Synthèse, caractérisation et application de PDLLA réversible

Rapports scientifiques volume 6, Numéro d'article : 19077 (2016) Citer cet article

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Dans cette étude, une série de copolymères injectables thermoréversibles et thermogélifiants PDLLA-PEG-PDLLA ont été développés et une évaluation systématique du système thermogélifiant à la fois in vitro et in vivo a été réalisée. Les solutions aqueuses de PDLLA-PEG-PDLLA au-dessus d'une concentration de gel critique pourraient se transformer spontanément en hydrogel en 2 minutes autour de la température corporelle in vitro ou in vivo. La modulation du poids moléculaire, de la longueur du bloc et de la concentration en polymère pourrait ajuster le comportement de transition sol-gel et les propriétés mécaniques des hydrogels. La gélification était thermiquement réversible en raison de l'interaction physique des micelles de copolymère et aucune cristallisation ne s'est formée pendant la gélification. Peu de cytotoxicité et d'hémolyse de ce polymère ont été trouvées et la réponse inflammatoire après l'injection de l'hydrogel au petit animal était acceptable. Des expériences de dégradation in vitro et in vivo ont montré que l'hydrogel physique pouvait conserver son intégrité pendant plusieurs semaines et éventuellement être dégradé par hydrolyse. Un modèle de rat d'abrasion des défauts de la paroi latérale et de l'intestin a été utilisé et une réduction significative de l'adhérence postopératoire a été constatée dans le groupe de PDLLA-PEG-PDLLA traité par hydrogel, par rapport au groupe témoin non traité et à l'acide hyaluronique (HA) commercial anti- groupe hydrogel d'adhérence. En tant que tel, cet hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA pourrait être un candidat prometteur de biomatériau injectable pour des applications médicales.

Les hydrogels polymères sensibles à la température ont été largement étudiés en tant que biomatériaux prometteurs pour l'administration soutenue de médicaments, l'encapsulation cellulaire, la régénération tissulaire et la prévention de l'adhérence postopératoire1,2,3. Typiquement, les solutions aqueuses de polymères sont à l'état de sol (solution) à température ambiante ou inférieure, mais se transforment spontanément en gels non fluides après administration en réponse à la température physiologique. Ces propriétés uniques permettent d'incorporer facilement des agents pharmaceutiques ou des cellules dans les solutions aqueuses de polymères en les mélangeant simplement à l'état de sol, puis en injectant les formulations correspondantes dans un tissu cible pour former un gel permanent in situ, agissant comme un dépôt d'administration contrôlée de médicaments. ou des matériaux d'échafaudage. Pendant ce temps, une telle approche sans réaction chimique avec une invasivité minimale est très bénéfique pour les applications médicales4,5.

Les copolymères triblocs disponibles dans le commerce composés de poly(éthylène glycol-propylène glycol-éthylène glycol) (Pluronics ou Poloxamers) présentent une transition sol-gel réversible induite par la température et ont été signalés pour l'administration prolongée de plusieurs médicaments4,6. Malheureusement, les poloxamères sont non biodégradables, potentiellement toxiques et s'érodent rapidement lors de l'injection après administration, ce qui limite dans une certaine mesure leur utilité dans les applications biomédicales7,8. Par conséquent, les copolymères à blocs se composaient de poly(éthylène glycol) (PEG) et de polyesters biodégradables, tels que le poly(acide lactique) (PLA)9,10, le poly(acide lactique-co-acide glycolique) (PLGA)11,12, le poly (caprolactone) (PCL)13,14 et poly(caprolactone-co-acide lactique) (PCLA)3,15 ont été développés pour obtenir des polymères thermogélifiants biodégradables et biocompatibles et des progrès impressionnants ont été réalisés au cours des dernières décennies.

En particulier, les copolymères thermogélifiants à base de PEG/PLA ont reçu une attention remarquable depuis que les copolymères PEG-PLLA-PEG ont été développés par Jeong et ses collaborateurs en tant que premier hydrogel biodégradable et thermosensible9. Les copolymères triblocs PEG-PLLA-PEG ont été synthétisés en deux étapes en couplant les polymères diblocs MPEG-PLLA préalablement préparés en utilisant l'hexaméthylène diisocyanate (HMDI) comme agent de couplage. La solution aqueuse des copolymères triblocs a subi une transition gel-sol à mesure que la température augmentait et la libération prolongée in vitro de dextrane à partir de cet hydrogel a été étudiée. Plus tard, les copolymères triblocs PLLA-PEG16 et PEG-PDLLA-PEG17 en forme d'étoile se sont avérés posséder la transition gel-sol similaire. Mais la propriété de transition gel-sol de ces copolymères mentionnés ci-dessus peut ne pas convenir à l'encapsulation de protéines ou de certains médicaments à température plus élevée et l'injection de l'hydrogel à température élevée est inconfortable pour les patients5. Par conséquent, de nombreuses tentatives ont été entreprises pour trouver des hydrogels à base de PEG/PLA avec une température de solution critique inférieure (LCST) autour de la température corporelle. Il a été rapporté que les hydrogels formés à partir de la stéréocomplexation des blocs poly (L-lactide) (PLLA) et poly (D-lactide) (PDLA) présentaient une transition sol-gel attendue lorsque la température augmentait18. Bien que la gélification induite par le stéréocomplexe des copolymères énantiomères puisse être réalisée par le mélange de copolymères énantiomères triblok19,20, de copolymères en forme d'étoile21 ou de copolymères triblok et en forme d'étoile22, la gélification était irréversible et dépendait d'une plage restreinte de composition polymère. En outre, des stéréo-copolymères triblocs multiblocs PEG/PLLA23 et PLA-PEG-PLA avec des rapports L-/DL-LA variables24 ont été développés pour présenter une transition sol-gel-sol souhaitée lors du chauffage. Les effets de la longueur du bloc, de la composition des copolymères et des additifs sur le comportement de transition de phase ont également été discutés.

Cependant, à notre connaissance, il n'existe jusqu'à présent aucun rapport sur les copolymères triblocs PDLLA-PEG-PDLLA montrant une gélification sensible à la température réversible. Ici, nous avons développé un nouvel hydrogel de copolymère tribloc thermogélifiant PDLLA-PEG-PDLLA en modulant la composition et la longueur de bloc des copolymères, qui présentent une transition sol-gel réversible et nette entre la température ambiante et la température corporelle. Les copolymères PDLLA-PEG-PDLLA ont été synthétisés en une seule étape sans utiliser d'agent de couplage éventuellement toxique, résultant en une approche facile et sûre. Dans cet article, la relation structure-propriété de la transition sol-gel réversible, la cinétique de gélification et les propriétés mécaniques ont été étudiées en détail. De plus, nous présenterons une étude systématique des copolymères thermogélifiants PDLLA-PEG-PDLLA à la fois in vitro et in vivo, y compris la cytotoxicité, la biocompatibilité et l'étude de la biodégradation dynamique. Par rapport à de nombreuses enquêtes sur les matériaux médicaux biodégradables, l'évaluation systématique des profils de biocompatibilité et de dégradation des hydrogels synthétiques injectables, en particulier des copolymères PEG/PLA thermogélifiants, est très limitée5,23,25. La présente étude pourrait être significative pour les copolymères thermogélifiants PEG/PLA dans les applications biomédicales et biopharmaceutiques. Dans nos travaux précédents, nous avons également étudié un hydrogel physique thermoréversible à base de PCL-PEG-PCL (PCEC)26, qui a montré un grand potentiel dans l'administration de médicaments et la prévention des adhérences abdominales postopératoires27,28. Mais la solution de PCEC a tendance à être instable et gélifiée à température ambiante en raison de la cristallisation des blocs de polyesters, ce qui peut affecter l'aptitude à la seringue. D'un point de vue pratique, le copolymère PDLLA-PEG-PDLLA pourrait être plus pratique et a une perspective d'application plus large en revanche, car il a montré une stabilité prononcée de la phase sol à température ambiante et pourrait être utilisé comme thermogel formé in situ injectable. Enfin, l'application dans l'anti-adhérence post-opératoire du système d'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA a également été évaluée dans un modèle de rat d'abrasion de défaut de paroi latérale-caecum.

