 mM de cacodylate de sodium à 4 °C, rincées deux fois avec du cacodylate de sodium 100 mM (chacun pendant 5 min à 4 °C), traitées avec 1 % de tétroxyde d'osmium/cacodylate de sodium pendant 30 min à 4 °C, rincées 3 à 4 fois (10 min chacune) avec de l'eau distillée, déshydratées avec de l'éthanol , traité avec 50 % TMS/50 % éthanol pendant 15 min, traité avec 80 % TMS/20 % éthanol pendant 15 min, traité deux fois avec 100 % TMS pendant 5 min chacun, et laissé sécher à l'air avant le revêtement par pulvérisation cathodique et l'imagerie dans un Zeiss Crossbeam 540 SEM/faisceau ionique focalisé.

Pour déterminer si les particules de PVC se lient aux cellules cibles, nous avons marqué une protéine PVC externe (Pvc2) avec une étiquette drapeau N-terminale et exposé les particules de PVC résultantes (à 300 ng µl-1) aux cellules cibles pendant 3 h à 37 ° C. Les cellules ont ensuite été fixées pendant 10 min avec du paraformaldéhyde 4 % (Electron Microscopy Sciences 1574), bloquées pendant 1 h avec du tampon de blocage (sérum de chèvre 10 % (Sigma-Aldrich G9023) et 0,1 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich 93443) dilué dans du PBS), colorées pendant 1 h avec l'anticorps anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich F1804 ; dilué 1 : 500 dans un tampon de blocage), coloré pendant 1 h avec un anticorps secondaire conjugué Alexa Fluor 488 (ThermoFisher A11001 ; dilué à 1:1 000 dans un tampon de blocage), coloré pendant 10 min avec 1 µg ml-1 DAPI (ThermoFisher D1306 ; dilué dans du PBS) et imagé à l'aide d'un microscope confocal Leica DMi8. Une séquence d'acides aminés illustrant la position de l'étiquette Flag sur Pvc2 peut être trouvée dans le tableau supplémentaire 6.

Nous avons également utilisé l'immunofluorescence pour examiner l'effet des PVC sur le cytosquelette (Extended Data Fig. 6a). Les cellules cibles ont d'abord été ensemencées dans des plaques à 96 puits et laissées croître jusqu'à environ 80 % de confluence avant d'être exposées aux PVC (concentration finale de 150 ng µl-1) pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été fixées pendant 10 min avec du paraformaldéhyde à 4%, bloquées pendant 1 h avec un tampon de blocage, colorées pendant 1 h avec de la rhodamine phalloïdine (ThermoFisher R415; diluée à 1 × concentration finale dans un tampon de blocage), colorées pendant 10 min avec 1 µg ml-1 DAPI (ThermoFisher D1306; dilué dans du PBS) et imagées à l'aide d'un microscope confocal Leica DMi8.

Pour les expériences impliquant la livraison de Cre médiée par le PVC, nous avons mesuré l'efficacité de la livraison à l'aide de la cytométrie en flux. Les cellules ont d'abord été récoltées par incubation avec le réactif de dissociation TrypLE Express (ThermoFisher 12604), culottées à 300 g pendant 3 min et remises en suspension dans 100 µl de tampon de cytométrie en flux (PBS additionné de 2 % d'EDTA (Life Technologies 15575020) et de 5 % de FBS (VWR 97068-085)). Les échantillons ont été analysés sur un cytomètre en flux Beckman Coulter Cytoflex S et l'analyse a été effectuée à l'aide de CytExpert (2.3.1.22) et FlowJo (10.8.2). Un schéma représentatif pour le déclenchement et le réglage du seuil est illustré dans les données étendues Fig. 4c.

Pour détecter les modifications génomiques induites par le PVC dans les cellules cibles, nous avons d'abord amplifié la région cible de chaque extrait d'ADN génomique (voir « Expériences d'administration de PVC in vitro ») avec NEBNext High-Fidelity 2× PCR Master Mix (NEB M0541). Les régions cibles ont ensuite été codées à barres avec des amorces Illumina P5 et P7 NGS indexées. Les bibliothèques ont été purifiées avec un kit de purification PCR Qiagen (Qiagen 28104), quantifiées sur un instrument NanoDrop (ThermoFisher) et séquencées sur un instrument Illumina MiSeq (avec une longueur de lecture fixée à 300 bp). Les indels et les substitutions de bases ont ensuite été quantifiés avec Geneious Prime (2020.0.5). Les amorces utilisées pour le séquençage en profondeur se trouvent dans le tableau supplémentaire 9.

Pour évaluer l'effet des gènes régulateurs sur l'expression des gènes PVC, nous avons utilisé la PCR quantitative de transcription inverse (RT-qPCR). Les cellules E. coli EPI300 ont été soumises à une électroporation avec une variante de pPVC et de pPayload (comme décrit dans 'PVC purification') et les colonies ont été secouées dans 5 ml de TB à 37 ° C pendant 16 h. Les cultures ont ensuite été centrifugées pendant 5 min à 4 000 g, remises en suspension dans 750 µl de réactif TRI (Zymo R2073), incubées à température ambiante pendant 5 min et lysées mécaniquement par vortex (1 min) avec 250 µl de billes de zircone de 0,5 mm (Fisher NC0450473). Nous avons ensuite ajouté 200 µl de chloroforme, incubé à température ambiante pendant 3 min, centrifugé pendant 15 min à 12 000 g (4 ° C) et extrait la phase aqueuse pour l'extraction de l'ARN via un kit Zymo Direct-zol RNA Miniprep (Zymo R2073) avec l'étape facultative DNAse. Nous avons ensuite généré de l'ADNc à partir de ces extraits d'ARN en vrac à l'aide de la transcriptase inverse ProtoScript II (NEB M0368) et d'amorces aléatoires (NEB S1330) avec le protocole du fabricant. Enfin, nous avons effectué une qPCR sur les ADNc résultants en utilisant Fast SYBR Green Master Mix (ThermoFisher 4385612) dans un instrument Bio-Rad CFX Opus 384 qPCR. Les valeurs delta-delta Ct ont été calculées par rapport au gène de ménage gapA47. Les amorces utilisées pour la qPCR se trouvent dans le tableau supplémentaire 10.

