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Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 4101 (2023) Citer cet article

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L'expression et la purification de la myosine sont importantes pour la compréhension mécaniste de la fonction normale et des changements induits par les mutations. Ce dernier est particulièrement important pour la myosine II du muscle strié où les mutations provoquent plusieurs maladies débilitantes. Cependant, la chaîne lourde de cette myosine est difficile à exprimer et le protocole standard, utilisant des cellules C2C12, repose sur une infection virale. Cela demande beaucoup de temps et de travail et est associé à des exigences infrastructurelles et à des risques biologiques, limitant une utilisation généralisée et entravant la génération rapide d'un large éventail de mutations. Nous développons ici une méthode sans virus pour surmonter ces défis. Nous utilisons ce système pour transfecter des cellules C2C12 avec le domaine moteur de la chaîne lourde de la myosine cardiaque humaine. Après avoir optimisé les conditions de transfection cellulaire, de culture et de récolte, nous avons caractérisé fonctionnellement la protéine exprimée, co-purifiée avec les chaînes légères essentielles et régulatrices murines. La vitesse de glissement (1,5–1,7 µm/s ; 25 °C) dans le test de motilité in vitro ainsi que l'activité catalytique maximale activée par l'actine (kcat ; 8–9 s−1) et la concentration d'actine pour une activité semi-maximale (KATPase ; 70 –80 µM) étaient similaires à celles trouvées précédemment en utilisant une infection à base de virus. Les résultats devraient permettre de sélectionner de nouveaux types d'études, par exemple le dépistage d'un large éventail de mutations pour une caractérisation plus poussée.

Les myosines sont des moteurs moléculaires qui développent une force et un mouvement en interagissant avec les filaments d'actine dans un processus cyclique entraîné par le renouvellement de l'ATP. Ce processus est à la base d'une variété de fonctions importantes, telles que la contraction musculaire, la motilité/le développement de la force des cellules non musculaires, le transport de fret intracellulaire et la signalisation cellulaire1. Jusqu'à 79 classes2 ont été récemment identifiées dans la superfamille de la myosine. Tous sont construits autour d'une chaîne lourde de myosine (MHC; ~ 90–250 kD) avec un site de liaison à l'actine, un site catalytique ATPase et d'autres éléments importants pour la fonction motrice ainsi que pour la formation de filaments et la liaison à la cargaison. De plus, des chaînes légères, aux rôles stabilisateur, modulateur et régulateur, sont attachées à chacune des chaînes lourdes. Pour mieux comprendre les mécanismes de base de la fonction motrice de la myosine, mais aussi pour des études détaillées des mutations pathogènes, il est important de pouvoir exprimer et purifier tous les composants protéiques mentionnés.

Le système le plus utilisé pour exprimer et purifier les protéines repose sur E. coli en tant qu'hôte d'expression, ce qui se traduit par des rendements de purification élevés (si le produit d'expression est soluble) ainsi que par la main-d'œuvre et la rentabilité3. Cependant, le système procaryote manque de machinerie cellulaire complète pour aider au repliement approprié et à la modification post-traductionnelle des protéines eucaryotes. Alors que l'expression et la purification des chaînes légères de myosine fonctionnelles sont possibles en utilisant E. coli, les chaînes lourdes de myosine (CMH) ne peuvent pas être produites sous forme fonctionnelle en utilisant ce système4. Par conséquent, une variété de systèmes d'expression et de purification eucaryotes basés sur Dictyostelium5,6,7, Drosophila melanogaster8, des cellules d'insectes9,10,11,12,13,14 et des cellules de mammifères15,16 ont été développés. Bien que ces systèmes fonctionnent bien pour la production d'une variété de classes de CMH, ils ont eu un succès limité avec les myosines des muscles striés des vertébrés, probablement en raison de l'incapacité à inclure toute la machinerie de repliement des protéines des cellules musculaires. Bien qu'un certain nombre d'articles aient identifié l'UNC-45 comme un chaperon impliqué dans le repliement de la myosine et l'assemblage des sarcomères20,21,22,23,24, il semble y avoir d'autres facteurs impliqués, tels que Hsp70/Hsp9025 et la chaperonine26. Conformément à ce point de vue, Winkelmann et ses collègues ont présenté des preuves que le repliement approprié des myosines musculaires striées en une forme entièrement fonctionnelle ne se produit que dans un environnement musculaire différencié, c'est-à-dire les myotubes musculaires. Sur la base de cette idée, les myoblastes C2C12 de souris qui se différencient en myotubes ont été introduits comme lignée cellulaire hôte d'expression de choix27. Les myoblastes ont été transfectés avec des plasmides portant le CMH du muscle squelettique embryonnaire de poulet sous un promoteur, ce qui garantit que l'expression du CMH ne commence que lors de la différenciation en myotubes. Le rendement de purification était suffisant pour évaluer la fonction de la myosine sur la base de l'activité ATPase activée par l'actine. La génération de lignées cellulaires stables27 dans cette première version du système d'expression et de purification basé sur C2C12 ("système basé sur C2C12" d'ici) offre des rendements de purification relativement élevés avec un flux de travail rapide et rentable éliminant les cycles de transfection. Cependant, le développement d'une lignée cellulaire stable peut nécessiter jusqu'à 12 mois30 et ne serait pas la meilleure approche pour examiner plusieurs constructions différentes (par exemple des mutations ponctuelles) d'une myosine particulière. En revanche, l'expression transitoire offre l'avantage d'un temps de développement court et d'une rotation rapide30. Ainsi, le système basé sur C2C12 a ensuite été modifié en utilisant l'expression transitoire d'adénovirus pour introduire et étudier l'impact des mutations ponctuelles de la myosine associées aux cardiomyopathies hypertrophiques31. Le même système a été optimisé par Resnicow et al.32 pour permettre la production de quantités suffisantes de CMH pour l'analyse cinétique transitoire des isoformes de myosine squelettique et cardiaque humaines recombinantes33,34,35. Il convient de noter que des activités ATPase considérablement plus élevées ont été obtenues pour la myosine β-cardiaque de type sauvage (WT) et mutante dans ces études que dans un rapport précédent19 où des mutants de myosine β-cardiaque humaine étaient exprimés et purifiés à partir de cellules d'insectes. Actuellement, l'infection à base d'adénovirus des myotubes C2C12 permet la production de quantités suffisantes de myosines musculaires striées correctement pliées et fonctionnelles (constructions de type S1 et HMM) pour des études fonctionnelles critiques, entre autres, des tests de motilité in vitro et une cinétique de solution biochimique transitoire.

Alors que le système basé sur C2C12, reposant sur la délivrance de gènes viraux, donne un rendement élevé de protéines fonctionnelles, il demande beaucoup de temps et de travail et est coûteux par rapport à d'autres systèmes basés sur des cellules de mammifères. Cela est dû à la fois à la méthode de délivrance de gènes basée sur les adénovirus et au mode adhérent de croissance des cellules C2C12. En ce qui concerne l'utilisation d'adénovirus, cela demande du temps et du travail, par exemple en raison de l'exigence d'une série d'étapes d'enrichissement et de purification à l'aide d'une lignée cellulaire humaine (par exemple, HEK293) pour obtenir un titre de virus suffisant37,38. D'autres contraintes liées à la délivrance de gènes à base de virus comprennent le clonage par étapes de très gros plasmides qui doivent inclure des séquences génétiques virales39. Cela limite la taille de l'insert et la possibilité de mutagenèse du virus ou de la lignée cellulaire40. De plus, la manipulation de virus présente un danger potentiel pour le personnel et nécessite un niveau de sécurité plus élevé de l'infrastructure de laboratoire avec une formation supplémentaire du personnel. Ces exigences rendent le système basé sur C2C12 moins accessible pour une utilisation de routine8. Ce qui manque à cet égard, c'est une méthode de transfection efficace sans virus.

Les cellules musculaires, comme les myoblastes C2C12, en particulier sous leur forme différenciée (par exemple, les myotubes et les cardiomyocytes) sont cependant connues pour être difficiles à transfecter41. Les méthodes chimiques non virales couramment utilisées pour l'administration de gènes in vitro (par exemple la polyéthylèneimine, le phosphate de calcium) étaient fréquemment associées à une faible efficacité, une inefficacité des coûts et une faible survie cellulaire41,42,43,44,45,46,47. Les montages expérimentaux ont donc été limités à de petites échelles de cultures de myoblastes à faible confluence. Les méthodes physiques telles que l'électrotransfert de gènes par électroporation peuvent être très efficaces. Cependant, ils sont à nouveau limités par les besoins en équipement spécial et le mode d'action à petite échelle48,49,50. Pour la purification des protéines, il est crucial que la méthode de délivrance de gènes soit non seulement efficace et compétitive, mais également facilement applicable à des volumes cellulaires plus importants51, expliquant pourquoi l'expression génique transitoire dans les cellules C2C12 a été dominée par la délivrance de gènes viraux52.