Les copolymères triblocs ont été synthétisés par polymérisation par ouverture de cycle du D,L-lactide en utilisant du PEG comme initiateur et de l'octoate stanneux comme catalyseur. Une série de copolymères PDLLA-PEG-PDLLA avec différents poids moléculaires et ratio de blocs ont été synthétisés dans ce travail pour optimiser la formulation de l'hydrogel et les propriétés mécaniques. Dans cet article, les copolymères ont été désignés par LB – EA – LB (PLEL), où A et B représentent respectivement les poids moléculaires moyens en nombre théoriques (Mn) des blocs PEG et PDLLA. Une analyse 1H-RMN (voir Fig. S1 supplémentaire) et des mesures GPC ont été effectuées pour caractériser la structure chimique des copolymères obtenus, qui ont été résumées dans le tableau 1. Tous ces résultats ont indiqué la synthèse réussie de copolymères triblocs PDLLA-PEG-PDLLA conçus en contrôlant la composition de l'alimentation et le rendement étaient supérieurs à 90 %.

Les copolymères triblocs PDLLA-PEG-PDLLA synthétisés constitués d'un bloc PEG hydrophile et d'un bloc PDLLA hydrophobe présentaient une amphipathicité en solution aqueuse. La longueur du bloc, le rapport PEG/polyester et le poids moléculaire ont joué un rôle important dans la dissolution des copolymères blocs amphiphiles29. Parmi ces copolymères préparés, les copolymères (S1, S2, S3 et S6) avec un rapport PEG/PDLLA d'environ 0,5 pouvaient se dissoudre facilement dans l'eau, tandis que L1700-E1500-L1700 (copolymère S4) ayant un rapport PEG/PDLLA plus petit était difficile à dissoudre. Bien que L2000–E2000–L2000 (copolymère S5) possédait un rapport PEG/PDLLA approprié de 0,5, son long bloc de PDLLA hydrophobe a donné lieu à une forte hydrophobie dans l'eau. Parmi ces copolymères solubles, les copolymères (S1 ~ S3) ont subi une transition sol-gel apparente, tandis que la solution L1000 – E2000 – L1000 (copolymère S6) n'a pas montré de transition sol-gel dans la plage de température de 10 ~ 60 ° C en raison de son trop long bloc de PEG hydrophile. PCEC (1000-1000-1000) a présenté une transition sol-gel comme décrit dans notre article précédent13,26. Ces phénomènes indiquent que la thermogélification d'un tel système de copolymères séquencés polyester-polyéther amphiphiles est attribuée à l'équilibre délicat entre l'hydrophobicité du bloc polyester et l'hydrophilie du segment PEG. Notamment en particulier, la dissolution des copolymères PDLLA-PEG-PDLLA obtenus pouvait être effectuée par agitation à basse température, alors que la préparation de la solution aqueuse de polymère PCEC nécessitait une procédure de cycle de chauffage et de trempe lourde14,23.

Une meilleure compréhension du mécanisme de transition sol-gel dépendant de la température est importante pour optimiser les propriétés de l'hydrogel. Habituellement, les copolymères séquencés polyester-polyéther amphiphiles pouvaient s'auto-assembler en micelles de type noyau-enveloppe dans l'eau et l'agrégation micellaire était supposée être impliquée dans le mécanisme sous-jacent de la transition physique sol-gel12,24. Par conséquent, nous avons initialement étudié les micelles de copolymère PDLLA-PEG-PDLLA auto-assemblées dans différentes conditions. L'observation par microscopie électronique à transmission (TEM) et la mesure de la diffusion dynamique de la lumière (DLS) ont certifié que les micelles étaient dispersées sous forme de nanoparticules sphériques individuelles avec une taille de particule de 40 à 50 nm à une faible concentration (0, 1% en poids) (Fig. 1A, B). L'agrégation des micelles à une concentration plus élevée a ensuite été détectée par DLS à différentes températures pour étudier la structure hiérarchique proposée pendant la gélification. Les micelles dans la solution de polymère à 1,0 % en poids présentaient des distributions de taille unimodales et la taille des micelles augmentait légèrement avec l'augmentation de la température de 4 °C à 30 °C, suivie d'une augmentation brutale autour de 37 °C, ce qui peut permettre une agrégation plus importante à des concentrations plus élevées (Fig. 1C). Comme prévu, des distributions de taille multimodales et un comportement d'agrégation évident ont été observés progressivement sur 4 à 30 ° C lorsque les micelles se trouvaient dans la solution de polymère à 10% en poids, correspondant à la transition sol-gel (Fig. 1D). De plus, ces résultats suggèrent également que la transition sol-gel est affectée non seulement par la température mais également par la concentration de la solution de copolymère.

Caractérisation de la micelle PDLLA-PEG-PDLLA à faibles concentrations et schéma de principe montrant le comportement thermogélifiant.

(A,B) Image TEM et granulométrie des micelles à 25 °C (S3, 0,1 % en poids). (C, D) Spectre de distribution granulométrique des particules de micelles (S3, 1 % en poids et 10 % en poids) à différentes températures, chaque mesure effectuée après un équilibrage de 10 min. (E) Le diagramme schématique du processus de gélification physique induite par la température. Les copolymères séquencés amphiphiles s'auto-assemblent en micelles de type noyau-enveloppe en solution aqueuse (25% en poids), puis gélifient entre la température ambiante et la température corporelle en raison de l'augmentation et de l'agrégation des micelles après chauffage.

Bien que le mécanisme sous-jacent de la gélification physique des copolymères blocs amphiphiles dans l'eau reste un problème fondamental difficile dans ce domaine, toutes nos mesures jusqu'à présent soutiennent le processus en deux étapes de gélification physique induite par la température23,30, qui peut être schématiquement illustré comme sur la figure 1E. En solution aqueuse, le PDLLA hydrophobe dans le copolymère constitue le noyau de la micelle auto-assemblée en raison de l'interaction hydrophobe et les blocs PEG hydratés forment la coque hydrophile. A basse température, les petites micelles s'écoulent librement et la solution aqueuse semble être une suspension semblable à un sol. Avec l'augmentation de la température, la taille des micelles augmente, suivie de l'agrégation et du tassement entre les micelles, ce qui donne une structure de gel non fluide physiquement réticulée autour de la température corporelle.

