Analyse de l'impact du type de fibres alimentaires sur l'athérosclérose chez des souris colonisées par différentes communautés microbiennes intestinales

npj Biofilms et Microbiomes volume 9, Numéro d'article : 31 (2023) Citer cet article

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La consommation de fibres alimentaires a été associée à une amélioration de la santé cardiométabolique, cependant, des études sur l'homme ont signalé de grandes variations interindividuelles dans les avantages observés. Nous avons testé si les effets des fibres alimentaires sur l'athérosclérose sont influencés par le microbiome intestinal. Nous avons colonisé des souris ApoE-/- sans germes avec des échantillons fécaux de trois donneurs humains (DonA, DonB et DonC) et les avons nourris avec des régimes complétés soit par un mélange de 5 fibres fermentescibles (FF) soit par un régime témoin de cellulose non fermentescible (CC). Nous avons constaté que les souris colonisées par DonA présentaient une charge d'athérosclérose réduite avec l'alimentation FF par rapport à leurs homologues nourries au CC, alors que le type de fibre n'affectait pas l'athérosclérose chez les souris colonisées par le microbiote des autres donneurs. Les changements microbiens associés à l'alimentation FF chez les souris DonA étaient caractérisés par des abondances relatives plus élevées de taxons producteurs de butyrate, des niveaux de butyrate plus élevés et un enrichissement des gènes impliqués dans la synthèse des vitamines B. Nos résultats suggèrent que l'athéroprotection en réponse à la FF n'est pas universelle et est influencée par le microbiome intestinal.

Les réponses individuelles au même régime ou aux mêmes médicaments thérapeutiques sont souvent incohérentes et non universelles. Cette notion est un principe fondamental de la médecine de précision et de la nutrition1,2. De nombreux facteurs influencent la façon dont un sujet répond à un traitement donné, notamment la génétique, l'alimentation et le sexe. Récemment, il est devenu évident que le microbiome intestinal est un contributeur majeur à la variation interpersonnelle observée de la réactivité3,4,5,6. Il est maintenant largement reconnu que le microbiome intestinal joue un rôle important dans la santé et que sa composition est très variable selon les individus7. Les composants alimentaires, des denrées alimentaires aux médicaments administrés par voie orale, entrent en contact étroit avec les microbes résidents le long du tractus gastro-intestinal. Le microbiome intestinal code collectivement > 100 fois plus de gènes que le génome humain, y compris un riche éventail d'enzymes ayant le potentiel de métaboliser ces composés ingérés et de moduler leur biodisponibilité, leur activité et, finalement, leurs effets sur l'hôte8,9,10. En effet, les microbes intestinaux ont reçu une attention considérable ces dernières années pour leur capacité à moduler les réponses aux composés bioactifs11 allant des médicaments antihypertenseurs aux immunosuppresseurs pour les greffes d'organes12,13. Mieux comprendre quelles interventions sont les plus sensibles aux variations du microbiome est essentiel pour la mise en œuvre efficace de la médecine de précision.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès aux États-Unis et représentent plus d'un tiers de tous les décès dans le monde14,15. L'athérosclérose est la manifestation la plus courante des maladies cardiovasculaires et est provoquée par des processus inflammatoires qui entraînent la formation de plaques graisseuses denses en macrophages dans la paroi artérielle16. Il existe de plus en plus de preuves que le microbiome intestinal joue un rôle important dans la modulation du développement de l'athérosclérose. Des études épidémiologiques ont identifié des différences dans les microbiomes des individus atteints de maladie coronarienne par rapport aux individus en bonne santé17,18,19. En outre, il a été démontré que plusieurs métabolites microbiens provenant de composants alimentaires spécifiques modulent la progression de l'athérosclérose chez les humains et les modèles animaux par le biais de divers mécanismes. Par exemple, le N-oxyde de triméthylamine, un dérivé microbien de la choline, est associé à un risque accru d'événements cardiovasculaires majeurs chez l'homme20 ; le métabolite microbien acide indole-3-propionique, dérivé du tryptophane, protège contre la progression de l'athérosclérose en favorisant l'efflux de cholestérol21 ; et les acides gras à chaîne courte (SCFA), qui sont produits par fermentation des fibres alimentaires, se sont avérés efficaces pour améliorer l'athérosclérose en limitant l'absorption du cholestérol alimentaire (propionate) et en réduisant l'inflammation et la perméabilité intestinale (butyrate)22,23,24. En effet, on sait depuis longtemps que l'alimentation joue un rôle majeur dans la promotion et la prévention de l'athérosclérose25,26. Par exemple, il est bien établi que les aliments tels que les céréales à grains entiers et les légumineuses riches en fibres alimentaires protègent contre les MCV27,28. Cependant, des réponses incohérentes à un certain nombre d'interventions diététiques et pharmacologiques pour les maladies cardiovasculaires ont été observées entre les individus29,30. La plupart des études établissant un lien entre les fibres alimentaires et l'amélioration de la santé cardiovasculaire sont évaluées à l'aide de moyennes de population31 et ne tiennent pas compte des caractéristiques individuelles. Par conséquent, les causes de ces incohérences sont sous-étudiées.

Les fibres alimentaires sont des oligo- ou polysaccharides qui résistent à la dégradation par les enzymes de l'hôte et sont disponibles pour être métabolisés par les microbes dans l'intestin distal. Les fibres alimentaires varient considérablement en structure et en composition et sont souvent subdivisées en fonction de leurs propriétés biochimiques. Une de ces divisions est établie selon qu'ils peuvent être fermentés par des microbes intestinaux. Ainsi, les fibres fermentescibles sont des fibres alimentaires pouvant être métabolisées par les microbes intestinaux, tandis que les fibres non fermentescibles résistent à la fermentation intestinale32. Selon cette définition, la fermentescibilité n'est pas une propriété statique ou inhérente à une fibre donnée puisqu'elle dépend du contexte et dépend de la présence de microbes spécifiques qui peuvent dégrader la fibre en question et l'environnement hôte (par exemple, temps de transit, rumination). La fermentation des fibres alimentaires dans le tractus gastro-intestinal entraîne la production d'AGCC, dont les plus abondants sont l'acétate, le propionate et le butyrate. Les AGCC ont été associés à une amélioration de la santé cardiométabolique22,23 et on suppose qu'ils sont à l'origine de certains des effets athéroprotecteurs associés à la consommation de fibres alimentaires33. Cependant, plusieurs études ont montré que la production d'AGCC dépend de la structure du microbiome et est très variable d'un individu à l'autre. Par exemple, McOrist et al. ont trouvé des réponses individualisées dans la production de butyrate à un complément alimentaire à base d'amidon résistant (RS)34. De plus, nous avons récemment découvert que diverses fibres fermentescibles (pectine, inuline, fructo-oligosaccharide (FOS), RS-2 et RS-4) provoquaient des réponses disparates dans la production d'AGCC lorsqu'elles étaient administrées à des souris colonisées par différentes communautés microbiennes35.