Plus récemment, cependant, la disponibilité d'agents de transfection chimiques non viraux s'est élargie et le coût a été réduit. Certains fournisseurs proposent même des protocoles (notes d'application) pour transfecter des cellules C2C12 avec une efficacité élevée promise. Ici, nous avons examiné un tel kit de transfection d'ADN disponible dans le commerce et abordable, Polyplus JetPrime. A notre connaissance, le réactif de transfection JetPrime n'a pas été utilisé auparavant dans la production de myosine musculaire striée à l'aide de cellules C2C12. Son utilisation nous a permis de développer un protocole détaillé pour l'expression transitoire et la purification des chaînes lourdes de la myosine cardiaque humaine (β-MHC) dans les cellules C2C12. Nous démontrons l'efficacité de l'approche en exprimant et en purifiant le β-MHC humain suivi d'une validation dans des tests fonctionnels. Dans l'ensemble, la comparaison de nos résultats avec les données précédentes, reposant sur la délivrance de gènes à base de virus53,54,55, montre des différences fonctionnelles minimes, à condition que la longueur de la construction de myosine et la composition de la chaîne légère soient similaires. Nous prévoyons que nos résultats devraient rendre le système d'expression et de purification basé sur C2C12 plus attrayant et accessible pour la production de CMH dans les muscles striés. Notamment, la génération sensiblement plus rapide de mutants et la purification de protéines plus sûres que dans les systèmes à base de virus seraient avantageuses lorsque le but est d'étudier une grande variété de mutations, par exemple dans les (cardio) myopathies56,57,58.

La production de protéines recombinantes au moyen de la technique d'expression génique transitoire dépend fortement de l'efficacité de la transfection. En général, les paramètres de transfection doivent être optimisés pour chaque combinaison de réactif de transfection et de plasmide, portant le gène d'intérêt (GOI), afin d'assurer des rendements efficaces de purification des protéines. Ici, nous utilisons le réactif de transfection JetPrime qui, à notre connaissance, n'a pas été utilisé auparavant pour la production de myosine musculaire striée dans les cellules C2C12. Même si ce réactif de transfection est accompagné d'un protocole (note d'application) pour les cellules C2C12, nous avons retesté les paramètres de transfection à l'aide de notre plasmide de travail, portant la construction du domaine moteur de la myosine β-cardiaque (S1L; Fig. 1A). Cette construction, codon optimisé pour l'expression dans des lignées de cellules hôtes d'origine murine, est assez similaire à celles utilisées précédemment pour la transfection à base de virus d'un long sous-fragment de myosine 1 (aa 1–843; S1L) dans des cellules C2C12 (tableau S1). Cependant, notre plasmide est fusionné à une protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) avec une étiquette FLAG à son extrémité C-terminale, plutôt qu'à une étiquette Avi comme dans les travaux précédents avec S1L. L'eGFP est une étiquette utile à plusieurs égards, notamment pour le suivi de la progression de l'expression, l'immobilisation de surface dans le test de motilité in vitro et la localisation du domaine moteur de la myosine dans des études à molécule unique (cf. résultats préliminaires sur la Fig. S1). Le mode de transfection repose sur des complexes ADN:JetPrime correctement formés. La quantité des deux ingrédients, et en particulier leur rapport, sont donc des paramètres importants, qui peuvent dépendre du plasmide utilisé (par exemple, en raison de la différence de taille du plasmide, de la structure et de la conformation du plasmide). Dans un premier temps, nous avons donc testé l'efficacité de la transfection à différents ratios ADN : JetPrime. Comme on le voit sur la figure 1B, l'efficacité de la transfection est restée optimale pour une large gamme de rapports, et l'efficacité n'a commencé à décliner qu'aux rapports les plus élevés testés. Sur la base des résultats, nous avons conservé le rapport 1:2 pour d'autres expériences, comme recommandé dans la note d'application de l'entreprise. Le paramètre suivant que nous avons testé était la quantité d'ADN par nombre de cellules ensemencées. La note d'application de la société suggère 0,75 µg par 4 × 104 cellules, ensemencées dans un puits d'une plaque à 24 puits. Pour un puits de plaque à 12 puits avec une surface de puits environ deux fois plus grande (telle qu'utilisée dans notre étude), cela correspond à 1,5 µg d'ADN par 8 × 104 cellules ensemencées par puits. Nous avons testé la quantité d'ADN recommandée et quelques valeurs plus élevées, ce qui peut parfois améliorer la faible transfection. Les résultats de la figure 1C démontrent que des quantités d'ADN plus élevées n'améliorent pas l'efficacité de la transfection ; ils ont plutôt conduit à son déclin. Ainsi, nous avons conservé la quantité d'ADN recommandée par nombre de cellules ensemencées pour d'autres expériences.

Optimisation de la transfection et de l'expression. (A) Cartoon64 de construction d'expression avec des résidus d'acides aminés désignés de parties spécifiques. (B) Efficacité de transfection à différents rapports ADN:JetPrime. Notez la gamme efficace relativement large où 1: 2 a été choisi pour les expériences ultérieures. (C) Efficacité de transfection à différentes quantités de plasmide (ADN) par nombre de cellules ensemencées (ici 8 × 104 cellules). La quantité de 1,5 µg a été choisie pour les expériences ultérieures. (D) Efficacité de transfection pour augmenter le nombre d'ensemencement cellulaire et deux périodes de croissance après l'ensemencement (24 et 48 h) avant la transfection cellulaire. Notez que l'augmentation du nombre de cellules n'a pas amélioré la transfection cellulaire ; l'ensemencement du plus petit nombre de cellules en croissance pendant 2 jours a donné la meilleure efficacité de transfection. (E) Efficacité de transfection évaluée à chacun des 8 jours après la transfection. En bas à droite : Efficacité de transfection estimée en tant que fraction de la zone avec fluorescence GFP. En haut à droite : Western blot utilisant des anticorps anti-FLAG utilisés pour quantifier la quantité de construction exprimée. La tache originale est présentée dans la Fig. S2 supplémentaire. Tous les graphiques à barres avec des données individuelles représentent la moyenne ± SD de 3 à 6 images (champ de vision) par boîte de culture cellulaire (puits). Les barres d'échelle représentent 100 µm.

Comme indiqué dans l'introduction, le pliage correct des myosines musculaires striées ne se produit que dans les myotubes différenciés. Ainsi, il est important que les myoblastes C2C12 entrent dans le processus de différenciation dès que possible après la transfection. Ceci peut être réalisé plus efficacement lorsque les myoblastes sont entièrement confluents. Dans la note d'application du fabricant, la densité optimale des cellules d'ensemencement résulte à une confluence cellulaire de 60 à 70 % au moment de la transfection. La confluence inférieure est généralement bénéfique pour l'efficacité de la transfection. Cependant, dans notre cas, cela retarde la différenciation des myotubes la plus nécessaire. Nous avons donc examiné l'efficacité de la transfection à plusieurs densités d'ensemencement de cellules différentes et en utilisant deux points de temps différents pour la transfection après l'ensemencement des cellules (c'est-à-dire des cellules en croissance pendant 24 ou 48 h avant la transfection). L'objectif était d'atteindre près de 100 % de confluence cellulaire au moment de la transfection. Notre principale découverte était que l'utilisation du nombre d'ensemencement cellulaire recommandé de 8 × 104 par puits, mais la transfection 48 h après l'ensemencement cellulaire au lieu des 24 h recommandées, entraînait l'efficacité de transfection la plus élevée (Fig. 1D). La confluence cellulaire à ce moment-là était également proche de 100 %, ce qui assurait une progression rapide vers la différenciation et la formation de myotubes. Sur la base de ces expériences, le nombre d'ensemencement cellulaire recommandé a été utilisé dans notre protocole final utilisant des boîtes de culture de 60 mm de diamètre où les cellules ont été cultivées pendant 36 h avant la transfection. Ici, 36 h au lieu de 48 h (Fig. 1D) ont été utilisées sur la base d'expériences pilotes avec des boîtes de culture cellulaire de 60 mm.

Enfin, nous avons déterminé le temps de récolte cellulaire optimal après la transfection pour une expression protéique plus élevée. Comme on peut le voir sur la figure 1E, l'expression a augmenté au fil du temps en termes de surface totale de cellules transfectées ainsi que de quantité de protéine exprimée, évaluée par Western blot, montrant une tendance à la saturation aux jours 7 à 8.