Les PVC ont été dilués à environ 36 μg µl−1 dans du PBS avant d'être envoyés au Koch Institute Biopolymers and Proteomics Facility pour analyse par spectrométrie de masse. En bref, les protéines ont été réduites avec du dithiothréitol 10 mM (Sigma-Aldrich 11583786001) pendant 10 min à 95 ° C, puis alkylées avec de l'iodoacétamide 20 mM (Sigma-Aldrich I5161) pendant 30 min à 25 ° C dans l'obscurité. Les protéines ont ensuite été digérées avec de la trypsine sur des microcolonnes S-Trap (ProtiFi C02-micro-80) selon le protocole du fabricant. Les peptides tryptiques ont été séparés par HPLC en phase inverse (Thermo UltiMate 3000) à l'aide d'une colonne PepMap RSLC C18 et d'une pointe EASY-Spray de 2 μm (ThermoFisher ES903) sur un gradient de 90 min avant d'être soumis à une nano-électrospray à l'aide d'un spectromètre de masse Exploris (Thermo). Les hits de peptide cartographiés qui en résultent peuvent être trouvés dans les données supplémentaires 2.

Toutes les expériences sur les souris étaient conformes aux directives établies par les National Institutes of Health et ont été menées selon des protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) du Broad Institute du MIT et de Harvard. Les animaux ont été choisis au hasard pour un traitement avec des conditions témoins ou expérimentales sans insu. Des souris Ai9 femelles (âgées de 8 à 12 semaines) ont été obtenues auprès du Jackson Laboratory (souche 007909). Toutes les souris ont été maintenues sur un cycle lumière: obscurité de 12 h avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les souris ont été anesthésiées à l'aide d'isoflurane (2 à 3 %) et préparées pour la chirurgie stéréotaxique ; la fourrure a été rasée et les souris ont été placées dans un cadre stéréotaxique (Kopf Instruments). Un coussin chauffant a été placé sous les souris pour éviter l'hypothermie. L'isoflurane (1 à 2 %) a été délivré via un cône nasal tout au long de la chirurgie. Une pommade ophtalmique a été utilisée pour protéger les yeux. La buprénorphine -SR (1 mg kg−1, sous-cutanée) a été administrée avant le début de la chirurgie. La bupivacaïne (1 mg kg-1) a été injectée par voie intradermique le long de la ligne d'incision comme une forme d'anesthésique local. Le méloxicam (2 mg kg−1) a également été administré par voie sous-cutanée avant la chirurgie. Le cuir chevelu a été désinfecté avec un gommage à la bétadine et de l'éthanol à 70 %. Une incision a été faite à l'aide d'un scalpel le long de la ligne médiane du cuir chevelu. Le crâne exposé a été soigneusement nettoyé et une craniotomie a été pratiquée au-dessus de l'hippocampe. Les protéines PVC ont été ciblées sur l'hippocampe (-2,3 AP, 1,25 ML, -3 et -1,5 DV) et injectées lentement sous pression (100 nl min-1) à l'aide d'une seringue Hamilton de 10 µl (700 Series Microliter Syringes, Hamilton, Model 701 N Syringe) et d'un contrôleur de pompe à micro-seringue (Micro 4; WPI). Après injection, l'aiguille a été laissée en place pendant 2 min puis retirée lentement. Un total de 1 000 nl (Fig. 4c ; 500 nl à -2,0 DV et 500 nl à -1,5 DV) à 7,5 µg µl-1 ou 3 000 nl (Fig. 4d–f et données étendues Fig. 8b,e,f ; 1 500 nl à -3,0 DV et 1 500 nl à -1,5 DV) à 1 0,2 µg µl-1 d'échantillon de PVC a été injecté par souris. Après l'injection, la peau a été scellée avec un motif de suture simple et continu avec des sutures en nylon Ethilon 4-0. Les incisions ont été nettoyées avec une solution saline stérile à 0,9 % et des applicateurs à pointe de coton stérile. Les souris ont été hydratées après l'opération avec une solution saline et logées dans un environnement à température contrôlée jusqu'à l'obtention d'une récupération ambulatoire. Pour soulager la douleur post-opératoire, le méloxicam (2 mg kg −1) a été administré par voie sous-cutanée toutes les 24 h jusqu'à un minimum de 72 h post-opératoire.

À t = 12 jours post-injection, les souris ont été profondément anesthésiées avec Fatal-Plus à une dose de 90 mg kg-1 et perfusées par voie transcardiaque avec 20 ml de PBS, suivis de 20 ml de solution de paraformaldéhyde à 4 %. Les cerveaux ont été rapidement extraits et stockés dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % à 4 ° C pendant 24 h, puis transférés dans une solution de saccharose à 30 % dans du PBS et laissés s'équilibrer pendant 2 jours. Les cerveaux ont ensuite été montés sur un cryostat en utilisant l'OCT et sectionnés coronairement (50 µm). Les sections flottantes ont été lavées dans du PBS et colorées pour les neurones à l'aide d'un anticorps anti-NeuN (Sigma-Aldrich MAB377; 1: 500) et d'un anticorps secondaire Alexa 488 (ThermoFisher A11001; 1: 1 000). Les coupes ont été montées sur des lames avec du PVA-DABCO. Les images ont été acquises à l'aide d'un microscope confocal Leica DMi8 avec un objectif à air 10 × et 20 ×.