Compte tenu de la nature personnalisée du microbiome intestinal et du fait que les microbes intestinaux sont nécessaires pour métaboliser les fibres alimentaires, nous avons émis l'hypothèse que les effets athéroprotecteurs obtenus en réponse à une fibre alimentaire donnée sont modulés par la composition du microbiome intestinal du consommateur. Pour tester cela, nous avons colonisé des groupes de souris sans germe (GF) déficientes en apolipoprotéine E (ApoE-/-) avec des communautés microbiennes fécales provenant de l'un des trois donneurs humains, chacun présentant des compositions microbiennes et des capacités de production de SCFA divergentes. Les souris colonisées ont été nourries avec un régime contenant soit un mélange de fibres fermentescibles (FF) soit un régime témoin de cellulose non fermentescible (CC). Nous avons constaté que la protection contre l'athérosclérose par la consommation de FF n'était pas universelle, mais était plutôt modulée par le microbiome résident. Nous avons également observé que l'athéroprotection était associée à une production accrue de butyrate et à un enrichissement des gènes bactériens impliqués dans les voies du métabolisme des glucides et de la synthèse des vitamines.

Des souris ApoE-/- femelles sans germe (GF) ont été colonisées avec des échantillons fécaux de l'un des trois donneurs humains (Fig. 1 supplémentaire). Ces échantillons ont été sélectionnés à partir d'un référentiel d'échantillons fécaux précédemment prélevés sur des adultes au milieu de la soixantaine36 et ont été choisis en fonction (i) de leur structure communautaire divergente telle qu'évaluée par les distances UniFrac non pondérées des profils d'ARNr 16S et (ii) de leur capacité à générer différents niveaux d'AGCC lorsqu'ils sont greffés sur des souris GF consommant un régime semi-purifié contenant un assortiment de fibres35. Après la colonisation, les souris ont été maintenues au régime FF pendant deux semaines pour permettre la stabilisation des communautés greffées avant la phase de traitement alimentaire (Fig. 1 supplémentaire). Des échantillons fécaux ont été prélevés à ce stade pour évaluer la prise de greffe bactérienne via le séquençage de l'amplicon 16S rRNA V4. L'efficacité de la greffe (au niveau du genre) était de 64% chez les souris colonisées par DonA, 65% par DonB et 72% par DonC, respectivement (Fig. 2f supplémentaire). Lorsqu'ils sont calculés en pourcentage de genres donneurs détectés chez au moins une des souris receveuses, les efficacités étaient de 90, 88 et 87% chez les souris colonisées par DonA, DonB et DonC, respectivement (Fig. 2c – e supplémentaire). Ces efficacités de greffe sont conformes aux études précédentes37,38. Les différences physiologiques, anatomiques et comportementales entre les donneurs humains et les souris receveuses, ainsi que les différences de régime alimentaire, expliquent probablement pourquoi seule une fraction des bactéries du donneur a été greffée.

Quelques genres n'ont été détectés que chez les souris receveuses, mais étaient uniques à chacun des trois groupes de donneurs, ce qui suggère que ces taxons peuvent avoir été présents en faible abondance dans les échantillons de donneurs humains plutôt que le résultat d'une contamination. L'analyse des coordonnées principales (PCoA) des distances UniFrac pondérées des échantillons fécaux collectés avant le traitement diététique a montré une prise de greffe uniforme entre les souris liées aux deux régimes (liées à FF et liées à CC) dans tous les groupes de traitement (tous par paires PERMANOVA ajusté P> 0, 1, Fig. 2a supplémentaire). Cependant, des comparaisons utilisant des distances UniFrac non pondérées (sensibles à la présence / à l'absence de taxons) ont montré une différence significative dans la structure de la communauté chez les souris colonisées par DonA entre les communautés liées à FF et liées à CC (P ajusté = 0, 0012, Fig. 2b supplémentaire). Cela a été motivé par 9 genres qui ont été détectés dans un groupe lié au régime alimentaire mais pas dans l'autre (Fig. 2c supplémentaire). Onze semaines après le traitement diététique, des échantillons cæcaux ont été prélevés et utilisés pour évaluer les communautés microbiennes terminales. À la fin de l'expérience, 5 des 9 genres manquants n'étaient plus détectés dans le contenu caecal des souris de l'un ou l'autre régime, tandis que 4 genres (Clostridium, Faecalibacterium, Gemmiger et un genre Ruminococcus indéterminé) n'étaient trouvés que chez les souris nourries au FF (Fig. 2c supplémentaire). Cela introduit la possibilité que les différences observées dans les communautés assemblées entre les groupes alimentaires pour les souris DonA soient le résultat d'une prise de greffe incohérente plutôt qu'un effet du régime alimentaire. Alternativement, étant donné que les communautés microbiennes subissent des fluctuations considérables dans la période suivant la colonisation39, il est possible que ces taxons manquants soient présents chez les souris liées au CC, mais en dessous des niveaux détectables. Ce dernier scénario est étayé par le fait que (i) tous les taxons manquants ont été détectés dans l'échantillon de donneur humain utilisé pour inoculer toutes les souris DonA, et (ii) des schémas similaires liés au régime FF ont été observés avec Faecalibacterium et Gemmiger abondances dans une étude précédente35 qui utilisait les mêmes matières fécales de donneur et les mêmes régimes. Ces résultats soulignent l'importance de rapporter les données de prise de greffe avant le traitement dans les études de greffe de souris de sorte que les conclusions puissent être correctement contextualisées.

Deux semaines après la colonisation, les souris ont été placées dans leurs groupes de traitement diététique et ont été maintenues dans leurs régimes respectifs pendant 11 semaines. L'analyse PCoA des distances UniFrac pondérées et non pondérées (Fig. 1a, b) des communautés bactériennes cæcales évaluées à la fin de l'étude montre que les souris se distinguaient fortement par le traitement alimentaire au sein de chaque groupe de donneurs. Lors de l'utilisation de distances UniFrac non pondérées, l'ordination montre que le groupe de donneurs a eu un effet plus fort sur la composition de la communauté que le régime alimentaire (Fig. 1a). La PCoA des distances UniFrac pondérées, qui tient compte de l'abondance de chaque taxon, montre des distinctions claires selon le régime alimentaire, mais davantage de chevauchement entre les groupes de donneurs (Fig. 1b), ce qui suggère que la consommation de FF provoque des changements distincts de certains taxons à faible abondance et phylogénétiquement liés dans les trois communautés. La diversité alpha (Shannon) était plus élevée chez les souris colonisées par DonA consommant du FF par rapport à la consommation de CC, mais n'était pas significativement affectée par le régime alimentaire chez les souris colonisées par DonB ou DonC (Fig. 1f). De même, la richesse observée en variant de séquence d'amplicon (ASV) a été significativement augmentée avec le régime FF chez les souris DonA, mais a été réduite par l'alimentation en FF chez les souris DonB (Fig. 1g). La consommation de FF a entraîné une augmentation de la concentration d'ADN dans le contenu caecal, un indicateur de la biomasse microbienne40, par rapport aux souris nourries au CC (Fig. 3 supplémentaire). Cet effet a été observé dans les trois groupes de donneurs et suggère qu'une alimentation riche en fibres fermentescibles augmente généralement la biomasse microbienne.