L'analyse ci-dessus est à la base du protocole optimisé et de son adaptation à une transfection à plus grande échelle à l'aide de plusieurs boîtes de culture cellulaire de 60 mm pour exprimer la construction S1L de myosine β-cardiaque (S1L-eGFP-FLAG, Fig. 1A). Ce protocole est décrit en détail dans les procédures expérimentales. Après la récolte des cellules au jour 7 après la transfection, les cellules ont été lysées et la construction S1L a été capturée à partir du lysat cellulaire (Fig. 2A en haut) à l'aide d'une résine de purification constituée de billes à l'échelle micrométrique décorées d'anticorps anti-FLAG. La protéine liée a été éluée par compétition avec un excès de peptide FLAG libre (Fig. 2A en bas). Un gel de protéine SDS-PAGE représentatif (Fig. 2B) montre une préparation de myosine purifiée où la construction S1L est co-purifiée avec des chaînes légères de souris endogènes. Certains autres contaminants protéiques mineurs sont la conséquence des liaisons non spécifiques du lysat cellulaire aux anticorps anti-FLAG sur les billes de purification, comme le suggèrent les résultats du gel de purification simulé. Comme évalué par l'absorption d'eGFP à 488 nm jusqu'à 0,08 µg et en moyenne 0,04 ± 0,02 µg (moyenne ± SD, n = 5) par cm2 de cellules transfectées a été atteint. Ainsi, la purification des protéines à l'aide de cellules provenant de dix boîtes de culture de 60 mm a donné jusqu'à 13 µg de protéines à une concentration de 1,4 µM.

Purification par affinité à l'aide d'une résine d'anticorps anti-FLAG (billes). (A) Haut : GFP-fluorescence des billes après avoir capturé les protéines exprimées via l'étiquette FLAG. En bas : billes (présentées dans les mêmes conditions de microscopie qu'en haut) montrant une perte de fluorescence après élution avec le peptide FLAG 3X. Barres d'échelle : 200 µm. (B) Gauche : analyse d'élution SDS-PAGE montrant la construction S1L-eGFP-FLAG de chaîne lourde de myosine β-cardiaque humaine purifiée (voie 1, MHC ; 125,5 kDa) co-purifiée avec des ELC murins (~ 23 kDa) et des RLC (~ 19 kDa). À droite : Purification simulée à l'aide de cellules C2C12 non transfectées montrant que de petits contaminants protéiques (piste 2) sont le résultat d'une liaison non spécifique du lysat cellulaire à la résine qui a co-élué après incubation avec le peptide 3X FLAG. Les gels originaux sont présentés dans la Fig. S3 supplémentaire.

Nous avons ensuite procédé à la caractérisation de la construction de myosine purifiée en mesurant l'état d'équilibre de l'ATPase basale et activée par l'actine à l'aide d'un test couplé au NADH. Les données spectrophotométriques pour l'activité ATPase à l'état d'équilibre de S1L-eGFP-FLAG sont illustrées sur les Fig. 3A et B avec les paramètres cinétiques résumés dans le tableau 1. L'actine a augmenté l'activité ATPase à l'état d'équilibre de S1L-eGFP-FLAG d'environ 200 fois (de kbasal ~ 0,04 à kcat ~ 8 s−1), avec une KATPase ~ 80 µM, qui est la concentration d'actine à la moitié de l'activité ATPase maximale (tableau 1). Un test plus sensible en termes de fraction de têtes actives dans l'échantillon S1L-eGFP-FLAG purifié est le test de motilité in vitro (IVMA) où le glissement des filaments d'actine est observé par des protéines motrices attachées à la surface. Les résultats IVMA de deux expériences indépendantes d'expression et de purification sont présentés sur les figures 3C et D (films S1-S2). Les vitesses de glissement des filaments d'actine étaient en moyenne de 1, 5 et 1, 8 µm / s pour les deux préparations (Fig. 3C, Tableau 1). Comme dans les études précédentes, en utilisant un fragment moteur S1 plus court (sS11-808aa) 35, 59, 60, l'élimination des têtes inactives par purification par affinité ("deadheading") était nécessaire pour obtenir une bonne motilité. La fraction de filaments mobiles (FMF) atteint en moyenne 60 et 69%, avec respectivement un et deux deadheadings (Fig. 3D, Tableau 1). Malheureusement, nous n'avons trouvé aucune donnée pour la fraction de filaments mobiles dans des travaux antérieurs utilisant S1L obtenus avec la transfection virale à des fins de comparaison.

Analyses fonctionnelles de la construction S1L β-cardiaque humaine purifiée co-purifiée avec des chaînes légères de myosine murine. (A) évolutions temporelles du renouvellement de l'ATP, en utilisant un dosage couplé au NADH, avec [S1L-eGFP-FLAG] et [MgATP] constants mais avec [F-actine] (concentration relative aux monomères) à 5 (a), 10 ( b), 15 (c), 20 (d), 30 (e), 40 (f), 60 (g), 80 (h) ou 100 (i). (B) Activité ATPase à l'état d'équilibre activée par l'actine en fonction de [F-actine]. La ligne continue à travers les points de données est le meilleur ajustement de l'équation. (1) aux données avec les paramètres les mieux adaptés présentés dans le tableau 1. Les données de trois préparations de protéines indépendantes présentées dans des couleurs différentes. (C) Les vitesses de glissement des filaments d'actine dans le test de motilité in vitro à 25 ° C pour deux préparations de protéines différentes (Prep 1 et Prep 2). Les données sont superposées à la moyenne ± 95 % IC de 25 à 30 filaments pour chaque préparation. (D). La fraction de filaments mobiles après une (pour la Prep 1) ou deux (pour la Prep 2) purifications par affinité ("deadheadings"). Les données sont superposées à l'IC moyen ± 95 % de 5 champs de vision par Flow Cell pour chaque préparation. (E) Vitesses de glissement du filament d'actine en fonction des longueurs de filament (mêmes données que dans C pour Prep 1). (F) Vitesses de glissement du filament d'actine en fonction des longueurs de filament (mêmes données que dans C pour Prep 2). Les lignes horizontales droites en E et F indiquent des valeurs moyennes suggérant une dépendance minimale de la vitesse sur les longueurs de filament à des longueurs > 3 µm.

La densité motrice sur la surface du test de motilité in vitro dépend à la fois de la densité des anticorps orientés de manière appropriée et des conditions d'incubation (temps et concentration) des fragments moteurs de myosine. Alors que nous n'avons pas mesuré la densité motrice, la vitesse presque constante, pour des longueurs de filament d'actine> 3 µm (Fig. 3E, F), suggère que la densité est suffisante pour atteindre la vitesse de glissement maximale qui serait alors limitée par la croix- taux de détachement du pont constant (comme dans le muscle) sans effets du taux d'attachement61,62. Une considération dans l'interprétation des résultats de la Fig. 3E, F est que la vitesse est connue pour saturer pour des filaments suffisamment longs également à de faibles densités de myosine mais à une valeur inférieure61. Cependant, nous sommes néanmoins convaincus que la densité motrice est suffisamment élevée dans notre étude pour motiver la conclusion que la vitesse est limitée par le détachement. Premièrement, la saturation s'est produite déjà à des longueurs de filament d'environ 3 µm plutôt qu'à des longueurs plus longues trouvées à de faibles densités motrices dans l'étude d'Uyeda et al.61. De plus, comme preuve supplémentaire d'une densité motrice suffisante pour donner une vitesse limitée au détachement, les vitesses maximales observées dans notre étude sont similaires à celles trouvées dans des travaux antérieurs utilisant la production de protéines à base d'adénovirus (tableau S1 et Fig. S4) et également cohérentes avec celles trouvé dans les cellules musculaires63.