Les animaux ont été profondément anesthésiés après t = 1, 3 et 7 jours avec du CO2 et perfusés par voie transcardiaque avec 20 ml de PBS. Des cerveaux de souris ayant reçu une injection de PVC ou de simulation ont été extraits et les hémisphères ciblés ont été coupés en morceaux à l'aide de scalpels et digérés avec 50 µg ml-1 liberase (Sigma-Aldrich 05401119001) à 37 ° C pendant 30 min. Des suspensions unicellulaires ont été générées à l'aide d'un pipetage répétitif lent. La myéline a été retirée manuellement à l'aide de Myelin Removal Beads II, humain, souris, rat (Miltenyi Biotec 130-096-733) et des colonnes LS (Miltenyi Biotec 130-042-401) suivies d'un enrichissement des cellules neuronales à l'aide du kit d'isolement des neurones adultes (Miltenyi Biotec 130-126-603) et des colonnes LS. Les populations de cellules enrichies ont été fixées à l'aide du tampon de fixation Cytofix (BD 554655) à 4 ° C pendant 30 min et bloquées avec le réactif TruStain FcX (anti-souris CD16/32) 1:50 (BioLegend 101320) avant la coloration des anticorps pour la cytométrie en flux ; les anticorps et les dilutions peuvent être trouvés dans le tableau supplémentaire 12.

Des plaques à quatre-vingt-seize puits ont été recouvertes de 0, 05 mg ml-1 de poly-d-lysine (BD 354210) un jour avant l'isolement. Une solution de dissection a été préparée à l'aide de HBSS (ThermoFisher 14025092) additionné d'HEPES 10 mM (ThermoFisher 15630080), de d-glucose 33 mM (Sigma-Aldrich G8270) et de saccharose 43 mM (Sigma-Aldrich S0389). Des souris C57BL/6J femelles gravides (âgées de 12 semaines) ont été tuées conformément aux procédures opératoires standard des comités institutionnels de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) du Broad Institute du MIT et de Harvard. Les cerveaux ont été extraits des embryons au jour embryonnaire 16,5 et disséqués dans une solution de dissection. Le tissu pan-cortex a été utilisé pour l'isolement des neurones en aval. Les tissus ont été digérés à l'aide de TrypLE Select (ThermoFisher 12563011) pendant 30 min et lavés deux fois dans une solution de dissection additionnée d'inhibiteur de trypsine (Sigma-Aldrich T9253) et de BSA (Sigma-Aldrich A9418). La suspension unicellulaire a été préparée par trituration répétitive et les cellules ont été cultivées dans du milieu Neurobasal-A (ThermoFisher 10888022) additionné de supplément B-27 Plus (ThermoFisher A3582801).

L'isolement des cellules myéloïdes et T infiltrant le SNC a été réalisé comme décrit précédemment48. En bref, les souris ont été profondément anesthésiées après t = 1, 3 et 7 jours avec du CO2 et perfusées par voie transcardiaque avec 20 ml de PBS. Des cerveaux de souris injectées de PVC ou de simulation ont été extraits et les hémisphères ciblés ont été coupés en morceaux à l'aide de scalpels et digérés avec 50 µg ml-1 libérase (Sigma-Aldrich 05401119001) à 37 ° C pendant 30 min, puis écrasés à travers des tamis cellulaires de 100 µm et 70 µm (Greiner One-Bio 542000 et 542070). La myéline a été éliminée à l'aide d'un gradient Percoll continu à 30 % (Sigma-Aldrich GE17-0891-01) et d'une centrifugation de densité à 2 700 tr/min. Après l'élimination de la myéline, une suspension unicellulaire de cellules immunitaires infiltrant le cerveau a été préparée dans du PBS et bloquée avec le réactif TruStain FcX (anti-souris CD16 / 32) 1:50 (BioLegend 101320) avant la coloration des anticorps pour la cytométrie en flux. Une solution de coloration DAPI (Miltenyi Biotec 130-111-570) a été ajoutée à une dilution de 1:100 immédiatement avant l'analyse par cytométrie en flux pour discriminer les cellules vivantes. Le fluide interstitiel entourant les cellules parenchymateuses du cerveau a été isolé par lavage du tissu cérébral haché aux points de temps post-injection indiqués dans du PBS et centrifugation à 500 g. Les tests ELISA de cytokines pour l'interleukine-1β (IL-1β), l'interleukine-6 ​​(IL-6), l'interféron-γ (IFN-γ) et le facteur de nécrose tumorale (TNF) ont été réalisés selon le protocole du fabricant (Invitrogen 88-7013-22, 88-7064-22, 88-7314-22 et 88-7324-22, respectivement) et l'absorbance à 450-570 nm a été mesurée. Les concentrations de cytokines ont été calculées en fonction des normes diluées selon le protocole du fabricant.