La transition de phase des solutions aqueuses de copolymères PDLLA-PEG-PDLLA a été étudiée par la méthode d'inversion du tube à essai et l'analyse rhéologique dynamique. La figure 2 (A, B) présente le diagramme de transition de phase des solutions aqueuses de copolymères PDLLA-PEG-PDLLA en fonction de la température et de la concentration obtenues via la méthode d'inversion du tube. Au-dessus d'une concentration de gel critique (CGC), le processus de transition de phase consistait en sol, gel et précipitation trois états physiques de base lors du chauffage, conduisant à une température de gélification critique inférieure (LCGT) à partir du sol-gel et une température de gélification critique supérieure (UCGT) des précipitations. Selon le diagramme de transition de phase, la LCGT et l'UCGT ont changé avec la variation de concentration. Avec l'augmentation de la concentration en polymère, la gélification a eu lieu à une température plus basse, tandis que la précipitation s'est produite à une température plus élevée, en raison de concentrations de micelles plus élevées et du renforcement de l'agrégation entre les micelles. Lorsque le rapport PEG/PDLLA a été maintenu constant (1/2), augmentation du poids moléculaire total de 3 000 pour S1 à 4 500 pour S3, la LCGT et l'UCGT ont augmenté de manière significative, tandis que la forme globale de la courbe est restée presque inchangée, entraînant le déplacement de la fenêtre de gel à une température plus élevée. De plus, à un bloc PEG donné (1 500), l'augmentation de la longueur du bloc PDLLA a fait diminuer le CGC et le LCGT, mais augmenter l'UCGT. En d'autres termes, la plage de gel dans le diagramme de phase devient plus grande avec l'augmentation des blocs PLA lorsque le bloc PEG est maintenu constant.

Le dosage du comportement thermogélifiant et l'analyse rhéologique de l'obtenu.

Hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA. (A) Photographies des solutions de copolymères à différentes températures. Le copolymère L1000–E1000–L1000 (S1, 25 % en poids) gélifie entre 4 °C et la température ambiante et précipite autour de 37 °C. Le copolymère L1500–E1500–L1500 (S3, 25% en poids) présentait un sol à 4 ° C et à température ambiante et gélifiait autour de la température corporelle. (B) Diagramme de transition de phase sol-gel de l'hydrogel testé par la méthode d'inversion du tube. (C) Dépendance à la température du stockage (G') et du module de perte (G") pour la solution aqueuse de copolymère (S3, 25 % en poids) en fonction de la température. (D) Temps de gélification des solutions de copolymère (S3, 25 % en poids à 37 ° C. (E) Changement de G' des solutions de copolymère à différentes concentrations (S3, 15 % en poids, 20 % en poids, 25 % en poids en fonction de la température.

Il est évident que le comportement de transition de phase a été considérablement modifié en fonction du poids de la molécule, de la longueur du bloc et de la concentration en polymère. Ainsi, nous avons pu ajuster la température de gélification de l'hydrogel dans une plage de température physiologiquement importante en modulant ces facteurs. Un LCGT approprié entre la température ambiante et la température corporelle signifie une injection réalisable à température ambiante et une gélification rapide sur le site pendant le fonctionnement, tandis qu'un UCGT supérieur au-dessus de 50 ° C implique une phase de gel stable après l'application de l'hydrogel in vivo. Le copolymère L1000 – E1000 – L1000 (S1) s'est gélifié spontanément à température ambiante et a précipité autour de 37 ° C (Fig. 2A, B), ce qui n'était pas souhaitable pour une application pratique. Le copolymère L1300 – E1500 – L1300 (S2) avait une fenêtre de gélification plus étroite par rapport à L1500 – E1500 – L1500 (S3) (Fig. 2B). Dans l'ensemble, le copolymère L1500 – E1500 – L1500 (S3) présentait la température de gélification optimisée (Fig. 2A, B), soutenant le choix de L1500 – E1500 – L1500 (S3) dans les formulations choisies pour des études ultérieures.

Accompagnant le comportement thermogélifiant, la solution de polymère concentrée a subi un changement significatif des propriétés mécaniques. Des mesures rhéologiques dynamiques ont été effectuées pour observer quantitativement la transition sol-gel de la solution L1500 – E1500 – L1500 (S3) (Fig. 2C – E). La valeur proche du module de stockage (G') et du module de perte (G") dans la phase de gel des polymères actuels indique la nature semi-solide du gel. Ainsi, la transition sol-gel a été définie comme le point auquel G' a augmenté. que G"23. G' et G" de la solution L1500–E1500–L1500 (S3, 25 % en poids) étaient très faibles (moins de 1 Pa, G' < G") et étaient essentiellement indépendants de la température de 4 °C à 30 °C, ce qui prouve encore l'injectabilité de cette solution de copolymère sans risque de colmatage de la seringue lors de l'injection. Au fur et à mesure que la température augmentait autour de la température corporelle, G 'et G" augmentaient brusquement de plus de 3 magnitudes, correspondant à la transition sol-gel (Fig. 2C). Les taux de croissance différentiels entre G' et G" ont conduit à la croissance de l'intensité de l'hydrogel. Le temps de gélification des solutions de copolymères à 37 ° C a également été étudié, tout comme le montre la figure 2D. L'hydrogel physique s'est formé en environ 50 à 60 s à 37 ° C et ce temps de gélification est assez bon pour les applications d'hydrogels gélifiants in situ, en particulier pour les opérations d'ingénierie tissulaire. Nous finançons également que, avec l'augmentation de la concentration de copolymère, le module de stockage (G ') s'améliore en conséquence, ce qui peut améliorer la persistance de la forme après l'injection in vivo (Fig. 2E).

Il convient de mentionner que la transition sol-gel de l'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA était thermiquement réversible. Le gel non fluide formé en augmentant la température de la solution aqueuse de polymère redevient un sol lorsqu'il est refroidi à basse température. Aucune preuve de changement n'a encore été observée lors des nombreuses répétitions de l'interconversion entre l'état sol et gel. La réversibilité thermique de l'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA (PLEL) a été prouvée par la mesure rhéologique en testant le processus de chauffage et de refroidissement G', comme le montre la figure 3A. Bien qu'une légère hystérésis entre les courbes de chauffage et de refroidissement ait été trouvée, la température de transition et la tendance de variation de G' étaient presque similaires, illustrant la thermoréversibilité de la gélification physique. Fait intéressant, la réversibilité thermique de l'hydrogel polymère PDLLA-PEG-PDLLA était vraiment différente de la gélification physique de notre hydrogel thermosensible PCL-PEG-PCL (PCEC) précédemment rapporté (Fig. 3B), qui pourrait résulter de différents mécanismes de gélification.

L'étude de gélification thermiquement réversible de l'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA (PLEL) (S3, 25 % en poids) en comparaison avec l'hydrogel PCL-PEG-PCL (PCEC) (20 % en poids).

(A, B) Changement de G' de la solution de copolymère PLEL et de la solution de copolymère PCEC sous processus de chauffage et de refroidissement. (C) Images microscopiques optiques polarisées de la solution de copolymère PLEL et de la solution de copolymère PCEC dans différentes conditions : images des solutions de polymère à 20 oC ; images des hydrogels polymères formés par chauffage direct à 37 ° C ; images des échantillons après 1 heure à 20 °C. La barre d'échelle était de 20 μm. (D) Diagramme de diffraction des rayons X de l'hydrogel PLEL formé instantanément à 37 oC et de l'hydrogel PCEC formé à 20 oC pendant 1 heure ou formé instantanément à 37 oC.