Le système d'expression et de purification de pointe actuel pour les myosines des muscles striés des vertébrés repose sur le transfert de gènes viraux aux cellules C2C12. Bien que le transfert de gène viral assure une efficacité de livraison de gène élevée et, par conséquent, des rendements d'expression et de purification de protéines élevés, il présente également des inconvénients, comme mentionné dans l'introduction (voir également Fig. S5). Cela explique probablement sa mise en œuvre limitée dans le monde, empêchant la croissance de l'environnement de recherche, entravant à la fois les tests à grande échelle de nouvelles idées et la large confirmation indépendante des résultats antérieurs. En fait, à notre connaissance, seule une poignée de laboratoires dans le monde (par exemple, reflétée dans 32, 33, 34, 53, 65, 66, 67) utilisent avec succès des myosines recombinantes musculaires de vertébrés sur une base régulière. Nous émettons l'hypothèse que le remplacement du transfert de gène viral par une approche plus pratique et conviviale, en ce qui concerne à la fois l'infrastructure et les besoins en personnel, serait un premier pas vers une plus grande convivialité de la méthode. Nous pensons en outre qu'une première étape pour y parvenir consiste à démontrer et à rapporter pleinement une approche simple qui permet la production de fragments moteurs de myosine II de muscle strié purifiés utiles dans les tests fonctionnels de base. Notre méthode de transfection non virale décrite pour les cellules C2C12 basée sur le réactif de transfection JetPrime est une telle approche. Nous avons d'abord testé et optimisé différents paramètres de transfection pour la transfection de la construction S1L-eGFP-FLAG dans des cellules C2C12 pour jeter les bases de la méthode. Dans ce travail, nous avons utilisé une construction (voir Déclaration de disponibilité des données ci-dessous) optimisée pour les codons pour l'expression dans l'arrière-plan de l'hôte de la souris. Nos tests pour optimiser le protocole comprenaient la variation du rapport ADN sur JetPrime, le rapport [ADN] sur cellule, la confluence cellulaire au moment de la transfection et enfin le moment de la récolte des cellules. Alors que certains des tests ont confirmé les valeurs des paramètres de la note d'application de l'entreprise, nous avons constaté que d'autres paramètres nécessitaient une optimisation supplémentaire. Ceci est particulièrement lié au fait qu'un repliement correct de la myosine musculaire nécessite des conditions musculaires matures qui ne sont assurées que dans les myotubes C2C12 différenciés et non au stade myoblaste. En conséquence, le transfert de gène viral est souvent effectué au stade myotube (cependant, voir 53, 66).

Les myotubes ou toute autre cellule musculaire différenciée sont notoirement difficiles à transfecter à l'aide de méthodes non virales. Dans la note d'application de la société, il est donc demandé d'effectuer la transfection JetPrime de myoblastes à 70 % de confluence monocouche afin d'obtenir des efficacités de transfection élevées, comme examiné 24 h plus tard. Pour notre propos, cette approche présente un risque que la myosine exprimée ne soit pas correctement repliée, en raison du manque de mécanismes de repliement appropriés dans les myoblastes, entraînant une accumulation et une agrégation de têtes de myosine inactives. Par conséquent, les optimisations de protocole importantes décrites ici incluent (i) la transfection de myoblastes à près de 100 % de confluence avec leur différenciation commençant immédiatement après la période de transfection (4 h) et (ii) la récolte optimale soigneusement sélectionnée après la transfection. Les deux valeurs de paramètre ont été motivées par un rapport du groupe Nesmelov66, où, malgré l'utilisation de la méthode de délivrance de gène viral, ils ont infecté les cellules au stade myoblaste à 100 % de confluence avec une transition immédiate vers le milieu de différenciation, suivie de la récolte des myotubes 7 jours après infection. Nos résultats montrent que, d'une part, l'efficacité d'expression élevée attendue 24 h après la transfection (note d'application JetPrime C2C12) a été sacrifiée (Fig. 1E) au profit d'une formation plus rapide de myotubes par fusion de myoblastes. D'autre part, une faible expression dans les premiers jours après la transfection joue en notre faveur puisque seule une faible fraction de la protéine exprimée connaissait un environnement intracellulaire non optimal en termes de machinerie de repliement appropriée. Il est intéressant d'observer comment une zone de transfection faible (< 10 %) aux jours immédiatement après la transfection a ensuite été élargie et a eu tendance à culminer aux jours 7 à 8 après la transfection. Cela s'est probablement produit en raison du transfert horizontal de plasmide entre quelques myoblastes transfectés et principaux non transfectés (ou transfectés avec une expression inférieure à la limite de détection). Une autre observation intéressante est que ce processus putatif de transfert horizontal de gènes est accéléré si les cellules sont ensemencées de manière à ce que près de 100 % de la confluence soit atteinte d'abord dans les 36 à 48 h suivant l'ensemencement, plutôt que si les cellules sont ensemencées à une densité plus élevée pour atteindre la confluence déjà après 24 h (comme c'est le cas habituellement). On peut supposer que les contacts cellule-cellule établis spontanément sur des temps de croissance prolongés avant la transfection sont importants pour l'accélération de la fusion des myoblastes, le transfert horizontal du plasmide et l'efficacité globale de la transfection (Fig. 1D). Fait intéressant, la récolte de cellules au jour 7, après l'introduction du gène, a également été effectuée dans des rapports récemment publiés utilisant le transfert de gène viral vers des myoblastes53,66,68. Des périodes d'expression plus longues peuvent néanmoins être envisagées à l'avenir. Ainsi, dans un rapport récent sur la transfection virale, les cellules ont été récoltées 9 à 11 jours après l'infection des myoblastes, ce qui a donné un remarquable rendement de construction de type HMM de myosine β-cardiaque purifiée allant jusqu'à 262 µg par boîte de culture cellulaire de 150 mm69 contre 33 µg avec récolte après 7 jours53.

Dans notre protocole, nous ne co-transfectons pas, ou échangeons plus tard, des chaînes légères murines co-purifiées avec des chaînes cardiaques humaines comme cela se fait généralement dans les laboratoires Spudich/Ruppel35,36 et Leinwand33,70. Au lieu de cela, le CMH bêta-cardiaque humain est purifié avec les chaînes légères murines. Ceci est similaire à la plupart des autres protocoles antérieurs reposant sur la délivrance de gènes à base de virus53,65,68,69. Dans une étude, Swenson et al.53 ont pleinement identifié les chaînes légères murines se composant de deux isoformes essentielles (muscle squelettique Myl1, myl4 auriculaire/fœtale) et d'une isoforme régulatrice (muscle squelettique Mylpf). Dans une autre étude où une construction de type HMM de myosine β-cardiaque humaine a été exprimée et purifiée à l'aide de cellules C2C12, une troisième isoforme MLC1F a été observée65. La détection de différentes chaînes légères reflète en partie les différentes longueurs des régions de liaison des chaînes légères dans les différentes constructions du CMH, mais peut également suggérer des différences dans les états cellulaires C2C12 entre différents laboratoires. Cela pourrait être important car l'état cellulaire était lié à la variabilité des mesures d'activité de la myosine ATPase obtenues au sein d'un laboratoire71.

Notre préparation S1L est assez pure comme indiqué sur la figure 2B. Cependant, pour d'autres améliorations, en évitant les protéines contaminantes mineures, plusieurs approches supplémentaires peuvent être adoptées à l'avenir. On pourrait ainsi utiliser une purification supplémentaire par chromatographie échangeuse d'ions (par exemple, colonne HiTrap Q HP33,35) pour polir l'éluat. Alternativement, on peut créer un site de restriction TEV entre l'eGFP et l'étiquette FLAG pour permettre de couper les constructions liées des billes de purification35. En utilisant cette dernière approche, l'élution par liaison compétitive du peptide FLAG ne serait pas nécessaire. L'évitement de cette étape éliminerait très probablement la contamination par des protéines non spécifiques du lysat cellulaire qui pourraient se lier aux perles de purification FLAG-résine et être libérées lors de l'élution. Enfin, une étiquette de purification supérieure peut être utilisée (par exemple, HaloTag72). Cependant, cela n'a pas été tenté ici car nous avons cherché à éviter des changements dans le protocole de purification établi au-delà de la méthode de livraison de gène qui est au centre de notre étude.

Le rendement de notre système d'expression et de purification basé sur C2C12 sans virus décrit est jusqu'à 0,08 µg de protéine homogène de chaque cm2 de cellules cultivées. Ceci est environ 2 à 4 fois inférieur aux rendements rapportés des systèmes viraux C2C12 utilisant une construction de myosine cardiaque similaire53, 54, 55 et 4 à 8 fois inférieurs à ceux rapportés pour d'autres isoformes de myosine musculaire striée de longueurs similaires et utilisant une étiquette alternative (His-tag )34. Le rendement est également 8 à 21 fois inférieur (ou 6 à 17 fois en mol) à celui rapporté récemment pour une meromyosine cardiaque lourde (HMM) comme la construction69. Le rendement inférieur avec la transfection non virale est attendu car il n'existe actuellement aucune alternative aussi efficace à la machinerie de délivrance de gènes des virus. Cependant, ce qui est important, le rendement de la protéine active, en utilisant notre méthode sans virus, est suffisant pour les tests d'ATPase à l'état d'équilibre et de motilité in vitro.