Pour étudier la persistance des PVC dans le cerveau de la souris, le liquide interstitiel a été isolé à partir d'homogénats de cerveau. En bref, les souris traitées au PVC ont été euthanasiées et une perfusion transcardiaque avec du PBS a été réalisée avant l'extraction de cerveaux entièrement intacts. Le tissu cérébral a été dissocié mécaniquement à l'aide de scalpels stériles, suivi d'une homogénéisation de dounce en suspensions unicellulaires. Ces suspensions unicellulaires ont été centrifugées à 500 g pendant 5 min, et les surnageants clarifiés ont été dilués dans 28 ml de PBS et ultracentrifugés à 120 000 g pendant 2 h à 4 ° C pour sédimenter tous les complexes protéiques PVC intacts. Les culots ont été remis en suspension dans 50 ul de PBS et centrifugés à 16 000 g pendant 15 min à 4 ° C pour éliminer l'homogénat en vrac résiduel. Enfin, nous avons analysé les remises en suspension avec TEM à coloration négative pour détecter les complexes de PVC intacts ; voir 'Microscopie électronique'.

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées dans Prism (9.3.1). Les données quantitatives sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type avec n = 2 à 4 répétitions biologiques par condition ; le nombre de répétitions présentées est indiqué dans les légendes des figures. Sauf indication contraire, les répliques biologiques représentent des traitements indépendants dans des puits de culture ou des souris séparés. Toutes les micrographies, gels et transferts sont des images représentatives d'au moins n = 3 expériences indépendantes. La signification statistique a été calculée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle suivie de tests post hoc de Bonferroni (pour corriger les comparaisons multiples), comme indiqué dans les légendes des figures. Les valeurs de P inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives ; les résultats de tous les tests statistiques (y compris les valeurs P) sont inclus dans les données sources aux côtés des données sources associées pour chaque panneau de figure.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Tous les plasmides générés au cours de ce travail (tableau supplémentaire 7) sont disponibles auprès d'Addgene. Les lectures de séquençage sont disponibles dans Sequence Read Archive sous BioProject ID PRJNA929529. Des images de gel et d'immunoblot non recadrées peuvent être trouvées dans la Fig. 1 supplémentaire. Les données sources sont fournies avec cet article. Toutes les données supplémentaires sont disponibles sur demande auprès des auteurs.

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Les auteurs remercient DS Yun, M. Bisher, D. Mankus et L. Lytton-Jean pour l'assistance et la formation relatives à l'imagerie TEM et SEM ; Y. Zhang pour des conseils supplémentaires concernant l'imagerie TEM ; RP Schiavoni pour son assistance en spectrométrie de masse ; G. Faure pour ses conseils sur les techniques bioinformatiques ; et tous les membres du laboratoire Zhang pour leur soutien et leurs discussions utiles. Plusieurs graphiques dans les figures (cellules sur les figures 1f, g et 3a ; souris, cerveau et neurones sur la figure 4c ; ultracentrifugeuse sur les figures de données étendues. 1a et 3a ; protéines de charge utile sur la figure 1b et les figures de données étendues. 3a et 10) ont été créés avec BioRender.com. JK est soutenu par une bourse d'études supérieures du Tan-Yang Center for Autism Research, BL est soutenu par une subvention de l'Institut national du cancer (1F31CA275339-01) et MS est soutenu par une bourse à long terme du Human Frontier Science Program. FZ est soutenu par une subvention du NIH (2R01HG009761-05); l'Institut médical Howard Hughes; le Poitras Center for Psychiatric Disorders Research au MIT; le Centre de recherche sur l'autisme Hock E. Tan et K. Lisa Yang au MIT ; le Yang-Tan Molecular Therapeutics Center du MIT ; le K. Lisa Yang Brain-Body Center du MIT ; Donateurs de dons thérapeutiques programmables du Broad Institute ; La Fondation Pershing Square, W. Ackman et N. Oxman ; J. et P. Poitras; la Fondation caritative BT ; la Fondation de la famille Asness ; la famille Phillips; D.Cheng; et R. Metcalfe.

Institut médical Howard Hughes, Cambridge, MA, États-Unis

Joseph Kreitz, Mirco J. Friedrich, Akash Guru, Blake Lash, Makoto Saito, Rhiannon K. Macrae et Feng Zhang

Broad Institute of MIT et Harvard, Cambridge, MA, États-Unis

Joseph Kreitz, Mirco J. Friedrich, Akash Guru, Blake Lash, Makoto Saito, Rhiannon K. Macrae et Feng Zhang

McGovern Institute for Brain Research au MIT, Cambridge, MA, États-Unis

Joseph Kreitz, Mirco J. Friedrich, Akash Guru, Blake Lash, Makoto Saito, Rhiannon K. Macrae et Feng Zhang

Département des sciences cérébrales et cognitives, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, États-Unis

Joseph Kreitz, Mirco J. Friedrich, Akash Guru, Blake Lash, Makoto Saito, Rhiannon K. Macrae et Feng Zhang

Département de génie biologique, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, États-Unis

Joseph Kreitz, Mirco J. Friedrich, Akash Guru, Blake Lash, Makoto Saito, Rhiannon K. Macrae et Feng Zhang

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JK et FZ ont conçu le projet et conçu toutes les expériences. JK a réalisé toutes les expériences relatives à l'expression, à la caractérisation et à l'ingénierie du PVC. MJF, AG, BL et JK ont effectué des injections de souris et d'autres procédures liées à la souris. MJF a fourni une assistance supplémentaire pour la planification et l'analyse des données relatives aux expériences sur la souris. FZ et MS ont fourni un mentorat et des conseils essentiels sur les procédures techniques. FZ a supervisé cette recherche et cette conception expérimentale avec le soutien de RKMJK a écrit le manuscrit sous la direction de RKM et FZ et avec la contribution de tous les auteurs.

Correspondance avec Feng Zhang.