a, b Analyse des coordonnées principales des distances UniFrac non pondérées et pondérées des ASV 16S rRNA V4. Animaux colonisés avec des échantillons fécaux de trois donneurs différents : DonA, DonB et DonC. c Abondances relatives des taxons au niveau du genre pour les deux régimes (axe des x inférieur, barres colorées) ainsi que des tailles d'effet d'abondance différentielle entre les régimes (MaAsLin 2) (axe des x supérieur, points). Les différences significatives d'abondance des taxons au sein de chaque groupe de donneurs sont indiquées par un point plein (P ajusté < 0,1) et les cercles vides indiquent aucun changement significatif (P ajusté > 0,1). L'orientation du point par rapport à l'origine représente l'effet du régime alimentaire sur l'abondance de chaque taxon (les valeurs négatives correspondent aux abondances CC, les valeurs positives correspondent aux abondances FF). Les 5 premières lettres de la famille englobant chaque taxon sont indiquées entre parenthèses ; si la famille est indéterminée, le phylum du taxon est répertorié à la place et noté avec un "P-". d Abondance relative des taxons au niveau de l'embranchement en fonction du régime alimentaire et du groupe donneur. e Rapport Bacteroidetes sur Firmicutes. f, g Indice de diversité de Shannon et richesse observée. Les diagrammes en boîte et à moustaches indiquent la plage interquartile, la médiane et la répartition des points dans 1,5 fois la plage interquartile ainsi que les points de données individuels ; magenta = Fibre Fermentable (FF), bleu = Cellulose Control (CC). Comparaisons des moyennes (n = 7–10/régime/groupe donneur) réalisées avec le test de Wilcoxon, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Les communautés bactériennes étaient dominées par les Firmicutes et les Bacteroidetes et présentaient des niveaux détectables de Proteobacteria et de Verrucomicorbia dans tous les groupes de traitement (Fig. 1d). Des actinobactéries ont été détectées chez des souris colonisées par DonA nourries au FF, des souris colonisées par le DonB nourries au CC et les deux régimes pour les souris colonisées par le DonC. L'alimentation FF a abaissé le rapport Bacteroidetes sur Firmicutes pour tous les groupes de donneurs (Fig. 1e), mais la seule réduction significative a été observée chez les souris colonisées par DonA. Il y avait généralement peu de cohérence dans les schémas d'enrichissement associés à l'alimentation observés dans les groupes de donneurs, même en tenant compte des changements au niveau du phylum, ce qui suggère une absence de réponse universelle au traitement alimentaire (Fig. 1c – g).

Nous avons utilisé la Microbiome Multivariable Association with Linear Models (MaAsLin 2)41 pour analyser les modèles d'enrichissement au niveau du genre causés par le régime alimentaire de chaque groupe de donneurs. La plupart des genres significativement différents (P ajusté <0, 1) étaient uniques à chaque groupe de donneurs: Blautia était le seul genre significativement enrichi par la consommation de FF dans tous les groupes de donneurs, tandis qu'Eggerthella, Butyricimonas et Parabacteroides étaient les seuls genres à présenter un enrichissement universel en réponse au régime CC (Fig. 1c). Une explication évidente du manque d'universalité est le fait que chaque groupe de donneurs possède différentes collections de microbes. Cependant, même dans les cas de genres présents chez plusieurs donneurs, la directionnalité en réponse au régime alimentaire avait tendance à varier selon la communauté ([Lachn] Clostridium, Bacteroides, Akkermansia, [Lachn] Undetermined, [Rumin] Clostridium, Oscillospira, [Erysi] Clostridium, [Lachn] Ruminococcus). Par exemple, le genre Bacteroides a été significativement enrichi par l'alimentation CC chez les souris colonisées par DonC, par l'alimentation FF chez les souris colonisées par DonB et non affecté par le régime alimentaire chez les animaux colonisés par DonA (Fig. 1c). Fait intéressant, l'abondance relative d'Akkermansia a été significativement augmentée par l'alimentation CC chez les souris DonB, par le régime FF chez les souris DonC et n'a pas été affectée par le régime chez les souris colonisées par DonA. Akkermansia muciniphila, l'espèce la plus répandue dans ce genre, se nourrit de mucines hôtes qui peuvent être glycosylées par des bactéries dégradant les fibres, influençant ainsi les niveaux d'Akkermansia42,43. Bien qu'il ait été rapporté qu'Akkermansia prospère avec des régimes pauvres en fibres fermentescibles44, nos données indiquent que la composition du microbiote peut influencer la réponse d'Akkermansia à des sources de fibres spécifiques. Il est également possible que les différents groupes de donneurs possèdent des souches distinctes d'Akkermansia muciniphilia qui sont elles-mêmes différemment affectées par l'alimentation. Ensemble, ces résultats suggèrent que les réponses microbiennes aux fibres alimentaires dépendent du contexte et sont probablement influencées par la composition et les capacités métaboliques de la communauté au sens large.

Les souris nourries au FF colonisées avec du DonA présentaient une réduction significative du dépôt de lipides dans les plaques d'athérosclérose et une tendance à la réduction de la surface de la plaque (P = 0, 070) par rapport à leurs homologues nourris au CC, alors qu'aucune différence n'a été observée entre les régimes chez les souris colonisées par le DonB ou le DonC (Fig. 2a – c). Pour mieux caractériser l'état de la maladie d'athérosclérose, les lésions ont été évaluées pour l'infiltration de macrophages par immunohistologie avec des anticorps MOMA-2. Aucune différence statistiquement significative n'a été observée entre les régimes alimentaires dans la densité de la lésion MOMA-2 dans aucun des groupes de donneurs (Fig. 2a, d), mais il y avait une tendance à la réduction de la densité avec l'alimentation FF chez les souris DonA (P = 0, 11). Des études antérieures rapportent des résultats incohérents concernant l'effet de l'inuline (une fibre composant le régime FF) sur l'athérosclérose chez la souris45,46. Rault-Nania et al. ont constaté que l'inuline améliorait l'athérosclérose chez les souris ApoE-/-, tandis que Hoving et ses collègues ont découvert que l'inuline exacerbait l'athérosclérose chez les souris APOE * 3-Leiden. Bien que cet écart puisse être dû aux différents régimes et/ou modèles de souris utilisés dans ces études, nos résultats soutiennent l'idée que le microbiome intestinal module l'effet athéroprotecteur des fibres alimentaires fermentescibles, fournissant une explication possible à ces résultats contradictoires.