Pour comprendre ce phénomène, des tests en microscopie optique polarisée de la solution de copolymère PDLLA-PEG-PDLLA (PLEL) (25% en poids) et de la solution de copolymère PCL-PEG-PCL (20% en poids) ont été effectués pour étudier la morphologie au cours de la gélification (Fig. 3C). Peu de phase cristalline a été observée sur la photographie de la solution aqueuse de copolymère PCEC prise après avoir déposé la solution de polymère sur la lame de verre à 20°C. Lorsque l'échantillon de PCEC chauffait à 37 ° C, un gel opaque s'est formé instantanément et l'image microscopique optique polarisée a montré un faisceau de la morphologie cristalline. Le même gel opaque et une phase cristalline significative ont également été observés sur l'image de l'échantillon de PCEC prélevé après 1 heure à 20 °C. Autrement, l'image microscopique optique polarisée des solutions aqueuses de copolymères PDLLA-PEG-PDLLA était la même sur la même procédure et aucune morphologie cristalline n'a été trouvée ni à l'état sol à 20 ° C ni à l'état gel à 37 ° C.

Simultanément, la diffraction des rayons X de l'hydrogel PCEC trouble formé à 20 °C pendant 1 heure ou formé instantanément à 37 °C a montré de forts pics de diffraction à 21,3o et 23,9o correspondant au PCL cristallin, alors que l'hydrogel PLEL ne présentait aucun pic de diffraction (Fig. 3D). Tous ces résultats suggèrent que la cristallisation du bloc PCL est impliquée dans la gélification de la solution aqueuse de copolymère PCEC à la fois dans le gel à basse température et le thermogel, ce qui est cohérent avec les travaux de Jeong rapportés précédemment14. Au contraire, la thermogélification de la solution aqueuse de copolymères PDLLA-PEG-PDLLA résulte de l'interaction physique des micelles de copolymère sans cristallisation, conduisant à la gélification thermiquement réversible. Par conséquent, ceux-ci ont également démontré que la composition du polyester jouait un rôle important dans le comportement de gélification en plus de la longueur du bloc et de la concentration en polymère.

La cytotoxicité du copolymère PDLLA-PEG-PDLLA et de l'extrait d'hydrogel a été évaluée par un test de viabilité cellulaire en utilisant des cellules L929 et HUVEC. Les fibroblastes et les cellules endothéliales vasculaires jouent un rôle extrêmement important au cours du processus de cicatrisation31,32. Par conséquent, la biocompatibilité du matériau PDLLA-PEG-PDLLA avec ces cellules est directement liée aux applications de régénération tissulaire. Selon la figure 4A, la viabilité des cellules L929 et HUVEC a lentement diminué avec l'augmentation de la concentration en copolymère. Mais même à une concentration élevée de 2,5 mg/ml, une viabilité cellulaire supérieure de 85 % a encore été détectée. La viabilité des cellules L929 et HUVEC cultivées avec un extrait d'hydrogel était également d'environ 90 % (Fig. 4B). Ces résultats ont indiqué que le copolymère PDLLA-PEG-PDLLA et l'extrait d'hydrogel avaient une cytotoxicité cellulaire minimale et étaient des matériaux sûrs.

Biocompatibilité de l'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA (S3, 25 % en poids in vitro et in vivo).

(A, B) Effet du copolymère et de l'extrait d'hydrogel sur la viabilité cellulaire des cellules L929 et HUVEC mesurée par dosage MTT. Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± ET (n = 5). (C) Test hémolytique du copolymère tribloc PDLLA-PEG-PDLLA (S3). Cette photo a été prise après 3 heures de réaction. L'échantillon (f) était de l'eau distillée utilisée comme témoin positif, tandis que l'échantillon (a) était une solution saline normale utilisée comme témoin négatif. La concentration du copolymère PDLLA-PEG-PDLLA était de 0,01 mg/ml (b), 0,1 mg/ml (c), 1,0 mg/ml (d) et 10,0 mg/ml (e). Le taux d'hémolyse dans chaque groupe a été présenté sous forme de moyenne ± ET (n = 3). (D) HE-coloration des tissus environnants au moment désigné (a à e) après injection sous-cutanée dorsale de solution PDLLA-PEG-PDLLA (S3, 25 % en poids dans du PBS, PH = 7,4) chez des souris BALB/c pour l'examen de la réaction inflammatoire. Le tissu normal pris comme témoin à blanc a été montré en (f). Grossissement : 400 ×. Les images étaient représentatives de n = 3.

Compte tenu du fait que l'hydrogel de copolymère doit couvrir le site de la lésion lorsqu'il est utilisé dans une application de régénération tissulaire, nous avons également observé l'hémocompatibilité du copolymère in vitro. Un test d'hémolyse a été utilisé, suivant le protocole de la norme ISO 10993 en tant que norme internationale pour l'évaluation biologique des dispositifs médicaux. La norme d'absence d'hématotoxicité fait généralement référence à un pourcentage d'hémolyse inférieur à 5 %33. Comme le montre la figure 4C, le copolymère PDLLA-PEG-PDLLA synthétisé à des concentrations allant de 0, 01 à 10 mg / ml présentait un faible pourcentage d'hémolyse inférieur à 5%, ce qui était similaire au témoin négatif (la solution saline normale). Par rapport au témoin positif (eau distillée), toutes nos solutions de polymères ont révélé une différence significative (P < 0,05), tandis que le témoin positif a été fixé à 100 % d'hémolyse. Par conséquent, la capacité d'hémolyse du copolymère PDLLA-PEG-PDLLA était négligeable.

La réponse immunologique des souris BALB / c à l'hydrogel de copolymère PDLLA-PEG-PDLLA après injection sous-cutanée dorsale a été étudiée en observant les tissus conjonctifs et musculaires entourés du gel à plusieurs moments (Fig. 4D). À la première semaine, le site d'injection environnant présentait un infiltrat plus épais densément peuplé de neutrophiles, de lymphocytes et de macrophages, caractéristique de l'inflammation aiguë34. Par la suite, le nombre de neutrophiles, de lymphocytes et de macrophages a diminué progressivement pendant 2 à 6 semaines, suggérant que la réaction inflammatoire aiguë a été progressivement remplacée par une réaction inflammatoire chronique légère25. Les implants PDLLA-PEG-PDLLA ont eu une réponse inflammatoire aiguë et chronique, qui a duré plus de 6 semaines. Dix semaines plus tard, l'échantillon de tissu du site d'injection était presque récupéré dans le tissu normal (l'implant avait été absorbé à ce moment-là). Ni lésions musculaires importantes, ni nécrose tissulaire, hyperémie, œdème, hémorragie n'ont été observées tout au long des expériences ((voir Fig. S2 supplémentaire)). En somme, l'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA pourrait avoir une biocompatibilité acceptable pour des applications biomédicales.