JK et FZ sont co-inventeurs de la demande de brevet provisoire américaine no. 63/310 327 déposé par le Broad Institute intitulé « Cell-Type Specific Targeting Contractile Injection System ». FZ est conseiller scientifique et cofondateur d'Editas Medicine, Beam Therapeutics, Pairwise Plants, Arbor Biotechnologies et Aera Therapeutics. FZ est également conseiller scientifique pour Octant. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie Mark Hurst, Martin Pilhofer et les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, flux de travail pour la production de PVC dans E. coli. Le locus PVC a été synthétisé de novo et cloné en deux plasmides distincts : un plasmide structurel/accessoire (pPVC) contenant pvc1-16 et un plasmide charge utile/régulateur (pPayload) contenant des charges utiles à délivrer (Pdp1/Pnf) ainsi que plusieurs gènes censés réguler l'expression du gène PVC (PAU_RS16570-RS24015). b, Comparaison des distributions de longueur PVC de ce manuscrit et d'un travail précédent9. Une image TEM représentative (avec les retours sur investissement utilisés pour mesurer les longueurs de PVC surlignées en jaune) est également affichée. Barre d'échelle, 200 nm. c, annotation HHpred/Pfam des gènes régulateurs putatifs du PVC (PAU_RS16570-RS24015). Au moins un gène (PAU_RS16560) contient un domaine prédit connu pour être impliqué dans la régulation des gènes (domaine régulateur transcriptionnel de type LysR). d, Rendements de protéines en vrac après purification (à partir de 500 ml de culture bactérienne) avec ou sans PAU_RS16570-RS24015. Une augmentation d'environ 100 fois du rendement en protéines a été observée lorsque ces gènes ont été inclus aux côtés de pvc1-16. Les valeurs sont moyennes ± sd avec n = 3 réitérations biologiquement indépendantes de la procédure de purification. e, gel SDS – PAGE illustrant les résultats de la purification avec ou sans PAU_RS16570-RS24015, confirmant le résultat de (d). f, les images TEM illustrant les résultats de la purification avec ou sans PAU_RS16570-RS24015, confirmant davantage le résultat de (d) et indiquant que les particules déficientes en charge utile résultantes conservent toujours une structure canonique. Barre d'échelle, 200 nm. g, analyse RT-qPCR de l'expression PVC avec ou sans PAU_RS16570-RS24015. Aucune déplétion significative des niveaux d'ARNm pour pvc1-16 n'a été observée dans les cellules dépourvues de PAU_RS16570-RS24015, ce qui indique que ces gènes ne jouent pas un rôle direct en tant que régulateurs transcriptionnels pour ce locus. Les valeurs sont moyennes avec n = 3 puits qPCR séparés pour chaque condition. h, Western blot contre un composant PVC structurel (Pvc12) dans la culture bactérienne non purifiée ainsi qu'un échantillon purifié. Une bande Pvc12 a été observée dans des bactéries dépourvues de PAU_RS16570-RS24015, démontrant que ces gènes ne sont pas nécessaires à l'expression d'au moins une protéine structurale PVC. Cela peut suggérer que PAU_RS16570-RS24015 affecte l'assemblage (plutôt que l'expression) des particules de PVC.

Données source

a, les PVC hébergeant Flag–Pvc2 sont actifs dans les cellules Sf9, ce qui indique que la contraction de la gaine (nécessaire à l'injection de cellules cibles7) n'est probablement pas altérée par l'ajout de l'étiquette Flag sur Pvc2. Les valeurs sont moyennes ± sd avec n = 3 répétitions biologiques. La signification statistique a été calculée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Bonferroni ; ****P < 0,0001 ; ns, non significatif. b, Contracted Flag-tagged PVCs can be observe in TEM, fournissant une preuve supplémentaire que cette stratégie de marquage n'inhibe pas la contraction de la gaine. Une particule de PVC présentant un phénotype contracté est indiquée par une flèche. Barre d'échelle, 100 nm. c, Le domaine connecteur entre les sous-unités de gaine pour T6SS (PDB : 3J9G) et PVC (PDB : 6J0B) contient un domaine N-terminal flexible (NTD) qui permet probablement le marquage drapeau N-terminal de cette protéine sans perte de contraction de la gaine. d, L'extrémité N-terminale de Pvc2 est exposée à l'extérieur lorsque le PVC est à l'état étendu (PBD : 6J0B, 6J0C), permettant la détection basée sur la FI des particules de PVC contenant Flag-Pvc2. Les cinq premiers résidus de Pvc2 sont colorés en vert pour marquer leur position dans le complexe gaine. e, le signal IF contre les PVC hébergeant Flag – Pvc2 (vert) se désintègre après 24 h, suggérant peut-être que cette méthode IF colore sélectivement les PVC à l'état étendu. Barre d'échelle, 50 μm.