De toute évidence, le rendement de notre système d'expression à petite échelle est trop faible pour permettre une caractérisation complète de la fonction motrice de la myosine en utilisant la cinétique transitoire ou des études structurelles utilisant par exemple la cryo-EM. La mise à l'échelle pour permettre de telles études rendrait la méthode d'un coût prohibitif en raison du coût du réactif de transfection lui-même. Cependant, pour la production à petite échelle de S1L, comme décrit ici, la méthode est plus efficace en termes de coût et de temps, ainsi que plus généralement accessible, que la méthode à base d'adénovirus. Cela suggère une stratégie, par exemple pour l'étude d'un large éventail de mutations, avec 1. un dépistage fonctionnel initial (à l'aide d'ATPase et de tests de motilité in vitro) d'un large éventail de mutations produites à petite échelle à l'aide de la présente méthode, éventuellement suivi par 2. sélection des mutations les plus intéressantes pour la mise à l'échelle de la production de protéines afin de permettre des études cinétiques et structurales biochimiques transitoires. Cette dernière mise à l'échelle pourrait être réalisée, une fois qu'un nombre limité de mutations ont été sélectionnées, soit en utilisant l'expression transitoire basée sur l'adénovirus, soit un autre processus assez long, à savoir la génération de lignées cellulaires stables27. Ce dernier peut être utile si des quantités substantielles d'une construction donnée sont intéressantes à produire de manière répétée. De telles lignées cellulaires C2C12 stables peuvent, après un enrichissement approprié, exprimer de grandes quantités de protéines. En raison d'une sensibilité plus faible à une efficacité de transfection limitée, un agent de transfection à base de liposomes non viraux (lipofectine) a été utilisé dans la génération des lignées cellulaires stables27.

En plus des stratégies envisagées ci-dessus, nous prévoyons également des développements utilisant des dosages à une seule molécule pour remplacer bon nombre des analyses de cinétique biochimique transitoire. De tels développements, s'ils sont possibles à réaliser, permettraient une caractérisation biochimique presque complète en utilisant des protéines produites par la présente méthode d'expression transitoire non virale. De plus, on peut également à l'avenir, augmenter le rendement ainsi que réduire le coût de la transfection non virale. Ainsi, pour booster davantage l'expression, certaines adaptations du protocole décrit peuvent être faites. Actuellement, la différenciation cellulaire et l'expression des protéines se font dans un milieu de différenciation standard qui comprend 2 % de sérum de cheval32,34,35. Cependant, des formulations de milieux de différenciation/expression plus riches ont été mises en œuvre ; plus récemment, un milieu de différenciation comprenant 10 % de sérum de cheval et 1 % de sérum de veau fœtal a été utilisé avec succès53,69. Une telle formulation peut potentiellement stimuler l'expression des protéines également dans notre système. En effet, il a été constaté que des quantités minimales (par exemple, 1%) de sérum bovin peuvent être cruciales pour une efficacité d'expression élevée des protéines73.

L'activité des moteurs purifiés a été vérifiée en mesurant l'ATPase basale et activée par l'actine dans des conditions d'état d'équilibre. De manière frappante, les paramètres mesurés à l'état d'équilibre, c'est-à-dire l'activité basale sans actine (kbasal), l'activité ATPase activée par l'actine (kcat) et la KATPase sont en très bon accord avec les valeurs récemment rapportées (kbasal ~ 0,02 s−1, kcat ~ 8–9 s− 1, KATPase ~ 70–80 µM) utilisant des constructions similaires (S1L), co-purifiées, comme ici, avec des chaînes légères de souris mais utilisant une transfection virale53,54,55 (Tableau S1 ; Fig. S4). De plus, les vitesses de glissement des filaments d'actine obtenues dans notre étude (1, 5 à 1, 8 µm / s) se situent également dans la même plage que celles observées dans les études mentionnées (1, 5 à 1, 7 µm / s) (tableau S1; Fig. S4).

D'autre part, des paramètres cinétiques quelque peu différents ont été trouvés dans des études utilisant des constructions de myosine plus courtes (sS11-808aa), qui ne contenaient que la chaîne légère cardiaque essentielle (pas RLC) mais humaine35,59,60,71,74,75,76 ou la construction de myosine encore plus courte S11-787aa sans chaînes légères65. Ces études ont montré des valeurs de paramètres d'activité ATPase activées par l'actine plus faibles (kcat ~ 6 s−1, KATPase ~ 40 µM) (Tableau S2, Fig. S4) à l'exception de l'activité ATPase basale (kbasal ~ 0,02 s−1) qui reste similaire77. De plus, les vitesses des filaments d'actine utilisant ces constructions plus courtes étaient inférieures (~ 0, 9 µm / s) à celles de S1L (tableau S2, figure S4). Les valeurs inférieures de kcat dans certaines de ces expériences, utilisant la transfection virale, ont été attribuées à la variabilité entre les états cellulaires C2C12, ce qui suggère qu'il peut être prudent d'effectuer des expériences en parallèle (exprimant à la fois des protéines de type sauvage et mutées) lors de l'analyse de différentes maladies provoquant une mutation de myosine β-cardiaque. Compte tenu des valeurs de KATPase systématiquement plus élevées pour S1L avec des chaînes légères murines que pour sS1 avec ELC humain et des vitesses de glissement systématiquement plus élevées dans le test de motilité in vitro, nous pensons que ces effets reflètent de véritables différences entre les constructions sS1 et S1L plutôt que des particularités méthodologiques. À l'appui de ce point de vue, la construction humaine de type β-myosine HMM co-purifiée avec des chaînes légères de souris montre également une vitesse similaire d'environ 1, 5 µm / s69. Différents mécanismes à l'origine des différences observées peuvent être envisagés. Comme indiqué précédemment, les différentes longueurs du bras de levier de liaison à la chaîne légère et les différentes isoformes de la chaîne légère sont susceptibles d'être importantes à cet égard53. La longueur accrue du bras de levier en S1L par rapport à sS1 pourrait, à elle seule, expliquer la vitesse de glissement plus élevée78. De plus, comme la vitesse de glissement produite par S1L avec les chaînes légères murines semble être similaire (après correction de la température) à celle observée dans les fibres musculaires cutanées des ventricules humains (avec toutes les chaînes lourdes et légères de la myosine humaine)63, il ne semble pas nécessaire supposer des effets supplémentaires des chaînes légères murines vs humaines sur la vitesse de glissement.

Cependant, il est important de considérer, à cet égard, que d'autres études démontrent un effet spectaculaire des isoformes de chaînes légères essentielles79,80 et régulatrices81,82 sur les propriétés cinétiques de la myosine ATPase du muscle strié et sur les vitesses de glissement des filaments d'actine. De plus, lors de la réalisation d'expériences en parallèle, Tang et ses collaborateurs55 ont observé que les substitutions de la chaîne régulatrice de la souris par la chaîne légère régulatrice ventriculaire humaine (sans échange de l'ELC de la souris ; étude 3.1 vs 3.2 dans le tableau S2) ont démontré une réduction de la vitesse de la KATPase et du filament d'actine. de ~ 40 % et ~ 15 %, respectivement (voir également Fig. S4). Pour aborder plus définitivement les rôles des différentes chaînes légères sans autres complications, toutes les expériences doivent être réalisées dans des conditions similaires bien définies et avec une caractérisation complète des isoformes de la chaîne légère. Compte tenu de certaines variabilités perçues, comme indiqué ci-dessus, de telles études semblent intéressantes pour l'avenir.

Nous rapportons une transfection sans virus, une expression transitoire et une méthode de purification des protéines pour la production de myosine musculaire striée humaine active en quantités suffisantes pour une analyse biochimique et biophysique. Nous sommes convaincus que notre contournement de l'étape de production virale contribuera à "démocratiser" (cf.83) le système d'expression et de purification de la myosine du muscle strié humain, le rendant attractif et abordable pour une communauté scientifique plus large. Ceci, à son tour, devrait grandement bénéficier à la fois à la vitesse et à la qualité des découvertes scientifiques qui reposent sur l'utilisation de la myosine musculaire striée exprimée et purifiée. À ce stade, les limitations de la méthode sont des rendements de purification inférieurs par rapport à la livraison de gène viral comme discuté ci-dessus. Une autre limitation possible pourrait être le coût actuel du réactif JetPrime lors de transfections cellulaires à grande échelle (~ 15 €/boîte de culture cellulaire de 60 mm, comme estimé à partir du devis de produit obtenu auprès du distributeur en Suède, avril 2022). Bien qu'un jugement de coût équitable nécessiterait une estimation du coût pour un titre viral comparable, il peut être toujours valable de dire que la méthode est la plus appropriée pour les expériences à faible et moyenne échelle pour la caractérisation rapide d'un large éventail de mutations différentes en parallèle, en utilisant des techniques biochimiques et biophysiques d'état et de molécule unique. Lorsqu'une mise à l'échelle est nécessaire pour d'autres méthodes, une infection à base d'adénovirus est plus appropriée. Ci-dessus, nous proposons une stratégie pour combiner notre méthode avec la production de protéines à base d'adénovirus ou la production à l'aide d'une lignée cellulaire stable. Cependant, à l'avenir, de nouveaux réactifs de transfection adaptés aux cellules C2C12 deviendraient très probablement disponibles dans le commerce avec un meilleur rapport coût-efficacité. De plus, on peut prévoir que le développement de méthodes à molécule unique peut permettre une caractérisation biochimique plus étendue ne nécessitant que des quantités minimales de protéines exprimées.