L'athérosclérose a été mesurée chez des souris GF ApoE−/− colonisées par des communautés fécales humaines DonA, DonB et DonC et nourries soit avec un régime de fibres fermentescibles, soit avec un régime témoin de cellulose. a Coloration représentative Oil Red O et coloration par anticorps MOMA-2 du contenu des sections transversales du sinus aortique. Quantification de la zone moyenne de la plaque (b), de la zone lipidique positive (c) ou de la zone positive MOMA-2 (d). Taux plasmatiques de cholestérol total (e), de cholestérol HDL (f) et de triglycérides (g). Les diagrammes en boîte et à moustaches indiquent la plage interquartile, la médiane et la répartition des points dans 1,5 fois la plage interquartile ainsi que les points de données individuels ; magenta = Fibre Fermentable (FF), bleu = Cellulose Control (CC). Les comparaisons des moyennes entre les régimes au sein de chaque groupe de donneurs (n = 7–10/régime/groupe de donneurs) ont été effectuées à l'aide d'un test de Wilcoxon avec une correction appropriée pour l'hypothèse d'égale variance (test de Levenes), *P < 0,05, **P < 0,01.

Pour tester si la consommation de fibres fermentescibles altérait la composition lipidique en circulation, nous avons mesuré les taux de lipides dans le plasma des souris décrites ci-dessus. Aucune différence statistique n'a été observée entre les régimes alimentaires de l'un des groupes de donneurs dans les taux plasmatiques de cholestérol total, de cholestérol HDL ou de triglycérides (Fig. 2e – g). Nous avons également évalué les niveaux d'expression aortique des ARNm d'Abca1 et d'Abcg1 par RT-qPCR en tant que marqueurs du transport inverse du cholestérol, mais nous n'avons observé aucune différence statistiquement significative entre les régimes alimentaires au sein des groupes de donneurs (Fig. 4d, e supplémentaires). Ces résultats suggèrent que l'effet athéroprotecteur de la consommation de FF observé chez les souris DonA n'était pas médié par des altérations majeures des lipides plasmatiques ou de l'homéostasie du cholestérol. Pour tester si l'athéroprotection était associée à des modifications de l'état de l'inflammation vasculaire, nous avons mesuré l'expression aortique des marqueurs inflammatoires Tnf-α, Il1-β et Vcam-1, qui sont couramment associés à la progression de l'athérosclérose22,47. Aucune différence significative n'a été observée dans l'expression de ces marqueurs entre les régimes alimentaires dans aucun des groupes de donneurs (Fig. 4a – c supplémentaires). Ces données suggèrent que l'effet athéroprotecteur de l'alimentation FF chez les souris DonA peut être indépendant de ces processus immunitaires et du transport inverse du cholestérol, bien que des analyses supplémentaires soient nécessaires pour exclure complètement ces facteurs.

Compte tenu de la variabilité de la composition du microbiome entre les régimes, nous avons ensuite testé s'il y avait des différences dans les capacités de fermentation des fibres entre les groupes de donneurs. Conformément aux modèles de composition du microbiome ci-dessus, les changements induits par l'alimentation dans les profils SCFA dépendaient fortement du groupe de donneurs (Fig. 3a – d). L'acétate, le SCFA le plus abondant, a été augmenté chez les souris nourries au FF colonisées par les communautés DonA et DonB (Fig. 3a). Le propionate a été augmenté par l'alimentation FF uniquement chez les souris DonA, alors que le régime alimentaire n'a pas affecté les niveaux de propionate dans les deux autres groupes de donneurs (Fig. 3b). L'alimentation par FF a entraîné des niveaux de butyrate cæcal considérablement élevés chez les souris DonA, mais des niveaux de butyrate réduits chez les souris colonisées par DonB par rapport à leurs homologues nourris au CC (Fig. 3c). Les concentrations de butyrate cæcal n'étaient pas différentes entre les régimes chez les souris colonisées par le DonC. Les acides gras à chaîne ramifiée isobutyrate et isovalérate, qui sont principalement produits par fermentation de protéines, n'ont été affectés par le régime alimentaire dans aucun des groupes de donneurs (Fig. 3e, f). L'absence de différences dans les acides gras à chaîne ramifiée est cohérente avec le fait que les régimes FF et CC sont isoprotéiques. Les concentrations totales d'AGCC (c'est-à-dire la somme de l'acétate, du propionate et du butyrate) au sein des groupes de donneurs ont été augmentées par l'alimentation en FF dans DonA et DonB, mais pas dans DonC (Fig. 3d). Ces résultats reflètent les changements observés dans le microbiote producteur de SCFA. Clostridium, Oscillospira, Ruminococcus, Gemmiger et Faecalibacterium (Fig. 1c) contiennent tous des espèces productrices de butyrate48,49. Notamment, la plupart de ces genres étaient également présents dans les autres groupes de donneurs mais n'étaient pas enrichis par l'alimentation FF. Cela pourrait être dû à des interactions complexes au niveau communautaire (par exemple, la concurrence) influençant les réponses des genres individuels aux fibres alimentaires, ou des différences au niveau de la souche en réponse au régime alimentaire, ou les deux.

Niveaux cæcaux d'acétate (a), de propionate (b), de butyrate (c), d'AGCC totaux (somme d'acétate, de propionate et de butyrate) (d), d'isobutyrate (e) et d'isovalérate (f). Les concentrations sont exprimées par gramme de contenu caecal en poids humide. Les tracés en boîte et à moustaches indiquent la plage interquartile, la médiane et la répartition des points dans 1,5 fois la plage interquartile ainsi que les points de données individuels. Les comparaisons des moyennes entre les régimes au sein de chaque groupe de donneurs (n = 7–10/régime/groupe de donneurs) ont été effectuées à l'aide d'un test de Wilcoxon, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Nos données sont cohérentes avec les études précédemment rapportées suggérant que la protection induite par le butyrate contre l'athérosclérose chez la souris se produit en l'absence de changements majeurs dans les taux de lipides plasmatiques22,24. Semblable à nos résultats, Kasahara et al.22 ont rapporté que l'introduction d'un microbe producteur de butyrate chez des souris colonisées par une communauté bactérienne simplifiée entraînait une réduction de la charge de plaque et de l'infiltration de macrophages chez des souris ApoE-/- sans modifications significatives de l'homéostasie du cholestérol. Cependant, Kasahara et al. ont également détecté des réductions induites par le butyrate de l'expression aortique des marqueurs inflammatoires Tnf-α, Il1-β et Vcam-1, que nous n'avons pas observées dans notre étude. De plus, une étude récente a révélé que la consommation de propionate protégeait contre l'athérosclérose en inhibant l'absorption de cholestérol dans l'intestin23. Bien que nous ayons observé une augmentation des taux de propionate caecal chez les souris colonisées par DonA consommant le régime FF, nous n'avons pas détecté de différences dans les taux de cholestérol plasmatique. La concentration et le site dans le tractus gastro-intestinal où le propionate s'accumule (c'est-à-dire une plus grande concentration dans l'intestin grêle lorsqu'il est consommé par voie orale par rapport à une plus grande concentration dans le gros intestin lorsqu'il est produit par fermentation des fibres) peuvent influencer son effet sur l'absorption du cholestérol. Ensemble, ces résultats suggèrent que la capacité de production d'AGCC dépend à la fois des fibres alimentaires accessibles et de la composition de la communauté microbienne. Ces résultats valident également la notion selon laquelle l'abondance de microbes producteurs de butyrate est associée aux niveaux cæcaux de butyrate.