Données source

a, Workflow pour étudier le chargement de la charge utile dans les PVC. Seules les particules de PVC entièrement assemblées (ainsi que toutes les charges utiles chargées) localisées sur le culot après ultracentrifugation ; les protéines libres de faible poids moléculaire, cependant, ne formaient pas de culot. Cela a permis l'identification des charges utiles chargées via la dénaturation Western blot de la fraction de granulés. b, La charge utile PVC Pdp1 contient un domaine d'empaquetage N-terminal prédit. Le domaine N-terminal (NTD) de Pdp1 est probablement désordonné car il présente un faible score pLDDT dans AlphaFold (il apparaît comme une longue extension désordonnée dans la structure prédite de la protéine) ainsi qu'un score PONDR VSL2 élevé49. Cette région désordonnée N-terminale pourrait servir de "domaine d'emballage" - un identifiant moléculaire pour aider les machines de chargement du PVC à identifier et à charger les charges utiles appropriées. cd, les domaines d'encapsidation N-terminaux de Pdp1 (c) et Pnf (d) sont nécessaires et suffisants pour le chargement de ces protéines dans une particule de PVC. Pdp1 et Pnf ont été étiquetés avec des étiquettes HiBiT C-terminales (pour permettre la détection par western blot) et ont été tronqués en série pour localiser des séquences minimales capables de charger ces charges utiles dans une particule de PVC. Les domaines sur les extrémités N de chaque protéine de charge utile étaient suffisants pour le chargement, et la troncature de ces NTD a inhibé le chargement, indiquant que les NTD de Pdp1 et Pnf servent de domaines d'emballage pour ce PVC. Comme sur la figure 1e, la protéine de la plaque de base (Pvc12) a été choisie comme contrôle de charge pour ce transfert Western car un nombre équivalent d'unités Pvc12 se trouve dans chaque particule de PVC. Notez que dans le panneau (d), alors que les bandes Pvc12 et Pnf ont été visualisées sur le même gel, deux temps d'exposition différents ont été utilisés (pour éviter la sursaturation des bandes Pvc12 plus brillantes).

a, les PVC non chargées, ainsi que les charges utiles purifiées séparément (toxines Pdp1 et Pnf), sont insuffisantes pour produire une cytotoxicité efficace dans les cellules Sf9. Pdp1 et Pnf ont été purifiés indépendamment des complexes de PVC par purification par affinité et ont été administrés à des cellules Sf9 à des doses à peu près équivalentes à la quantité chargée dans les PVC (détermination des doses de charge utile biologiquement pertinentes en (b)). Une cytotoxicité efficace n'a été observée que lorsque le complexe PVC et les protéines de charge utile ont été co-purifiés. Les valeurs sont moyennes ± sd avec n = 3 répétitions biologiques. La signification statistique a été calculée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Bonferroni ; ****P < 0,0001. b, Détermination de la dose pour le test de cytotoxicité à partir de (a). Les PVC chargés de protéines de charge utile étiquetées HiBiT ont été exécutés parallèlement à un titrage d'une protéine témoin (protéine témoin HiBiT; Promega N3010); les intensités de bande (quantifiées avec ImageJ) ont ensuite été comparées pour déterminer la quantité approximative de protéine de charge utile chargée dans les PVC. À partir de cette analyse, nous avons observé que Pdp1 est chargé en plus grande quantité que Pnf (~ 1 % et ~ 0,1 % des protéines totales, respectivement) ; nous avons ainsi dosé les cellules Sf9 en (a) avec les protéines Pdp1 et Pnf purifiées à 1% et 0,1% de la dose de PVC chargés. c, Analyse représentative par cytométrie en flux de l'apport de protéines médiées par le PVC dans des cellules en culture. Après avoir bloqué les cellules sur FFC/SSC pour éliminer les débris, nous avons défini un seuil GFP-/+ en utilisant une condition de contrôle positif (cellules transfectées avec loxP-GFP et Cre). Nous avons ensuite appliqué ce seuil à des données expérimentales pour déterminer la proportion de cellules exprimant la GFP.

Données source

a, organisation du domaine du gène de la fibre de queue de PVC (pvc13). La fibre de queue contient un domaine N-terminal (NTD) avec une homologie avec les fibres de queue d'autres CIS, un domaine qui correspond aux domaines de l'arbre des fibres adénovirales et un domaine C-terminal avec une homologie avec les domaines de liaison à l'hôte des fibres de queue de bactériophage. Les domaines ont été représentés sur la base de résultats HHpred statistiquement significatifs (> 95 %) et sont dessinés à peu près à l'échelle. Barre d'échelle, 100 aa. b, Pvc13 est chargé via le NTD, impliquant le domaine de pointe de fibre de phage C-terminal en tant que domaine de liaison cellulaire. Pvc13 a été tronqué à chaque extrémité et la charge a été déterminée par Western blot dénaturant sur des particules de PVC purifiées. Seule la troncature du NTD a entraîné une perte de Pvc13, suggérant que ce domaine relie la fibre de queue au PVC. Un transfert supplémentaire contre la charge utile (Pdp1-NTD – Cre) a été inclus pour confirmer la présence de PVC assemblés. c, le domaine de pointe de fibre de phage C-terminal de Pvc13 partage une similitude structurelle et de séquence avec des domaines connus de liaison aux récepteurs de bactériophages. Des superpositions structurelles ont été générées entre le domaine de pointe de fibre de phage de Pvc13 (en gris) et des régions analogues d'une fibre de queue de prophage chez Bizionia argentinensis (cyan ; PDB : 6OV6), gp10 du phage T4 (magenta ; PDB : 5IV5) et gp12 du phage T4 (jaune ; PDB : 5HX2). d, Structures prévues et caractéristiques de livraison des fibres de queue en PVC de type sauvage et d'ingénierie. La structure prédite AlphaFold du domaine de pointe de fibre de phage C-terminal contient une structure de tube hélicoïdal avec une pointe globulaire à une extrémité que nous avons supposée être le domaine de reconnaissance cible distal de la fibre de queue globale. Il est important de noter qu'il existe également une courte région de 32 aa (étiquetée CTD; représentée en or) qui reboucle à travers le tube, le stabilisant probablement. Nous avons observé que les conceptions dépourvues de ce CTD (lorsqu'elles étaient co-purifiées avec le complexe PVC) produisaient une activité trompeuse dans les expériences de livraison de Cre dans HEK 293FT, peut-être en raison de l'éjection sporadique de la charge utile Cre de la particule de PVC (la protéine Cre libre peut pénétrer dans les cellules indépendamment d'un véhicule de livraison50). Cependant, les conceptions conservant ce CTD n'ont produit aucun signal aberrant dans HEK 293FT, indiquant que l'éjection de la charge utile était à nouveau correctement régulée. Les séquences d'acides aminés pour les conceptions représentatives de Pvc13 se trouvent dans les tableaux supplémentaires 1 à 4. Barre d'échelle, 150 μm.