Le comportement de dégradation in vitro de l'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA a été évalué dans des conditions physiologiques mimétiques (37 ° C, pH 7, 4). La figure 5A affiche les vues brutes des hydrogels restants (S3, 25% en poids) à des points de temps de dégradation prédéterminés. En s'équilibrant avec le système tampon, les échantillons ont progressivement gonflé à près de 100 % et la surface s'est érodée au cours des 4 premières semaines. Vers la sixième semaine, une quantité importante de produits hydrosolubles a été dissoute dans la solution tampon et il était difficile de conserver la forme du gel (voir l'ellipse en pointillés sur la figure 5A (6 semaines)), entraînant la désintégration de l'hydrogel . Enfin, le gel dans le tube est devenu un liquide fluide après incubation pendant 8 semaines. Le changement de pH du milieu tampon a également été vérifié pendant la dégradation avec les résultats présentés sur la figure 5B. On a observé que le pH du tampon diminuait lentement en raison de la génération de D,L-lactide et d'oligomère de bas poids moléculaire même si le milieu était remplacé tous les 4 jours. Néanmoins, le pH était toujours entre 6,0 et 7,4 pendant cinq semaines, indiquant un léger effet acide de l'hydrogel pendant la dégradation, qui pourrait être attribué à la forte teneur en eau dans l'hydrogel et à la diffusion rapide des produits de dégradation acides hors du gel. De plus, les hydrogels restants ont été collectés et mesurés par GPC à chaque instant. Comme le montre la figure 5C, le profil de pic unique s'est presque maintenu pendant les périodes de dégradation examinées, mais le temps de rétention au maximum du pic s'est lentement déplacé vers des valeurs plus grandes et les chromatogrammes ont été progressivement élargis en fonction du temps de dégradation, ce qui reflétait une décroissance constante. de MW au fur et à mesure de l'hydrolyse. Nos recherches ont révélé que la dégradation des hydrogels PDLLA-PEG-PDLLA procédait par une hydrolyse régulière des liaisons ester suivie de l'érosion du gel dans l'eau.

Dégradation in vitro des hydrogels PDLLA-PEG-PDLLA (S3, 25 % en poids) dans du PBS (pH initial 7,4) à 37 °C.

(A) Images optiques des hydrogels au temps de dégradation indiqué et les images étaient représentatives de n = 3 à chaque fois. Le niveau de PBS était très au-dessus du bord supérieur de l'hydrogel et donc au-delà du champ d'affichage dans ces images. Le produit soluble dans l'eau diffusé hors du gel était mis en valeur par l'ellipse en pointillés sur l'image (6 semaines) ; (B) Le changement du pH moyen dans la dégradation des hydrogels ; (C) Profils GPC du copolymère PDLLA-PEG-PDLLA après la période de dégradation indiquée in vitro, la flèche en pointillés indique la diminution du poids moléculaire maximal.

La formation et le maintien du gel in vivo ont été observés et confirmés chez des souris BALB/c par injection sous-cutanée dorsale avec une aiguille de seringue (calibre 25) à température ambiante. La solution de copolymère injectée (S3, 25 % en poids) a rapidement formé une saillie ronde ou de forme irrégulière après injection sous-cutanée dans le dos des souris. La figure 6A a montré quelques images typiques prises le 1er jour, la deuxième semaine, la quatrième semaine, la sixième semaine, la huitième semaine et la dixième semaine après l'administration sous-cutanée. A l'observation visuelle, l'hydrogel a maintenu son intégrité volumétrique pendant plusieurs semaines et est devenu plus petit avec le temps, avec une réduction évidente de taille à 6 semaines et une disparition complète à environ la dixième semaine. De plus, l'intensité de l'hydrogel restant a diminué avec le temps. L'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA biodégradable avec une formation rapide de gel in situ et une longue persistance de gel in vivo implique une application prometteuse pour l'administration de médicaments de plus longue durée.

Dégradation in vivo des hydrogels après injection sous-cutanée de 25 % en poids de copolymère dans la solution saline normale dans le dos des souris BALB/c.

(A) entretien du gel in vivo. Les images ont été prises au moment prédéterminé après l'administration sous-cutanée. Les images étaient représentatives de n = 3 à chaque instant prédéterminé. L'hydrogel restant est devenu plus petit avec le temps et a complètement disparu à la semaine 10 ; (B) Traces GPC de copolymère PDLLA-PEG-PDLLA recueillies lors de la dégradation in vivo après injection sous-cutanée chez la souris. Le cercle en pointillé accentuait les pics de produits de dégradation de faibles masses moléculaires ; (C) Modification du poids moléculaire normalisé (M(t)/M0) des copolymères dans les hydrogels restants lors de la dégradation in vitro et in vivo. Ici, M0 représentait le MW du copolymère avant dégradation.

De plus, les gels restants à chaque instant ont été collectés et les PM des copolymères récupérés ont été détectés par GPC pour détecter le processus de dégradation. La figure 6B présente les profils dépendant du temps des MW des hydrogels PDLLA-PEG-PDLLA au cours de la dégradation in vivo. Une diminution constante de MW a été illustrée par une augmentation du temps de rétention au fur et à mesure que l'hydrolyse se poursuivait. Différent de la dégradation in vitro, le multimodal, plutôt que l'unimodal, a été observé progressivement au cours de la dégradation in vivo (voir le cercle en pointillé d sur la Fig. 6B), ce qui pourrait être dû à l'élimination lente des fragments dégradés de faible MW dans le sous-cutané couche de souris. Pour la commodité de l'analyse, le changement de poids moléculaire (M(t)) au cours de la dégradation in vitro et in vivo est présenté sur la figure 6C et les diminutions de MW ont été ajustées à peu près linéairement. La comparaison indique que la dégradation in vivo est plus rapide que la dégradation in vitro. La différence peut être causée par une certaine dégradation assistée par une enzyme in vivo, comme cela a été décrit dans un hydrogel de polyester-polyéther biodégradable similaire3.

Les adhérences péritonéales postopératoires sont des conséquences inévitables de la chirurgie abdominale ou pelvienne et peuvent entraîner des complications graves35,36. Parmi les nombreuses stratégies adoptées pour prévenir les adhérences postopératoires, les systèmes de barrière physique sont acceptés comme l'approche la plus efficace. En particulier, les hydrogels thermosensibles biodégradables ont attiré une attention croissante en tant que matériau de barrière d'adhérence postopératoire13,37. Ici, l'efficacité de prévention de l'adhérence de l'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA formé in situ a été évaluée à l'aide d'un modèle de rat de défaut de paroi latérale et d'abrasion intestinale, comme démontré dans (Fig. 7A (a)). Au cours de l'opération, l'augmentation de la température dans la cavité abdominale a favorisé la formation d'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA (S3, 25% en poids) en 2 minutes, se conformant à la forme des défauts appliqués (Fig. 7A (b)). La formulation commerciale transparente anti-adhérence HA s'est rapidement diffusée et a formé une fine couche recouvrant la plaie et les tissus environnants après avoir été injectée dans les défauts (Fig. 7A (c)). Tous les rats ont été sacrifiés et disséqués deux semaines après la chirurgie pour évaluer l'état des adhérences. Certaines des photos typiques ont été présentées sur la figure 7A (d – f) et l'analyse statistique des événements adhésifs a été présentée dans le tableau 2. Lors d'un examen macroscopique, tous les rats du groupe témoin non traité (n = 8) ont souffert du score 3 adhérences, la paroi abdominale lésée adhère fermement au caecum et les conglutinations ne peuvent être séparées que par coupure (Fig. 7A(d)). Bien que la formation d'adhérences ait été réduite dans le groupe traité avec l'hydrogel anti-adhérence HA, la plupart des animaux ont encore développé un score de 1 à 3 adhérences (figure 7A (e)). La performance décevante de l'hydrogel anti-adhérence HA peut être due à son entretien court sur les défauts et à son élimination rapide de la cavité péritonéale. En revanche, parmi les 8 rats traités par l'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA, un seul rat a obtenu des adhérences modérées entre l'omental et l'incision suturée, les animaux restants n'ont souffert d'aucune adhérence et les défauts ont été presque complètement régénérés en 14 jours ( figure 7A(f)). Comparativement à d'autres groupes, les scores d'adhérence médians des animaux traités à l'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA étaient significativement plus faibles (p <0, 05, test μ de Mann-Whitney). Simultanément, l'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA a complètement disparu des sites lésés et n'a pas pu être observé dans les surfaces pariétales et viscérales en raison de la dégradation et de l'absorption de l'hydrogel.