L'actine a été purifiée à partir de muscle obtenu à partir d'un lapin euthanasié, selon une procédure approuvée par le Comité d'éthique régional pour les expérimentations animales à Linköping, Suède (réf. 17 088–2020). Immédiatement avant l'euthanasie, le lapin a été anesthésié par une injection intramusculaire de 0,25 ml de Zoletil avec des substances actives : Zolazépam, 6 mg/kg ; Tiletamin, 6 mg/kg et Medetomidin, 0,6 mg/kg. L'euthanasie a ensuite suivi, par injection de 2 ml de penthobarbital (100 mg/ml) dans une veine de l'oreille. Toutes les procédures ont été effectuées par le vétérinaire de l'Université de Linnaeus. L'actine a été isolée d'un seul lapin, motivée par le fait que les propriétés de l'actine n'étaient pas au centre de l'étude. Au lieu de cela, la variabilité possible entre la myosine de trois purifications d'expression différentes dans leur interaction avec l'actine était importante (voir ci-dessous).

Les plasmides ont été conçus pour contenir le gène MYH7 humain (https://www.uniprot.org/uniprot/P12883) pour le β-MHC humain et la séquence nucléotidique a été optimisée pour l'expression dans le contexte de l'hôte C2C12 du muscle de souris. Le gène MYH7 de pleine longueur a été tronqué pour exprimer ce que nous désignons sous-fragment 1 - long (S1L ; résidus d'acides aminés 1 à 848 du β-MHC humain), cloné dans un plasmide pcDNA-3.1 sous le promoteur CMV84, en ajoutant un Tobacco Etch Site de clivage de la protéase du virus (TEV) avant une étiquette de protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) et une étiquette FLAG (GenScript Biotech Corporation). Dans cet article, nous nous référons à cette construction comme S1L-eGFP-FLAG β-cardiaque humain ou simplement S1L. Cette construction a un seul domaine moteur mais contient à la fois des sites de liaison de chaînes légères essentiels et régulateurs.

A vial of the mouse myogenic C2C12 cell line (ATCC CRL 1772) was purchased from Sigma (Sigma-Aldrich, Germany, now Merck). The cell line has been derived by serial passage of primary cultures of adult thigh muscle after injury85. For routine culture, C2C12 cells were seeded at a density of 103 cells/cm2 (for 3 days growth) or 0.5 × 103 cells/cm2 (for 4 days growth). They were then grown in growth medium, GM [DMEM-high glucose no sodium pyruvate (Sartorius, Germany), 10% Fetal Bovine Serum (HyClone), 1% Antibiotic–Antimycotic solution (Gibco) and 2 mM L-glutamine (Sigma)] in polystyrene cell culture flasks or dishes (Sarstedt) at 37 °C in a humidified condition supplied with 5% CO2 (Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubator, Thermo Fisher). The cells were subcultured when the confluency was around 60–70%. Under our cell culture conditions, doubling time was estimated (2006)." href="/articles/s41598-023-30576-1#ref-CR86" id="ref-link-section-d92737242e1505">86 à 16 ± 2 h (moyenne ± SD, n = 43).

Pour la différenciation myogénique, les cellules ont été cultivées jusqu'à une confluence de 95 % et le milieu a été remplacé par du milieu de différenciation, DM. Ce dernier milieu contenait du DMEM à haute teneur en glucose (sans pyruvate de sodium) (Sartorius), 2 % de sérum de cheval donneur (HyClone), 1 % de solution antibiotique-antimycotique (Gibco), 2 mM de L-glutamine (Sigma), 1 % de MEM non- acide aminé essentiel (Gibco), HEPES 25 mM (Gibco) et insuline 1 µM (Sigma-Aldrich, maintenant Merck). Les cellules ont été différenciées jusqu'au jour 7 en les remplaçant par du DM frais toutes les 24 h. Seules les cellules entre les numéros de passage 5 à 15 ont été utilisées dans les expériences.

La transfection transitoire de cellules C2C12 a été réalisée en utilisant le kit de réactifs de transfection d'ADN JetPrime® (PolyPlus-transfection® SA, France), désigné « réactif JetPrime » dans cet article. Dans cette procédure, nous avons pris un point de départ dans le manuel d'application du fabricant pour les cellules C2C12 mais optimisé le protocole pour l'expression de protéines à grande échelle.

Pour optimiser l'efficacité de la transfection, les myoblastes C2C12 ont été ensemencés à 8 × 104 cellules/puits dans des plaques à 12 puits (Sarstedt) et cultivés pendant environ 24 h pour atteindre une confluence de 70 % avant la transfection, sauf indication contraire. Un mélange maître de transfection a été préparé en mélangeant 1,5 μg d'ADN plasmidique (1 μg/µl) et 3 μl de réactif JetPrime (rapport 1:2) dans 100 μL de tampon JetPrime® (propriété PolyPlus-transfection® SA, France ; "JetPrime tampon" ci-dessous) pour chaque puits, sauf indication contraire. Le mélange de transfection a été ajouté aux cellules goutte à goutte et incubé à 37 ° C pendant 3,5 à 4 h. Le processus de transfection a été arrêté en remplaçant GM par 0,5 ml de DM après avoir lavé les cellules une fois avec 0,5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS; tout par puits). Comme mentionné précédemment, le DM a été changé toutes les 24 h jusqu'au jour 6. L'efficacité de la transfection et de l'expression a été analysée par microscopie à fluorescence. Dans des études, après l'expression de S1L au fil du temps, des myoblastes C2C12 ont été ensemencés à 30 × 104 cellules dans des boîtes de culture individuelles de 35 mm (diamètre) (Nunc, Thermo Scientific) et cultivés pendant ~ 36 h pour atteindre une confluence de 95 % avant la transfection. Pour chaque boîte, un mélange maître de transfection a été préparé en mélangeant 7,5 μg d'ADN plasmidique et 15 μl de réactif JetPrime (rapport 1: 2) dans 200 μL de tampon JetPrime. Le mélange de transfection a été ajouté aux cellules goutte à goutte et incubé à 37 ° C pendant 3,5 à 4 h. Le processus de transfection a été arrêté en remplaçant GM par 2 ml de DM après avoir lavé les cellules une fois avec 2 ml de PBS (tous par boîte). Comme mentionné précédemment, le DM a été changé toutes les 24 h jusqu'au jour 8. L'efficacité de la transfection et de l'expression a été analysée quotidiennement (une boîte par jour) d'abord par microscopie à fluorescence, puis, après la récolte des cellules, par Western blot.

Pour la purification des protéines, des myoblastes C2C12 ont été ensemencés à 6 × 105 cellules/cm2 dans des boîtes en plastique de 60 mm de diamètre (Sarstedt) et cultivés pendant ~ 36 h pour atteindre une confluence de 95 % avant la transfection. Un mélange maître de transfection a été préparé en mélangeant 11,25 µg d'ADN plasmidique (1 µg/µl) et 22,5 µl de réactif JetPrime (rapport 1:2) dans 500 µL de tampon JetPrime pour chaque boîte de 60 mm. Le mélange de transfection a été ajouté aux cellules goutte à goutte et incubé à 37 ° C pendant 3,5 à 4 h. Le processus de transfection a été arrêté en remplaçant GM par 5 ml de DM après avoir lavé les cellules une fois avec 3 ml de PBS. Comme mentionné précédemment, le DM a été changé toutes les 24 h jusqu'au jour 7. Les cellules ont été récoltées au jour 7. Après rinçage avec 3 ml de PBS froid, les cellules ont été grattées à l'aide d'un grattoir à cellules avec 1 ml de PBS froid. Les cellules ont ensuite été transférées dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et doucement culottées par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4°C. Le surnageant a été jeté et le culot a été congelé en utilisant de l'azote liquide avec un stockage ultérieur à - 80 ° C.