a, les cellules A549 présentent une condensation de F-actine après exposition à des PVC spécifiques à l'EGFR (abritant Pvc13 – E01-DARPin), indiquant que les charges utiles de toxine PVC endogène (qui sont connues pour cibler le cytosquelette d'actine) ont été délivrées avec succès. Barres d'échelle, 100 μm (rangée supérieure) et 20 μm (rangée inférieure). b, images SEM de cellules A549 traitées avec les mêmes modèles de PVC qu'en (a). Barres d'échelle, 100 μm (rangée supérieure) et 20 μm (rangée inférieure). c, les PVC spécifiques à l'EGFR peuvent être directement visualisés en se liant aux cellules A549. Barres d'échelle, 1 μm (panneaux de gauche) et 100 nm (panneaux de droite). d, les PVC contractés sont visibles à la surface des cellules, ce qui suggère que l'apport de protéines médiées par le PVC dans les cellules humaines est médié par la contraction de la gaine. Barre d'échelle, 100 nm. e, Emplacements de mutations non contraignantes supplémentaires dans la structure prédite AlphaFold de Pvc13 – Ad5-knob. Nous avons criblé deux mutants supplémentaires - S408E et L485K - contenant chacun des substitutions d'acides aminés uniques dont il a été démontré précédemment qu'elles inhibaient la liaison d'Ad5 aux cellules cibles51. f, les nouveaux mutants du bouton Ad5 sont incapables de recibler les PVC vers les cellules HEK 293FT. Des PVC équipés de bouton Pvc13 – Ad5 (S408E ou L485K) ont été chargés avec Cre et administrés à des cellules HEK 293FT hébergeant un plasmide loxP-GFP (comme sur la figure 2a); seuls les PVC équipés de fibres de queue contenant des domaines de bouton Ad5 de type sauvage ont produit une expression efficace de la GFP. Les valeurs sont moyennes ± sd avec n = 3 répétitions biologiques. Barre d'échelle, 150 μm. g, Titrage des PVC hébergeant un bouton Pvc13 – Ad5 sur des cellules HEK 293FT. Les cellules ont été exposées à une série de dilutions de particules Pvc13 – Ad5-knob chargées de ZFD-L ou de ZFD-R (les mêmes particules que celles de la Fig. 2c) et la substitution de base médiée par le PVC a été mesurée avec un séquençage en profondeur. Efficacité du PVC saturée à environ 1 000 ng/µL. Les valeurs sont moyennes avec n = 2 répétitions biologiques.

Données source

a, les PVC hébergeant pvc13 supprimé (comme utilisé sur la Fig. 1f, g), pvc13 tronqué (manquant de aa 403-476, le domaine de liaison caractérisé sur la Fig. 2a) ou pvc10 supprimé (comme utilisé sur la Fig. 4b – e) forment toujours des particules intactes sous TEM, indiquant que ces gènes ne sont pas nécessaires à l'assemblage du complexe PVC. Barre d'échelle, 100 nm. b, les modifications apportées à pvc13 ou pvc10 n'affectent pas le chargement des protéines de charge utile. Les charges utiles PVC endogènes Pdp1 et Pnf ont été marquées avec HiBiT et chargées dans des complexes PVC de type sauvage ou mutant; le chargement réussi de la charge utile a été évalué avec un transfert HiBiT. Aucun épuisement significatif de Pdp1 ou Pnf n'a été observé dans les PVC mutants, indiquant que ces gènes ne sont pas nécessaires pour le chargement de la charge utile. c, la régulation de la longueur du PVC n'est pas perturbée par des modifications de pvc13 ou pvc10. Les longueurs de PVC ont été mesurées via une technique similaire à celle de la figure 1b des données étendues ; aucun changement significatif dans la distribution des longueurs n'a été observé dans les PVC mutants. d, les PVC se lient aux macrophages de souris en l'absence de pvc13 ou pvc10 de type sauvage. Des cellules J774A.1 (une lignée cellulaire utilisée dans des études antérieures sur l'activité du PVC1,2,3) ont été exposées à des PVC marqués avec Flag (comme sur la Fig. 1d) et la liaison a été évaluée par immunofluorescence. Les PVC contenant du Pvc13 modifié sont toujours regroupés à la surface des cellules J774A.1, ce qui indique que cette interaction de liaison n'a pas été médiée par Pvc13 de la même manière que pour les cellules humaines de la figure 2a. Barre d'échelle, 100 μm. e, l'activité PVC dans les macrophages de souris persiste en l'absence de pvc13 de type sauvage. À l'appui des résultats de (d), les PVC contenant du pvc13 tronqué ou supprimé ont produit une cytotoxicité efficace dans les cellules J774A.1, indiquant que l'activité du PVC dans cette lignée cellulaire n'est pas le résultat d'une reconnaissance spécifique par la fibre de la queue. Cependant, la suppression de la pointe de la pointe (pvc10) produit une perte d'activité, ce qui suggère que le PVC peut néanmoins être actif de manière non spécifique contre ces cellules. Les valeurs sont moyennes ± sd avec n = 3 répétitions biologiques. La signification statistique a été calculée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Bonferroni ; ****P < 0,0001 ; ns, non significatif.