Application in vivo et évaluation de l'effet de prévention de l'adhérence dans le modèle de rat.

Les images étaient représentatives de n = 8. (A) Photographies d'expérimentations animales d'adhérences post-opératoires. (a à c) En exploitation ; (d à f) observations brutes de l'efficacité de la prévention de l'adhérence après 14 jours ; (a et d) Le défaut non traité a été utilisé comme groupe témoin négatif et une adhérence ferme a été observée 14 jours après l'opération ; ( b et e ) Hydrogel HA appliqué sur les sites de blessure et une adhérence modérée a été observée en ( d ); ( c et f ) Les sites de blessure ont été traités par un hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA et aucune adhérence apparente n'a été observée en ( f ), avec une paroi abdominale et un caecum cicatrisés. (B) Micrographies optiques de tranches de déformation HE pour le site lésé 14 jours après la chirurgie. (a) Adhérence entre le caecum défectueux et la paroi abdominale de l'animal sans traitement. (b et c) Paroi abdominale cicatrisée (b) et caecum (c) traités avec l'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA. Une fine couche de tissu remésothélialisé contenant un plus grand nombre de cellules mésothéliales s'est formée sur le site du défaut. ME : cellules mésothéliales ; SK : muscle squelettique de la paroi abdominale ; SM : muscle lisse viscéral ; CE : muqueuse cæcale. Grossissement : 50 ×.

Une observation histologique des sites d'adhérence a également été réalisée, comme le montre la figure 7B. Les tissus prélevés dans le groupe témoin et le groupe hydrogel HA ont montré que la couche musculaire cæcale était entièrement fusionnée à la musculature de la paroi abdominale, avec une grande quantité de tissus inflammatoires intermédiaires. cellules et fibroblastes dans les sites d'adhésion (Fig. 7B (a)). À l'inverse, les défauts traités avec l'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA avaient été réépithélialisés et présentaient des couches de cellules néo-mésothéliales intégrales au-dessus du muscle abdominal ou caecal au 14ème jour, qui étaient similaires à celles des tissus normaux (Fig. 7B(b,c)). Dans l'ensemble, l'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA a montré une efficacité satisfaisante dans la prévention de l'adhésion péritonéale post-opératoire chez le rat.

Nous rapportons un nouveau copolymère tribloc PDLLA-PEG-PDLLA thermogélifiant réversible, qui a subi une transition sol-gel nette lors du chauffage. La température de gélification pourrait être ajustée dans une plage de température physiologiquement importante en modulant le poids de la molécule, la longueur du bloc et la concentration en polymère. On pense que l'agrégation des micelles est impliquée dans la transition sol-gel et qu'aucune cristallisation ne s'est formée pendant la gélification. La gélification s'est avérée thermiquement réversible et les solutions de polymères ont montré une stabilité prononcée de la phase sol à température ambiante. Ainsi, l'injection pouvait être facilement réalisée sans le risque de colmatage de la seringue qui était pratique à administrer. Les investigations in vitro et in vivo ont illustré la biocompatibilité et la biodégradation acceptables du nouvel hydrogel physique. En outre, le système d'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA s'est avéré très efficace pour réduire la formation d'adhérences postopératoires et très pratique à utiliser. Un tel hydrogel injectable, biocompatible, biodégradable et thermoréversible pourrait être considéré comme un biomatériau attrayant pour l'administration prolongée de médicaments, des applications de régénération tissulaire ou d'autres applications médicales.

Poly(éthylène glycol) (PEG, Mn = 1500, 1000, 2000 respectivement), octoate stanneux (Sn(Oct)2, 95%), ε-caprolactone (ε-CL), 3-(4,5-diméthylthiazol-2 -yl)-2,5-diphényl-tétrazolium bromure (MTT) ont été achetés chez Sigma-Aldrich (USA). Le D,L-lactide (D,L-LA) a été acheté auprès de Daigang Chemicals, Jinan, Chine. Le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) a été fourni par Gibco (Grand Island, NY, USA). D'autres agents chimiques utilisés dans ce travail ont été achetés auprès de Kelong Chemical, Co., Ltd., Chengdu, Chine. Ils étaient tous de qualité analytique pure et utilisés tels que reçus.

Des rats Sprague-Dawley (SD) (femelle, 180 ± 20 g) et des souris Balb/c (femelle, 20 ± 2 g) ont été achetés au Experimental Animal Center de l'Université du Sichuan (Chengdu, Chine). Les rats ont été logés dans un environnement spécifique exempt d'agents pathogènes (SPF) avec une température constante de 25 ± 2 ° C et une humidité relative de 50 à 60% sous des cycles de 12 heures-lumière-obscurité. Le libre accès à la nourriture et à l'eau était autorisé. Tous les animaux seraient en quarantaine pendant au moins une semaine avant le traitement. Les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université du Sichuan (Chengdu, Chine) et ont été réalisées conformément aux directives approuvées (IACUC-S200904-P001).

Les copolymères triblocs PDLLA-PEG-PDLLA ont été préparés par copolymérisation par ouverture de cycle du D,L-lactide en présence de PEG en utilisant l'octoate stanneux comme catalyseur. Un copolymère PDLLA-PEG-PDLLA typique avec un poids moléculaire de 4 500 Da (marqué comme L1500-E1500-L1500) a été synthétisé comme suit : en bref, le PEG (20,00 g, 13,33 mmol) a été chauffé sous vide à 100 °C pendant 1 h pour éliminer les traces d'eau. Après refroidissement du flacon à température ambiante, du D,L-lactide (40,00 g, 277,78 mmol) et du Sn(Oct)2 (0,18 g, 0,44 mmol) ont été ajoutés. La réaction a été effectuée à 140°C pendant 12 h sous protection d'argon. Enfin, le copolymère séquencé PDLLA-PEG-PDLLA résultant a été dissous dans de l'éthanol (60 ml) et reprécipité à partir du filtrat en utilisant un excès de n-pentane pré-froid (600 ml), le sédiment a été séché sous vide à poids constant à 45 ° C. D'autres copolymères PDLLA-PEG-PDLLA de poids moléculaire et de blocs différents ont été synthétisés de manière similaire. Dans cet article, les copolymères ont été désignés par LB – EA – LB (PLEL), où A et B représentent respectivement les poids moléculaires moyens en nombre théoriques (Mn) des blocs PEG et PDLLA. À titre de comparaison, des copolymères triblocs PCL-PEG-PCL (PCEC, 1000-1000-1000) ont été préparés par copolymérisation par ouverture de cycle de ε-CL initiée par PEG, ce qui a été rapporté précédemment par notre groupe26. La liste complète de la synthèse de tous les copolymères se trouve dans le tableau supplémentaire S1.