L'expression de la construction de myosine marquée GFP a été surveillée et analysée dans des micrographies obtenues par un microscope à fluorescence inversé (Axio Observer D1, Zeiss, Allemagne) équipé d'une lampe à mercure (HBO 103 W/2, Osram, Allemagne) et en utilisant un objectif 10X et Jeu de filtres FITC. Des micrographies en fond clair et en fluorescence ont été acquises à l'aide d'une caméra EMCCD (C9100-12, photonique Hamamatsu, contrôlée par un logiciel dédié HCImage) avec un temps d'exposition constant (150 ms) et un gain (100) avec une profondeur d'image de 8 bits. Les images ont été acquises à différents intervalles après la transfection jusqu'à 8 jours. L'intensité lumineuse a été maintenue aussi faible que possible par un atténuateur FL discret (Cat. # 423 647, Zeiss) maintenu en position 5 (transmission ~ 20 %) et l'exposition cellulaire à la lumière d'excitation a été minimisée pour éviter la phototoxicité cellulaire. Jusqu'à six micrographies en champ clair et en fluorescence ont été acquises pour chaque paramètre ou puits/boîte de culture cellulaire à partir d'emplacements choisis au hasard. Pour éviter les biais de sélection (sélection involontaire de zones à haute fluorescence), le nouvel emplacement a toujours été sélectionné sous un éclairage en fond clair surveillant de manière exhaustive l'ensemble de l'échantillon87. Si nécessaire, la luminosité et le contraste de l'image ont été ajustés dans ImageJ (Image/Ajuster/Luminosité/Contraste).

Étant donné que les cellules exprimant la construction de myosine étaient toujours confluentes à 100 % au moment de l'imagerie, l'efficacité de la transfection a été déterminée comme 1) la fraction de la zone fluorescente totale acquise dans les images de fluorescence et 2) l'intensité de fluorescence (niveau moyen en niveaux de gris) dans ces zones. . Notez que ce dernier n'est comparable entre les expériences que si l'acquisition d'images se fait à des périodes rapprochées, de préférence le même jour, avec des heures de travail de lampe comparables et les mêmes paramètres de microscope (acquisition). Pour faciliter l'analyse, une macro a été écrite en Imagej (Fidji) avec un ensemble de fonctions disponibles (où "//" indique un commentaire) :

//Soustraction d'arrière-plan.run("Soustraction d'arrière-plan…", "rolling = 50");

//Segmentation d'image.setAutoThreshold("Default dark");setAutoThreshold("Default dark no-reset");setThreshold(4, 255);//Les valeurs de seuil doivent être adaptées en fonction de la qualité des images.

//mesurer la fraction de la surface fluorescente totale et la valeur grise moyenne. Dans les paramètres de la fonction "Mesure", il est important de cocher "limite au seuil" box.run("Mesure");

Pour les expériences où les images ont été acquises le même jour, l'efficacité de transfection (TE) a été calculée comme le produit entre la fraction de la surface fluorescente totale (A) et l'intensité de la fluorescence (I) : TE = A × I (unités arbitraires) pour faciliter la comparaison relative entre différents paramètres de transfection.

La protéine totale obtenue à partir de lysats cellulaires ou à partir des protéines purifiées a été analysée par SDS-PAGE et Western blot. Pour les isolats de protéines totales, les cellules ont été lysées sur de la glace pendant 30 min en utilisant un tampon RIPA (150 mM NaCl, 5 mM EGTA, 1 % Triton X-100, 0,1 % SDS, 25 mM Tris-HCl, 1 × Roche cocktail inhibiteur de protéase) , sous sonication pendant 30 s (nettoyeur à ultrasons Branson 2510-DTH). Cela a été suivi d'une centrifugation à 17 949 × g (13 000 tr/min) à l'aide d'une centrifugeuse Eppendorf 5430R pendant 10 min à 4 ℃. Les échantillons de protéines ont ensuite été mélangés avec un tampon d'échantillon non réducteur Pierce ™ LDS (ThermoFisher) avec 50 mM de DTT et chauffés à 95 ℃ pendant 5 min. L'électrophorèse a été réalisée sur un gel NuPAGE ™ 4–12% Bis – Tris (Thermofisher) à 90 V pendant 45 min, puis augmenté à 140 V pendant une heure dans le tampon de fonctionnement NuPAGE ™ MES SDS (ThermoFisher). Les protéines ont été transférées sur une membrane PVDF de 0,2 µm en utilisant le système de transfert Trans-Blot Turbo (BioRad) à 1 A, 25 V pendant 30 min. Après le transfert, la membrane a été incubée dans un tampon de blocage à 0,2 % (bloc EZ, Biological Industries) pendant une heure, lavée avec du tampon TBS-T (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20, pH = 7,4–7,6) puis incubé pendant une nuit avec des anticorps anti-FLAG (ab1257, Abcam) à une dilution de 1:20 000 dans un tampon de blocage. Le blot a été lavé dans du tampon TBS-T puis incubé avec des anticorps anti-chèvre Donkey (ab6885, Abcam) dilués dans du TBS-T à 1:20 000 pendant une heure. La membrane a finalement été lavée avec du TBS-T et le blot a été développé à l'aide du kit de substrat NovexTMECL Chemiluminescent (ThermoFisher). Les images ont été obtenues à l'aide du système d'imagerie sur gel ChemiDoc XRS (Biorad).

La stratégie de purification (compositions tampons, etc.) était basée sur une procédure décrite précédemment32,35. Tous les tampons ont été dégazés avant leur utilisation dans la purification. Le culot a été remis en suspension dans un tampon de lyse à pH 7,2 (imidazole 20 mM pH 7,2, NaCl 100 mM, MgCl2 4 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, ATP 3 mM, PMSF 1 mM, saccharose 0,5 % Tween-20 et 1 × cocktail d'inhibiteurs de protéase de Roche) et homogénéisé à l'aide d'un homogénéisateur Dounce avec 50 à 70 coups sur de la glace. Les cellules lysées ont été centrifugées à l'aide du rotor à angle fixe MLA-80 dans une ultracentrifugeuse Optima MAX-XP à 100 000 × g pendant 1 h à 4 ° C avec addition de 1 à 2 mM de MgATP frais juste avant la centrifugation. Le surnageant a été incubé avec le gel d'affinité Anti-Flag resin® M2 (Sigma-Aldrich) dans un tube Eppendorf pendant 1,5 h à 4 ° C sur un nutator, en le protégeant de la lumière et de l'air en l'enveloppant avec du papier d'aluminium et du parafilm. Dans cette étape, nous avons utilisé 20 à 40 µl de résine emballée par plaque de 60 mm, en fonction de la fluorescence des cellules transfectées. Après incubation, les billes avec la résine Anti-Flag ont été lavées deux fois avec 20 à 25 volumes de résine de tampon de lavage à pH 7,2 (20 mM Imidazole pH 7,2, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, ATP 3 mM, 10 % de saccharose, 1 × cocktail inhibiteur de protéase Roche) suivi de deux lavages sans ajout d'ATP et de cocktail inhibiteur de protéase. La protéine a été éluée des billes à l'aide d'un tampon d'élution à pH 7,2 (20 mM d'imidazole pH 7,2, 150 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, 1 mM d'EDTA, 1 mM d'EGTA, 1 mM de DTT, 10 % de saccharose et 150 μg/ml de 3 × peptide FLAG (Sigma-Aldrich)). L'éluat a été passé sur des colonnes Pierce Micro-Spin (Thermo Scientific) pour éliminer les billes résiduelles et a ensuite été concentré à l'aide d'unités de filtre centrifuge Amicon Ultra-0,5. Pour les élutions, des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml à faible liaison aux protéines ont été utilisés (Thermo Scientific). La concentration en protéines a été déterminée en mesurant l'absorbance à 488 nm en utilisant le coefficient d'extinction eGFP de 61 000 M-1 cm-1.