Données source

a, schéma de déclenchement de la cytométrie en flux pour le test tdTomato in vivo sur la figure 4d. b, Évolution dans le temps du signal tdTomato induit par le PVC dans le cerveau de souris après injection intracrânienne de PVC (comme sur la Fig. 4d). Le signal TdTomato dans les neurones a commencé à augmenter à t = 3 à 7 jours après l'injection. c, les PVC peuvent cibler les neurones primaires in vitro. Une mort cellulaire presque complète (97 %) a été observée, indiquant que les PVC équipés d'un bouton Ad5 (RGD/PK7) présentent un tropisme robuste pour les neurones in vitro. d, Schéma de déclenchement par cytométrie en flux pour la quantification des cellules T activées et des granulocytes dans les tests d'immunogénicité de la Fig. 4e. e, Quantification des cytokines inflammatoires dans le SNC après injection intracrânienne de PVC avec ELISA. Aucun enrichissement significatif de toute cytokine testée n'a été observé (à t = 1, 3 ou 7 jours), indiquant que l'injection de PVC ne stimule pas une réponse inflammatoire locale dans le SNC au-dessus du fond. f, évolution temporelle du poids de l'animal après injection de PVC. Aucune perte significative de poids corporel n'a été observée, ce qui indique que l'injection de PVC ne produit probablement pas de toxicité systémique significative chez ces animaux. g, Etude de la cytotoxicité non spécifique dans les neurones primaires in vitro. Des PVC chargés de Cre (contrairement à ceux de (c), qui contenaient des toxines) ont été ajoutés aux neurones primaires en culture et testés pour la mort cellulaire à t = 24 h. Aucune mort cellulaire significative n'a été observée au-dessus du bruit de fond, ce qui indique que ces particules n'induisent pas de toxicité cellulaire en l'absence d'une charge utile de toxine. Toutes les valeurs (b,c, e–g) sont des moyennes ± sd avec n = 3 (b, e–g) ou n = 4 (c) réplicats biologiques. La signification statistique a été calculée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle (c, g) ou d'une ANOVA bidirectionnelle (b, e) avec le test post hoc de Bonferroni ; ****P < 0,0001 ; ns, non significatif.

Données source

a, P. luminescens TT01 contient un ensemble de quatre locus PVC en tandem sur le génome, chaque région structurelle/accessoire (bleue) immédiatement suivie de gènes de charge utile putatifs (rouge). b, alignement des séquences d'ADN des quatre locus PVC dans le tableau PVC P. luminescens TT01. Les loci partagent une homologie de séquence significative mais divergent au niveau du gène de reconnaissance cible (pvc13) et de la région de charge utile. Cela suggère que ces PVC partagent une structure de base mais ciblent différents organismes et fournissent des charges utiles différentes à chaque cible. Le pourcentage d'identité est présenté avec une fenêtre glissante de n = 50 bp. c, organisation de domaine prédite par HHpred de deux gènes putatifs de charge utile partagés par des locus PVC séparés dans le tableau PVC P. luminescens TT01. Alors que les deux gènes partagent un domaine commun (toxine associée à YenB/RHS2 ; E = 0,0000067/0,0000039), les deux contiennent également des séquences inconnues sur les extrémités N. Étant donné que les charges utiles PVCpnf Pdp1 et Pnf sont chargées via des domaines d'emballage N-terminaux (données étendues Fig. 3b – d), il est probable que ces domaines N-terminaux représentent des domaines d'emballage qui chargent ces protéines dans des complexes PVC. d, alignement de la séquence d'acides aminés des protéines putatives de charge utile de (c). Les deux charges utiles partagent une homologie de séquence significative dans le domaine fonctionnel (toxine associée à YenB/RHS2) mais divergent aux extrémités N-terminales. Il est plausible que ces deux charges utiles soient "triées" en différentes particules de PVC au sein de P. luminescens TT01 via leurs domaines d'emballage N-terminaux divergents. Le pourcentage d'identité est présenté avec une fenêtre glissante de n = 5 aa. e, modèle proposé pour la livraison de protéines multiplexées par P. luminescens TT01. Cet organisme produit probablement quatre particules de PVC distinctes, chacune avec une charge utile différente (triée dans chaque particule via des domaines d'emballage uniques) et un appareil de ciblage différent (pvc13), qui pourraient être sécrétés pour effectuer une activité biologique divergente au sein de plusieurs organismes hôtes (ou types de cellules/tissus) simultanément.

Dans ce travail, nous avons démontré que les PVC peuvent être conçus 1.) pour charger et fournir diverses nouvelles charges utiles, permettant l'introduction d'une nouvelle activité biologique dans les cellules cibles, et 2.) pour cibler de nouveaux organismes, permettant la livraison de cellules humaines et de souris vivantes avec une efficacité et une spécificité élevées. Nous concluons que les PVC constituent une nouvelle classe de dispositifs de livraison de protéines hautement programmables.

Fig. 1 supplémentaire et tableaux supplémentaires 1 à 12.

Fichiers de séquence annotés pour les plasmides répertoriés dans le tableau supplémentaire 7.

Analyse par spectrométrie de masse d'un échantillon de PVC purifié.

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Réimpressions et autorisations

Kreitz, J., Friedrich, MJ, Guru, A. et al. Livraison de protéines programmable avec un système d'injection contractile bactérien. Nature 616, 357–364 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05870-7

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Reçu : 06 octobre 2022

Accepté : 21 février 2023

Publié: 29 mars 2023

Date d'émission : 13 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-023-05870-7

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