Nous avons ensuite cherché à identifier les liens entre le potentiel fonctionnel du microbiome et l'athéroprotection en examinant les changements dans les profils métagénomiques microbiens. Nous avons effectué un séquençage shotgun de l'ADN isolé du contenu cæcal (moyenne de 29,4 ± 7,7 millions de lectures appariées/échantillon ; n = 5/groupe diète-donneur). Les données de séquence ont été analysées avec HUAnN3 pour générer des profils fonctionnels métagénomiques qui comprenaient les abondances d'orthologie KEGG (KO) pour chaque souris. Le regroupement hiérarchique des profils KO à l'aide de la dissimilarité Bray-Curtis montre que les groupes de traitement sont différents les uns des autres, mais l'effet du régime alimentaire sur les schémas de regroupement variait selon le donneur (Fig. 4a). Les souris colonisées par les communautés DonA et DonC se sont regroupées plus étroitement par régime alimentaire que par groupe de donneurs, ce qui suggère un niveau significatif de chevauchement influencé par FF dans les profils KO entre ces deux groupes de donneurs. Les souris DonB, en revanche, se sont regroupées séparément de toutes les autres souris mais regroupées en sous-groupes par régime alimentaire (Fig. 4a). Les abondances différentielles de KO individuels entre les souris nourries au FF et au CC au sein de chaque groupe de donneurs ont été calculées avec MaAsLin 2. Cette analyse a révélé que 2676 KO étaient significativement différents (P ajusté <0, 05) entre les régimes d'au moins un groupe de donneurs (DonA = 971; DonB = 1964; DonC = 1419). Parmi ceux-ci, seuls 67 (2, 5%) ont été enrichis par l'alimentation FF dans tous les groupes de donneurs, tandis que 79 (3%) ont été enrichis par l'alimentation CC dans tous les groupes de donneurs, ce qui suggère que la plupart des changements induits par l'alimentation dans les profils fonctionnels étaient spécifiques au donneur. Les souris colonisées par DonA et DonC partageaient les KO les plus enrichis en FF avec 326, tandis que les souris colonisées par DonA et DonB en partageaient 99, et les animaux colonisés par des souris colonisées par DonB et DonC partageaient 81 KO.

une Heatmap des profils KO exprimés en CPM pour chaque souris. Les profils individuels ont été regroupés à l'aide de la méthode de regroupement hiérarchique Spearman. b Voies KEGG surreprésentées et leur signification (représentée par le log10 de la valeur P d'enrichissement) identifiée par l'analyse d'enrichissement des voies à l'aide de listes de KO de chaque groupe de donneurs significativement régulés positivement (abondance différentielle MaAsLin 2, P ajusté <0,1). c Abondance différentielle MaAsLin 2 (axe du bas, barres colorées) et ampleur de l'effet (axe du haut, point plein = P ajusté < 0,1, point ouvert = P ajusté > 0,1) des KO impliqués dans la biosynthèse du folate et la biosynthèse de la cobalamine (vitamine B12). Les valeurs négatives reflètent l'abondance de KO (CPM) chez les souris nourries au CC et les tailles d'effet (coefficient MaAsLin 2) favorisant la condition CC, tandis que les valeurs positives indiquent les abondances de KO et les tailles d'effet dans la condition FF (n = 5/régime/groupe donneur).

Nous avons ensuite cherché à mieux comprendre comment le traitement alimentaire affectait les voies métaboliques des communautés microbiennes cæcales dans chaque groupe de donneurs. Nous étions particulièrement intéressés par l'identification des voies qui pourraient aider à expliquer l'athéroprotection associée à l'alimentation FF dans le DonA. Nous avons utilisé l'outil de voie MicrobiomeAnalyst KEGG50 pour effectuer une analyse d'enrichissement de la voie dans les KO qui étaient surreprésentés par l'alimentation FF par rapport à leurs homologues consommant le régime CC. Semblable aux résultats de taxonomie discutés ci-dessus, nous avons observé un manque d'universalité parmi les changements métagénomiques en réponse au régime alimentaire. Sur les 38 voies KEGG qui ont été détectées comme significativement surreprésentées (P ajusté <0, 1) par l'alimentation FF dans au moins un groupe de donneurs, seules trois (métabolisme du pyruvate, métabolisme des sucres aminés et des sucres nucléotidiques et biosynthèse des acides aminés) ont été observées dans les trois groupes de donneurs (Fig. 4b). Chez les souris colonisées par DonA, 27 voies étaient significativement surreprésentées dans le régime FF par rapport au régime CC. Celles-ci comprenaient les voies impliquées dans la synthèse des vitamines (biosynthèse de la thiamine ; biosynthèse des folates ; métabolisme de la porphyrine [vitamine B12]), la synthèse des SCFA (métabolisme du butanoate ; métabolisme du propionate) et le métabolisme des acides aminés (biosynthèse de la lysine ; métabolisme de la cystéine et de la méthionine ; métabolisme de l'histidine ; biosynthèse de la phénylalanine, de la tyrosine et du tryptophane ; biosynthèse de la valine, de la leucine et de l'isoleucine ; métabolisme de la glycine, de la sérine et de la thréonine ; Bio synthèse des acides aminés) (Fig. 4b). Fait intéressant, les effets alimentaires sur l'enrichissement des voies impliquaient la synthèse d'acétate (métabolisme du carbone, métabolisme du glyoxylate et du dicarboxylate et métabolisme du pyruvate), du propionate (métabolisme du propionate) et du butyrate (métabolisme du butanoate) correspondaient très étroitement aux niveaux SCFA cæcaux décrits ci-dessus (Figs. 4b et 3a – c).

Le folate et la vitamine B12 sont impliqués dans la détoxification de l'homocystéine, un métabolite du métabolisme de la méthionine qui a été lié aux maladies cardiovasculaires51,52. Une étude portant sur des souris ApoE−/− atteintes d'hyperhomocystéinémie a révélé qu'une supplémentation avec un mélange de folate, de vitamine B12 et de vitamine B6 protégeait contre l'athérosclérose53. De plus, une étude métagénomique récente chez l'homme a montré que les patients atteints de maladies cardiovasculaires (n = 218) présentaient une diminution de l'abondance des gènes codant pour les composants de la voie de biosynthèse des folates par rapport aux patients sains (n ​​= 187)17. Fait intéressant, les auteurs de cette étude ont également découvert que les maladies cardiovasculaires étaient associées à une plus faible abondance de gènes de synthèse de propionate et de butyrate. Pour obtenir une image plus détaillée de la dynamique métagénomique de ces voies, nous avons comparé les abondances différentielles des KO individuels impliqués dans la biosynthèse des folates (KEGG map00790) et la biosynthèse anaérobie de la cobalamine (vitamine B12) (KEGG M00924). En accord avec notre analyse d'enrichissement, la plupart des KO différentiellement abondants dans les deux voies étaient significativement régulés à la hausse par l'alimentation en FF chez les souris colonisées par DonA, mais pas dans les autres groupes (Fig. 4c). Le folate et la vitamine B12 ont été fournis dans les régimes FF et CC au même taux d'inclusion (mélange de vitamines AIN-93, tableau supplémentaire 1), mais il est possible qu'une certaine quantité de vitamines supplémentaires disponibles via la biosynthèse microbienne ait un effet physiologique sur le métabolisme de l'homocystéine de l'hôte. Ces résultats suggèrent que la production microbienne de vitamines B12 et de folate pourrait agir comme un médiateur potentiel de l'athéroprotection associée au régime FF chez les souris colonisées par cette communauté.