Tous les tampons et solutions ont été dégazés avant le dosage. L'activité de la construction de myosine β-cardiaque exprimée a été déterminée par un dosage de l'ATPase activée par l'actine couplée au NADH à l'état d'équilibre88. Le dosage a été effectué dans un tampon de dosage ATPase (10 mM Imidazole pH 7,5, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 et 1 mM DTT) à 23℃ en mesurant l'absorbance à 340 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV (UV-1800, Shimadzu) dans le temps -mode balayage pendant 5 min. L'appareil était équipé d'un porte-cellule super-micro pour contenir une cuvette noire supermicro, avec une plage de volume de travail de 50 à 200 µl, réduisant efficacement le volume de l'échantillon nécessaire. La F-actine a été purifiée à partir de muscles du dos de lapin et a été dialysée trois fois dans un tampon de dosage dégazé89. De la phalloïdine (Merck) a été ajoutée à l'actine après dialyse à une concentration de 1,1 équimolaire pour stabiliser les filaments. Le mélange réactionnel a été directement préparé dans la cuvette dans un tampon de dosage en diluant la myosine à une concentration finale de 50 nM avec des concentrations variables d'actine allant de 0 à 100 µM avec 2 mM de MgATP et une solution de cocktail NADH (1,2 mM NADH, 200 U/ ml de lactate déshydrogénase, 500 U/ml de pyruvate kinase et 2,5 mM de phospho(énol) pyruvate). L'ATPase de myosine basale (kbasal) a été mesurée avec de la myosine à une concentration finale de 70 à 150 nM sans filaments d'actine. Les traces d'absorbance de la réaction à chaque concentration d'actine ont été tracées en tant que renouvellement de l'ATP en fonction du temps et les pentes (taux d'ATPase) obtenues ont été normalisées à la concentration de myosine. Les taux de réaction normalisés tracés en fonction de l'augmentation de la concentration d'actine suivaient une hyperbole rectangulaire et étaient ajustés par l'équation à l'état d'équilibre de Briggs-Haldane.88

pour obtenir kcat et KATPase ainsi qu'une estimation bien ajustée de kbasal (V0) (GraphPad Prism v9). Les essais ont été effectués en utilisant trois préparations de protéines individuelles (n = 3).

La motilité des filaments d'actine produits par la construction S1L de myosine β-cardiaque exprimée a été évaluée à l'aide d'une procédure standard de test de motilité in vitro35,90. Les lamelles ont été recouvertes de 1 % de nitrocellulose dans de l'acétate d'amyle, séchées à l'air et assemblées pour former une cellule d'écoulement comme décrit précédemment91. Dans un premier temps, les têtes motrices non fonctionnelles ont été séparées des têtes fonctionnelles en réalisant une à deux purifications par affinité pour améliorer la fraction de filaments mobiles91. La purification par affinité a été réalisée en mélangeant la solution mère avec la protéine exprimée avec des filaments d'actine à une concentration (concentration de sous-unité) 10 fois supérieure à la concentration de S1L pendant 5 min sur glace, suivie de l'ajout de 4 mM de MgATP et d'une incubation sur glace pendant 5 min. Le mélange a ensuite été centrifugé à 244 900 × g (75 000 tr/min) à l'aide d'un rotor TLA 120.1 dans l'ultracentrifugeuse (Optima MAX-XP, Beckman Coulter) pendant 10 min à 4 °C et le surnageant, contenant les moteurs fonctionnels a été utilisé pour le dosage . Une solution à faible force ionique (LISS, 10 mM MOPS, pH = 7,4 à 25 ° C, 1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA) a été dégazée et complétée avec 50 mM KCl et 1 mM DTT pour donner un tampon de lavage. La Flow Cell a été recouverte d'anticorps anti-GFP (MAB3580, Merck, dilué 6 fois dans un tampon de lavage) pendant 2 min, puis bloquée avec 1 mg/ml de BSA (2 min, préparé dans un tampon de lavage). La protéine S1L-eGFP-FLAG purifiée par affinité, diluée dans un tampon de lavage (≤ 325 nM; mesurée avant la purification par affinité), a été ajoutée à la Flow Cell avec incubation pendant 5 min. Les moteurs inactifs ont ensuite été bloqués par une "procédure de blocage de l'actine" comme décrit précédemment91. La F-actine non fluorescente (500 nM), déchiquetée dans du tampon de lavage par pipetage, a été incubée avec 2 mM d'ATP pendant 2 min (dans du tampon de lavage), puis lavée deux fois avec du tampon de lavage. Enfin, des filaments d'actine marqués avec de la rhodamine-phalloïdine à une concentration de 15 nM dans un tampon de lavage ont été ajoutés et incubés pendant 2 min, suivis d'un lavage à un volume. Enfin, une solution de test de motilité a été ajoutée. La solution d'essai contenait du LISS (voir ci-dessus), 45 mM de KCl, 10 mM de DTT, 0,64 % de méthylcellulose et 2 mM de MgATP. Il a également été complété avec des mélanges pour la régénération de l'ATP (200 µg/ml de créatine phosphokinase (CPK), 2,5 mM de phosphate de créatine (CP)) et le piégeage de l'oxygène (3 mg/ml de glucose, 40 µg/ml de catalase, 100 µg/ml de glucose oxydase (GOX)). La force ionique était de 60 mM. Des films de glissement de filament d'actine ont été enregistrés à 25 ± 1℃ à l'aide d'un microscope à épifluorescence Zeiss Axio Observer équipé d'un objectif 63X (équipé d'un réchauffeur d'objectif), d'un ensemble de filtres Cy3 et d'une caméra EMCCD (C9100-12, photonique Hamamatsu, contrôlée par HCImage logiciel) à 5 images/s et une profondeur d'image de 16 bits. Les vitesses de glissement ont été calculées à l'aide d'un programme MATLAB personnalisé92. Les fractions de filaments mobiles ont été déterminées à l'aide d'ImageJ93,94.

L'ajustement de la courbe pour l'analyse du taux de renouvellement de l'ATP activé par l'actine est décrit ci-dessus. Aucun test d'hypothèse statistique n'a été effectué, mais des intervalles de confiance à 95 % non chevauchants sont supposés correspondre à des différences statistiquement significatives. La signification et l'origine des mesures centrales (valeurs moyennes arithmétiques) et des barres d'erreur sont décrites dans les légendes des figures et dans les tableaux.

Aucun calcul de taille d'échantillon n'a été effectué avant les expériences car l'objectif principal n'était pas de démontrer les différences dans les variables observées entre les groupes ou à partir d'une valeur de population donnée. Au lieu de cela, l'objectif était de tester le niveau d'expression de S1L et la fonctionnalité de la protéine purifiée ainsi que des informations sur la variabilité. Les définitions des événements aléatoires indépendants (n) sont données dans les légendes des figures et dans le tableau 1.

Les analyses statistiques, par exemple le calcul des intervalles de confiance et l'ajustement des courbes ont été effectuées à l'aide du logiciel Graph Pad Prism v. 9.2 (Graph Pad Software LLC).

La plupart des données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié (et ses fichiers d'informations supplémentaires). Des données supplémentaires générées ou analysées au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable. La séquence d'ADN codant pour le domaine moteur de la myosine cardiaque bêta humaine (S1L) générée au cours de la présente étude est disponible dans le dépôt NCBI GenBank (qui fait partie de l'International Nucleotide Sequence Collaboration [INSDC]), sous le numéro d'accession OQ092356.

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Ce travail a été financé par le programme-cadre de recherche et d'innovation EU Horizon 2020 de l'Union européenne (accord de subvention 732482) (Future and Emerging Technologies; Bio4comp), le Conseil suédois de la recherche (numéros de subvention 2015-05290 et 2019-03456) et la faculté des sciences de la santé et de la vie à l'Université Linnaeus, Suède. Cette étude a été initiée pendant un congé sabbatique d'A Månsson dans le laboratoire de JA Spudich à l'Université de Stanford. Le congé sabbatique a été cofinancé par la fondation Wenner-Green et la Faculté des sciences de la santé et de la vie de l'Université Linnaeus. L'avancement des travaux repose également sur une visite de recherche du Dr L Moretto au laboratoire des Drs Spudich et KC Ruppel financée par la Faculté des sciences de la santé et de la vie de l'Université de Linnaeus. Nous remercions en outre les Drs Spudich et Ruppel pour avoir généreusement fourni des protocoles clés et pour d'importants conseils et discussions au cours de l'étude. En outre, le Dr Linda Song est remercié pour les discussions et les conseils. Enfin, nous remercions le professeur Spudich d'avoir lu et commenté le manuscrit.

Financement en libre accès fourni par l'Université de Linnaeus.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Lok Priya Velayuthan et Luisa Moretto.

Département de chimie et des sciences biomédicales, Université Linnaeus, 391 82, Kalmar, Suède

Lok Priya Velayuthan, Luisa Moretto, Sven Tågerud, Marko Ušaj & Alf Månsson

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Correspondance à Marko Ušaj ou Alf Månsson.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Velayuthan, LP, Moretto, L., Tågerud, S. et al. Transfection sans virus, expression transitoire et purification de la myosine cardiaque humaine dans des cellules musculaires de mammifères pour des essais biochimiques et biophysiques. Sci Rep 13, 4101 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30576-1

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Reçu : 07 décembre 2022

Accepté : 27 février 2023

Publié: 12 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-30576-1

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