Les spectres 1H-RMN (dans CDCl3) ont été réalisés à température ambiante avec un spectromètre Varian 400 (Varian, USA) à 400 MHz pour caractériser la composition chimique des copolymères. Les échantillons ont été dissous dans du CDC13 et les déplacements chimiques ont été donnés en ppm en utilisant le tétraméthylsilane (TMS) comme référence interne. La GPC (Agilent 110 HPLC, USA) a également été utilisée pour déterminer le poids macromoléculaire et la distribution du poids macromoléculaire des copolymères préparés. Les échantillons ont été dissous dans du tétrahydrofuranne (THF) fraîchement distillé à une concentration de 1 mg/ml. Le THF a été élué à un débit de 1,0 ml/min. Les poids moléculaires des échantillons ont été calibrés avec du polystyrène (PS) comme standard.

Les micelles de copolymère PDLLA-PEG-PDLLA auto-assemblées dans l'eau ont été caractérisées par des mesures de microscopie électronique à transmission (TEM) et de diffusion dynamique de la lumière (DLS). La morphologie des micelles a été observée au microscope électronique à transmission (TEM, H-6009IV, Hitachi, Japon). Avant observation, les échantillons ont été préparés en plaçant une goutte de suspension de micelles (0,1 % en poids, 20 °C) sur une grille de cuivre recouverte de nitrocellulose. Ensuite, elles ont été colorées négativement avec de l'acide phosphotungstique et séchées à l'air. La diffusion dynamique de la lumière (Nano-ZS 90, Malvern, Worcestershire, Royaume-Uni) a été utilisée pour déterminer la distribution de taille des micelles aux concentrations de copolymère de 1 % en poids et 10 % en poids. Les mesures ont été effectuées à des températures croissantes de 4 ° C à 45 ° C et chaque température a été maintenue pendant 10 minutes à l'équilibre avant la mesure.

Les températures de transition de phase sol (écoulement) - gel (pas d'écoulement) des copolymères dans l'eau ont été déterminées à l'aide de la méthode d'inversion du tube à essai avec un tube à essai de flacon de 4 ml d'un diamètre intérieur de 10 mm à un intervalle de température de 1 ° C, de 0 °C à la température à laquelle les précipitations se sont produites. La transition de phase a été observée visuellement en inversant les flacons et un gel a été défini lorsqu'aucun écoulement significatif n'a été observé en 1 min, comme décrit dans les articles rapportés13,23. La température de transition est une moyenne de trois mesures pour chaque point.

Des mesures rhéologiques des solutions de copolymère PDLLA-PEG-PDLLA avec des concentrations déterminées ont été réalisées en utilisant un rhéomètre HAAKE Rheostress 6000 (Thermo Scientific, USA) utilisant des plaques parallèles. Les échantillons froids ont été placés entre des plaques parallèles d'un diamètre de 20 mm et avec un espace de 1 mm et soigneusement recouverts d'une fine couche d'huile de silicone à faible viscosité pour minimiser l'évaporation du solvant. Au cours des expériences de balayage de température, les vitesses de chauffage et de refroidissement étaient de 1 °C/min. Le module de stockage (G') et le module de perte (G") ont été mesurés en fonction de la température. Les données ont été recueillies sous une contrainte contrôlée (4,0 dyn/cm2) et une fréquence de 1,0 Hz. Temps de gélification des solutions de copolymère à 37 °C ont également été étudiés, où les G' et G" ont été enregistrés en fonction du temps. Le temps de gélification a été défini comme le moment où G' est devenu supérieur à G". Le changement de G' de la solution de copolymère PCL-PEG-PCL (PCEC) (20 % en poids) sous le processus de chauffage et de refroidissement a également été étudié à des fins de comparaison.

Des tests de microscopie optique polarisée de la solution de copolymère PDLLA-PEG-PDLLA (PLEL) (25% en poids) et de la solution de copolymère PCL-PEG-PCL (PCEC) (20% en poids) ont été effectués à l'aide d'un microscope optique polarisé (Olympus; Bh -753pw) pour étudier la morphologie lors de la gélification. La solution aqueuse de polymère a été placée entre deux lames de verre et l'image microscopique a été photographiée à 0 min et 1 heure à 20 °C. Ensuite, les images microscopiques optiques polarisées du gel formé instantanément en chauffant la lame à 37 ° C ont également été réalisées.

Des analyses cristallographiques ont été effectuées sur l'hydrogel de copolymère PDLLA-PEG-PDLLA (PLEL) et l'hydrogel PCL-PEG-PCL (PCEC) par diffraction des rayons X PHILIPS (XRD, X' Pert Pro, MPDDY 1291) en utilisant le rayonnement Cu KR. Les échantillons ont été balayés de 10° à 60° à une vitesse de balayage de 1°/min.

Des cellules murines L929 et des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) (American Type Culture Collection, Rockville, MD) ont été choisies pour évaluer la cytotoxicité cellulaire du polymère synthétisé et de l'hydroge par dosage MTT. Les cellules ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Gibco) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, Gibco, USA), additionné de 50 U/ml de pénicilline et 50 U/ml de streptomycine à 37 °C dans 5 % de CO2. Tout d'abord, l'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA préparé a été extrait à l'aide de DMEM avec 10 % de FBS pendant 24 h. Ensuite, des dilutions séquentielles de la solution mère ont été effectuées pour obtenir une série de concentrations des lixiviats. Les suspensions cellulaires ont été distribuées dans une plaque de 96 puits à une densité de 3 × 104 cellules/puits et incubées pendant 24 h. Le milieu a ensuite été remplacé par du milieu frais avec une concentration différente de copolymère PDLLA-PEG-PDLLA ou de lixiviats d'hydrogel et incubé jusqu'à 48 h supplémentaires. Par la suite, 20 μl de MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-tétrazolium, Sigma-Aldrich, 5 mg/ml) ont été ajoutés à chaque puits et les cellules ont été encore incubées. à 37 °C pendant encore 4 h. Le formazan précipité a été dissous dans 150 µl de DMSO et l'absorbance à 570 nm a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques ELISA (Bio-Rad). La cytotoxicité a été définie comme la viabilité relative (%), sans copolymère séquencé ni lixiviat d'hydrogel dans le milieu de culture à 100 %. Toutes les données ont été exprimées en moyenne ± SD (n = 5).

Le test hémolytique a été réalisé sur une solution de copolymère PDLLA-PEG-PDLLA (S3) dans la solution saline normale in vitro selon la méthode rapportée3,33. Dans cette expérience, des échantillons de 2,5 ml avec différentes concentrations ont été ajoutés à 2,5 ml de suspension d'érythrocytes de lapin hors fibre (2 %) dans une solution saline normale et incubés à 37 °C °C. Une solution saline normale et de l'eau distillée ont été utilisées comme contrôle négatif et positif, respectivement. Après incubation à 37 °C pendant 3 h, la suspension d'érythrocytes a été centrifugée à 2 000 tr/min pendant 10 min, puis la couleur du surnageant a été comparée. Une solution de surnageant achromatique absolue implique qu'il n'y a pas d'hémolyse. En revanche, une solution de surnageant rouge signifie une hémolyse. Ensuite, le surnageant de la suspension d'érythrocytes a été collecté et détecté sur un spectrophotomètre UV/Vis (Lambda 35, Perkin Elmer) à 540 nm pour déterminer le rapport hémolytique. Le taux hémolytique a été calculé selon l'équation suivante :

Tous les résultats ont été estimés à partir des données de trois expériences indépendantes et toutes les données ont été exprimées sous forme de moyenne ± SD (n = 3).