Pour découvrir les associations entre l'athéroprotection et le métabolisme des fibres, nous avons déterminé le niveau et le type de familles d'enzymes glucidiques actives (CAZyme) entre les traitements alimentaires au sein de chaque groupe de donneurs à l'aide de données métagénomiques caecales. Nous avons détecté un certain nombre de familles CAZyme qui étaient très abondantes dans tous les groupes de donneurs et largement insensibles au régime alimentaire (Fig. 5a, b, Fig. 5 supplémentaire). L'analyse de l'abondance différentielle a révélé que les familles CAZyme les plus affectées par le régime alimentaire étaient environ 100 fois inférieures aux CAZymes les plus abondantes (Fig. 5c). Compte tenu des différences de niveaux de SCFA caecal entre les groupes de traitement, cela suggère que ces CAZymes hautement différentiels et à faible abondance ont un impact démesuré sur la dynamique du métabolisme des SCFA. Pour mettre en évidence les familles de CAZyme les plus différentiellement abondantes, nous avons comparé les abondances des familles de CAZyme les plus affectées par le régime alimentaire (10 % supérieurs par taille d'effet MaAsLin 2 au sein de chaque groupe de donneurs, Fig. 5c). La grande majorité des CAZymes enrichis en FF chez les souris colonisées par DonA étaient significativement corrélés (Spearman, P <0, 05) avec les niveaux de butyrate cæcal, les liant potentiellement à la production de butyrate (Fig. 5c). Une telle famille CAZyme, GH59, englobe les β-galactosidases qui libèrent les monomères β-D-galactose terminaux des chaînes latérales galactane de la pectine54. Fait intéressant, de nombreuses familles de CAZyme couramment citées impliquées dans l'inuline, la pectine, le RS-2/4 et le scFOS n'ont pas été trouvées parmi les CAZymes les plus différentiellement abondantes dans notre ensemble de données. Il est possible que l'inclusion de plusieurs fibres fermentescibles crée une concurrence entre les microbes spécialisés pour chaque type de fibre, réduisant ainsi l'ampleur des changements détectés dans les CAZymes spécifiques aux fibres.

une carte thermique des profils de la famille CAZyme classés par catégorie (glycoside hydrolase = GH ; glycosyltransférases = GT ; modules de liaison aux glucides = CBM ; esters glucidiques = CE ; et polysaccharide lyases = PL) ainsi que les nombres moyens pour chaque famille CAZyme exprimés en nombres par million (CPM). Les profils de souris ont été regroupés à l'aide de la méthode de regroupement hiérarchique de Spearman. b Comparaison de la richesse de la famille CAZyme entre les régimes (nombre total de familles CAZyme détectées dans chaque catégorie CAZyme) par groupe de donneurs. Les diagrammes à barres indiquent la moyenne avec des points de données individuels ; les comparaisons de moyennes entre les groupes alimentaires ont été réalisées à l'aide du test de Wilcoxon ; *P < 0,05, **P < 0,01. c Abondance différentielle MaAsLin 2 (axe du bas, barres colorées) et taille de l'effet (axe du haut, point plein = P ajusté < 0,1, point ouvert = P ajusté > 0,1) des 10 % de CAZymes les plus différentiellement abondants (n = 5/régime/groupe donneur). Le panneau de droite représente une carte thermique des coefficients de corrélation de Spearman entre chaque famille CAZyme correspondante et les niveaux SCFA caecaux chez toutes les souris, * P <0, 05.

En résumé, nous avons montré que le microbiome intestinal régule l'effet des fibres alimentaires sur le développement de l'athérosclérose chez des souris gnotobiotiques ApoE−/− colonisées par différentes communautés fécales humaines. Nous avons constaté que les changements induits par l'alimentation dans la composition microbienne, le potentiel métabolique et la production métabolique (SCFA) variaient entre les différents groupes de donneurs. Nos résultats ont montré que l'athéroprotection était associée à une augmentation des niveaux de butyrate caecal et à une abondance d'organismes producteurs de butyrate. De plus, le séquençage métagénomique du fusil de chasse a révélé des changements dépendants du donneur dans les gènes impliqués dans le métabolisme des glucides, la production d'AGCC et la synthèse des vitamines. Ces données étayent l'idée que les modifications du microbiote intestinal associées à l'alimentation ne sont pas uniquement fonction de l'alimentation, mais sont plutôt le résultat d'interactions complexes entre l'alimentation et la structure et le réseau fonctionnel de la communauté microbienne intestinale plus large. Ces résultats sont également en accord avec des travaux antérieurs montrant que le butyrate est athéroprotecteur sans modifier le métabolisme du cholestérol22,24.

L'étude actuelle présente certaines limites qui doivent être abordées. Tout d'abord, nous avons observé une efficacité de greffe imparfaite du donneur humain au receveur de la souris. Comme discuté ci-dessus, nous avons détecté des différences dans les schémas de prise de greffe avant le traitement des souris DonA. Nos données suggèrent que cette différence de détection était probablement une conséquence de la stochasticité des communautés microbiennes peu de temps (deux semaines) après la colonisation et non le résultat de différences d'inoculation ou de contamination. Néanmoins, cet écart introduit la possibilité que les différences observées dans l'athérosclérose chez les souris DonA soient dues à une prise de greffe incohérente plutôt qu'à une réponse au régime alimentaire. Une autre limite est que notre étude n'a utilisé que trois donneurs humains. Une cohorte de donneurs beaucoup plus importante et plus diversifiée serait nécessaire pour apprécier pleinement l'étendue des réponses cardiométaboliques à ces régimes, mais le groupe limité utilisé ici est suffisant pour démontrer que l'effet athéro-modulateur des fibres alimentaires dépend du microbiote. Cette étude est en outre limitée par l'utilisation de souris femelles uniquement, ce qui nous empêche de tester l'effet du sexe. Enfin, les régimes CC et FF utilisés dans cette étude différaient légèrement dans leur teneur en amidon, ce qui peut contribuer aux différences décrites ci-dessus.

Malgré ces limites, les travaux présentés ici suggèrent que la variation du microbiome module les réponses à la consommation de fibres alimentaires, ce qui peut avoir un impact différentiel sur le développement de l'athérosclérose. Ensemble, ces résultats soutiennent l'idée que les interventions diététiques ne sont pas universellement efficaces et doivent être adaptées aux individus. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre les mécanismes pertinents et la dynamique métabolique et écologique qui régissent les réponses individuelles au régime alimentaire dépendantes du microbiome.