Le comportement de dégradation in vitro de l'hydrogel a été mesuré par la méthode du rapport précédent dans des conditions physiologiques simulées25. En bref, la solution aqueuse polymère (25 % en poids, 1 ml) a été injectée dans un tube à essai et incubée dans un bain agité à 37 °C avec 50 coups/min. Après 10 min, 9 ml de solution PBS (pH 7,4) ont été ajoutés aux gels formés. La solution tampon a été remplacée par une nouvelle tous les 4 jours pour maintenir le pH du milieu. A des moments prédéterminés, certains échantillons ont été retirés du bain d'agitation, le tampon a été retiré et les gels restants ont été lyophilisés jusqu'à un poids constant. Pour l'analyse de l'échantillon séché, des expériences de 1H RMN et GPC ont été réalisées. Le changement de pH du milieu a été mesuré avec un pH-mètre à des intervalles de temps désignés avant que le milieu ne soit remplacé par un nouveau.

Des tests de formation et de dégradation de gel in vivo lors d'une administration sous-cutanée dorsale ont été réalisés chez des souris BALB/c. Des solutions aqueuses de 0, 5 ml de copolymère tribloc PDLLA-PEG-PDLLA (25% en poids dans la solution PBS, pH 7, 4) ont été injectées par voie sous-cutanée dorsale à des souris par une seringue avec une aiguille de calibre 25 à température ambiante. A un moment prédéterminé, trois souris ont été sacrifiées par dislocation cervicale. Les sites d'injection ont été soigneusement ouverts puis des photographies des gels restants ont été prises. Les gels restants chez les animaux ont été prélevés pour des analyses de MW par GPC. Pendant ce temps, les muscles entourant les implants sous-cutanés et les principaux organes, notamment le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins, ont été enlevés chirurgicalement, suivis d'une coloration à l'hématoxyline-éosine (HE) pour un examen histopathologique plus approfondi.

L'efficacité anti-adhésion de l'hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA a été testée à l'aide d'un modèle de rat Sprague-Dawley (SD) d'abrasion de défaut de paroi latérale-caecum31,37. Dans cette étude, vingt-quatre rats SD étaient des animaux modèles et ont été répartis au hasard en trois groupes (n = 8). Tous les animaux modèles ont été traités sans cruauté au cours de l'étude.

En chirurgie, la technique aseptique a été appliquée tout au long de la période expérimentale. Les rats ont été complètement anesthésiés par injection intrapéritonéale d'hydrate de chloral (10 %, 3 ml/kg) et placés en décubitus dorsal, rasés dans la région abdominale, après quoi l'abdomen a été exposé par une incision médiane ventrale. Les adhérences abdominales ont été induites selon la méthode de Yoon Yeo. et al.31. Tout d'abord, un défaut péritonéal pariétal de 2 × 2 cm avec une hémorragie ponctuée a été créé à l'aide d'un scalpel dans la paroi abdominale latérale droite jusqu'à ce que le péritoine ainsi que la couche musculaire partielle sous-jacente soient excisés de la paroi abdominale. Deuxièmement, 2 cm2 de la séreuse cæcale ont été abrasés avec une gaze chirurgicale sèche stérile jusqu'à ce qu'un suintement de sang soit observé à partir de la séreuse mais non perforé. Ensuite, les deux surfaces lésées ont été juxtaposées avec des sutures de soie 3-0 afin de se mettre en contact. Pour le groupe de traitement, 1 ml de la solution PDLLA-PEG-PDLLA (25 % en poids dans la solution PBS, pH 7,4) a été uniformément peint sur le défaut de la paroi abdominale ainsi que sur la surface endommagée du caecum, respectivement. On a laissé l'hydrogel se gélatiniser complètement (environ 2 min). Ensuite, les incisions de tous les animaux ont été fermées en deux couches avec de la soie chirurgicale 3/0. Pour le groupe témoin positif, le défaut a été traité avec 1 ml d'hydrogel HA (un hydrogel d'acide hyaluronique anti-adhésion commercialisé, Xinkeling®). Les huit rats restants avec des défauts non traités ont servi de témoins négatifs. Deux semaines après la chirurgie, les rats ont été sacrifiés par dislocation cervicale et l'efficacité anti-adhérente a été évaluée par deux observateurs en double aveugle. Chaque animal a été évalué selon le système de notation d'adhérence standard suivant, qui a été largement utilisé dans ce domaine : score 0 = pas d'adhérence ; score 1 = adhérence légère, adhérence intestinale facilement séparable ; score 2 = adhérence intestinale modérée, séparable par dissection mousse ; score 3 = adhérence intestinale sévère, adhérence nécessitant une dissection fine38. De plus, nous avons prélevé des échantillons du caecum endommagé, de la paroi abdominale endommagée et des tissus associés à l'adhésion. Ensuite, les spécimens obtenus ont été fixés dans du formol à 10%, inclus dans de la paraffine, sectionnés et colorés avec une coloration HE pour les examens histologiques.

L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel SPSS 15.0 (Chicago, IL, USA). Les résultats sont exprimés en moyenne ± ET. Étant donné que les scores d'adhérence ne suivaient pas toujours une distribution normale, des inférences statistiques ont été faites à l'aide des tests μ de Mann-Whitney. La signification statistique a été déterminée comme P ≤ 0,05.

Comment citer cet article : Shi, K. et al. Synthèse, caractérisation et application de thermogels de copolymère PDLLA-PEG-PDLLA réversibles in vitro et in vivo. Sci. Rep. 6, 19077; doi : 10.1038/srep19077 (2016).

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Ce travail a été soutenu financièrement par National High-Tech Project of China (863-Project, 2015AA020316), National Natural Science Foundation (NSFC31525009 et 31222023) et International Science & Technology Cooperation Program of China (2013DFG52300).

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Kun Shi, Ya-Li Wang, Ying Qu, Jin-Feng Liao, Bing-Yang Chu, Hua-Ping Zhang, Feng Luo et Zhi-Yong Qian

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Z.-YQ et KS ont réalisé la conception de l'étude et sa coordination. KS a réalisé toutes les expériences, analysé les données et rédigé le manuscrit. FL a discuté des données. Y.-LW et B.-YC ont participé à la synthèse des matériaux. YQ, J.-FL et H.-PZ ont réalisé l'étude animale et l'analyse statistique. Tous les auteurs ont revu le manuscrit.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

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Réimpressions et autorisations

Shi, K., Wang, YL., Qu, Y. et al. Synthèse, caractérisation et application de thermogels de copolymère PDLLA-PEG-PDLLA réversibles in vitro et in vivo. Sci Rep 6, 19077 (2016). https://doi.org/10.1038/srep19077

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Reçu : 09 septembre 2015

Accepté : 03 décembre 2015

Publié: 11 janvier 2016

DOI : https://doi.org/10.1038/srep19077

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