Tous les animaux de l'étude actuelle ont été manipulés et entretenus conformément aux normes de l'Université du Wisconsin-Madison en matière de bien-être animal et tous les protocoles ont été approuvés par le comité de protection et d'utilisation des animaux de l'université. Des souris ApoE-/- sans germes (GF) (GF dérivées de B6.129P2-Apoetm1Unc/J; Jax 002052) ont été logées dans un environnement contrôlé dans des isolateurs gnotobiotiques sous un cycle lumière/obscurité de 12 h et ont reçu de l'eau autoclavée et de la nourriture (LabDiet 5021; LabDiet, St. Louis, MO) ad libitum. Les souris ont été hébergées avec de la literie Alpha-dri® (Shepherd Specialty Papers, Kalamazoo, MI) et ont été enrichies avec des huttes en papier (Bio-Huts, Bio-Serv, Flemington, NJ) et ALPHA-twistTM (Shepherd Specialty Papers). Le statut GF des isolateurs a été évalué mensuellement par PCR à l'aide d'amorces universelles d'ARNr 16S avec de l'ADN fécal ainsi qu'un test de croissance des matières fécales dans un milieu riche incubé à 37 ° C en aérobiose et en anaérobiose pendant 7 jours.

Les échantillons fécaux humains utilisés dans cette étude ont été prélevés sur les participants dans le cadre de l'étude longitudinale du Wisconsin (WLS)36,55 et conservés à -80 °C. Les données WLS et la collecte d'échantillons ont été approuvées par le comité d'examen interne UW-Madison (2014-1066, 2015-0955) et un consentement éclairé écrit a été obtenu dans l'étude originale55. Dans une publication précédente de notre groupe35, un sous-ensemble d'échantillons WLS candidats ont été sélectionnés en fonction de leurs structures communautaires bactériennes distinctes, puis transplantés dans des souris GF pour mesurer les profils SCFA caecaux. Dans la présente étude, nous avons utilisé ces informations pour sélectionner trois échantillons de donneurs humains : le microbiote du donneur WLS-échantillon-8 (appelé ici DonA) ; donneur WLS-échantillon-1 (appelé ici DonB) et donneur WLS-échantillon-5 (appelé ici DonC). Dans notre étude précédente35, nous avons constaté que des souris gnotobiotiques consommant un régime semi-purifié contenant un assortiment de fibres comprenant de l'amidon résistant de type 2 et 4, des fructo-oligosaccharides à chaîne courte, de l'inuline et de la pectine colonisées par DonA, DonB ou DonC accumulaient différents niveaux de SCFA. Les souris colonisées avec DonA ont accumulé les niveaux les plus élevés de butyrate caecal (~ 1,5 mM) parmi tous les donneurs testés, tandis que les souris colonisées par DonB ont accumulé des niveaux significativement plus faibles de butyrate caecal (~ 0,6 mM) et les souris colonisées par DonC ont montré les niveaux les plus élevés de propionate caecal (~ 10 mM) et les niveaux intermédiaires de butyrate (~ 1,0 mM)35. Tous les échantillons WLS utilisés dans la présente étude ont été obtenus auprès de sujets qui ont déclaré avoir consommé un régime alimentaire de type occidental, étaient en surpoids (IMC> 25) et n'ont pas été diagnostiqués avec du diabète, un cancer ou une maladie cardiaque35,36. Les informations identifiables des participants au WLS ont été masquées pour les chercheurs de l'étude actuelle.

À l'âge de 6 semaines, les souris ont été transférées dans des cages ventilées sur un système de rack Allentown Sentry SPP IVC (Allentown Inc., Allentown, NJ) et placées dans un régime FF irradié contenant 10 % de fibres totales (wt/wt) composé de 5 fibres fermentescibles (inuline, pectine, FOS à chaîne courte, RS-2 et RS-4 ; Fig. 1 supplémentaire, tableau supplémentaire 1). Les taux d'inclusion de chaque source de fibres fermentescibles ont été ajustés individuellement en fonction de la pureté et de la teneur en cendres pour obtenir un taux d'inclusion efficace de 2 % de fibres alimentaires provenant de chaque source de fibres. Une semaine plus tard, les souris GF ont été colonisées par le microbiote de l'un des échantillons fécaux WLS (DonA, DonB ou DonC) par un seul gavage oral d'une boue fécale ou par cohabitation. Les boues ont été préparées de manière anaérobie en homogénéisant environ 200 mg de matières fécales humaines congelées dans 5 ml de Mega Media35 pré-réduit dans une chambre anaérobie, puis ont été immédiatement utilisées pour gavager les souris receveuses à l'aide de seringues rincées avec une atmosphère anaérobie. Un sous-ensemble de souris GF a été colonisé par cohabitation avec des souris qui avaient été colonisées par gavage avec des matières fécales humaines 4 semaines auparavant. La cohabitation est une stratégie efficace pour coloniser les souris sans germes et est similaire au gavage en termes de colonisation du microbiote et de transfert de phénotype56,57. Nous n'avons pas été en mesure de détecter des différences dans les profils microbiens cæcaux, et nous n'avons pas non plus observé de différences significatives dans les phénotypes entre les souris co-hébergées et leurs homologues colonisés par gavage (Fig. 2a, b, tableau supplémentaire 2). Par conséquent, nous avons considéré toutes les souris du même groupe de traitement comme des répliques biologiques, quelle que soit la méthode de colonisation. Partant du principe qu'un régime avec une plus grande diversité de sources de fibres favoriserait la colonisation de plus de microbes, les souris ont été maintenues au régime FF pendant deux semaines supplémentaires pour permettre à la colonisation de se stabiliser avant la phase de traitement diététique. Lors du traitement diététique, les souris ont continué le régime FF ou ont été remplacées par le régime CC contenant 10 % de cellulose (tableau supplémentaire 1), un témoin de fibres non fermentescibles. Tous les régimes expérimentaux de cette étude ont été emballés sous vide et stérilisés par irradiation par le fabricant. Le régime FF et le régime CC ne différaient que par leurs sources de fibres. Notre conception expérimentale (Fig. 1 supplémentaire) a abouti à six groupes de traitement (trois donneurs et deux régimes; n = 7 à 10 souris par groupe de traitement), chacun ayant été mené dans deux cohortes séparées en cage pour tenir compte des effets de cage. Après 11 semaines de traitement diététique, les souris ont été sacrifiées à l'âge de 20 semaines après 4 h de jeûne.

Lors du sacrifice, le cœur a été perfusé avec du tampon PBS avant d'être coupé latéralement au milieu du cœur et de l'aorte ascendante pour capturer le sinus aortique. Ce tissu a été intégré dans un composé OCT, congelé sur de la neige carbonique et stocké à -80 ° C jusqu'à un traitement ultérieur. Pour caractériser les plaques d'athérosclérose dans le sinus aortique, le tissu intégré a été sectionné sur un cryostat (CM1950, Leica, Deer Park, IL) et collecté sur des lames à des intervalles de 100 µm, se déplaçant de manière proximale de la base de la racine aortique vers l'aorte ascendante. Il en est résulté des diapositives contenant huit sections équidistantes (10 µm d'épaisseur) couvrant 700 µm du sinus aortique (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 µm de la base de la racine aortique). Les lames fixées au formol de chaque souris ont été rincées avec de l'isopropanol à 60% pendant 1 min, colorées pour les lipides à l'aide d'Oil Red O pendant 15 min et contre-colorées avec de l'hématoxyline pendant 1 min. L'évaluation de l'infiltration macrophage des plaques d'athérosclérose a été réalisée en incubant des lames fixées au formol (même schéma de coupe que ci-dessus) pendant une nuit avec des anticorps macrophages (MOMA-2, 1:50 ; ab33451, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) suivies d'une incubation avec des anticorps secondaires (1 : 400 ; ab6733, Abcam) pendant 1 h et de la streptavidine peroxydase de raifort (1 : 500 ; P0397, Agilent, Santa Clara, Californie) pendant 15 minutes. Les sections ont ensuite été lavées avec du PBS et contre-colorées avec du DAB pendant 15 s et de l'hématoxyline pendant 5 s. Les images de toutes les sections colorées ont été capturées numériquement puis analysées sur ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) pour mesurer la zone lipidique positive, la zone totale de plaque et la zone positive MOMA-2. Les zones de plaque et les zones lipidiques positives pour chaque souris sont exprimées sous forme de moyennes sur les huit sections. Pour calculer l'infiltration de macrophages, les trois sections avec les plus grandes lésions visibles ont été sélectionnées à partir de chaque souris et leurs densités de zone positive MOMA-2 ont été moyennées. Un échantillon a été perdu pendant le traitement, de sorte que la taille des échantillons pour la caractérisation de l'athérosclérose variait de 7 à 10 échantillons par groupe de traitement.

Les niveaux de SCFA dans le contenu caecal ont été mesurés en utilisant la chromatographie en phase gazeuse de l'espace de tête. Des échantillons ont été préparés en ajoutant 20 à 150 mg de contenu caecal congelé à des flacons (Restek, Bellefonte, PA) contenant N µL d'eau (où N équivaut à 300 moins le mg de contenu caecal) avec 2 g de NaH2SO4 et 1 ml de 60 µM 2-butanol réfrigéré comme étalon interne. Les préparations ont été immédiatement scellées dans un flacon d'échantillonnage GC, puis laissées reposer pendant une nuit à température ambiante. Les étalons pour l'acétate, le propionate, l'isobutyrate, le butyrate, l'isovalérate, le valérate et ont été combinés à des concentrations connues (pH 7,0) et dilués en série pour générer une courbe standard. Les flacons ont été chargés dans un échantillonneur d'espace de tête HS-20 (Shimadzu, Columbia, OH), agités pendant 20 min à 80 ° C et injectés sur une colonne SH-Stabilwax de 30 m (227-36246-01, Shimadzu) connectée à un détecteur à ionisation de flamme sur un CG-2010 Plus GC (Shimadzu). Les conditions de fonctionnement étaient les suivantes : le flacon d'échantillon a été équilibré à 80 kPa pendant 3 minutes avant l'injection ; l'injection a été effectuée à l'aide d'une boucle d'injection de 2 mL, d'une période de chargement de 12 s avec la ligne de transfert à 150 °C, d'un rapport de division de 1:15 et d'un débit de colonne N2 de 1,2 mL/min ; la température de la colonne a été maintenue à 40 °C pendant 2 min, puis augmentée à 200 °C à une vitesse de 20 °C/min, maintenue pendant 2 min, puis réduite à 120 °C (-20 °C/min), réduite à 40 °C (-40 °C/min) et maintenue à 40 °C pendant 1 min. Les aires sous la courbe pour chaque composé cible ont été calculées avec le logiciel Shimadzu Lab Solution (version 5.92) et normalisées par la masse de l'échantillon et le facteur de dilution et converties en μmol·g-1 à l'aide d'une courbe standard.

Du sang a été prélevé sur des souris sous anesthésie induite par l'isoflurane par ponction cardiaque à l'aide d'une seringue rincée à l'EDTA. Les cellules sanguines ont été séparées par centrifugation puis le plasma a été collecté et stocké à -80 °C. Les taux plasmatiques de triglycérides, de cholestérol total et de cholestérol à lipoprotéines de haute densité (HDL) ont été mesurés à l'aide de kits de dosage colorimétrique disponibles dans le commerce de Waco Diagnostics (réf. 994-02891, 99902601, 997-01301, respectivement ; Fujifilm, Tokyo, Japon) conformément aux instructions du fabricant.

L'ARN total a été extrait de l'aorte congelée à l'aide du réactif TRIzol (Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) avec 2 minutes de battement de billes (BioSpec Products, Barlesville, OK) à température ambiante dans des tubes contenant 1,0 g de billes de zirconium de 1 mm de diamètre (BioSpec Products) et nettoyées avec le mini kit Qiagen RNeasy (Qiagen, Hilden, Allemagne). L'ADNc matrice a été synthétisé en utilisant 125 ng d'ARN purifié dans des volumes de réaction de 20 µL. L'ADNc a été dilué 1:1 avec de l'eau puis 1 µL a été mélangé avec SYBR qPCR Mastermix (Bio-Rad, Hercules, CA) et combiné avec les amorces appropriées (400 nM) et de l'eau pour un volume de réaction total de 10 µL. Une liste d'amorces est présentée dans le tableau supplémentaire 3. Le protocole de cyclage a été réalisé à l'aide du lien Mastercycler® (Eppendorf, Hambourg, Allemagne) comme suit : 30 s à 95 ˚C, suivi de 35 cycles de 10 s à 95 ˚C, 30 s à 60 ˚C. Une courbe de fusion a été réalisée de 65 °C à 95 °C par incréments de 0,5 °C à 5 s/pas. Toutes les réactions ont été réalisées en double et les valeurs delta-delta-Ct ont été calculées par rapport au contrôle endogène (Gapdh).

L'ADN a été extrait de tout le contenu caecal et des excréments de souris ainsi que des boues fécales humaines à l'aide d'une méthode d'extraction au phénol-chloroforme qui comprenait une étape de battage de billes58. L'amplification du gène de l'ARNr 16S (V4) a été réalisée par PCR impliquant des codes à barres uniques (8 pb) à la fois sur les amorces sens et antisens qui sont fusionnées aux adaptateurs Illumina59. Les amplicons V4 de chaque échantillon ont été combinés et soumis pour séquençage sur une analyse Illumina MiSeq (2 × 250 pb, Illumina, San Diego, CA) à l'Université du Wisconsin, installation de séquençage d'ADN du Madison Biotechnology Center. Les échantillons avec moins de 20 % du nombre moyen de lectures d'échantillons ont été exclus, ce qui a entraîné le retrait de quatre échantillons de l'analyse ultérieure. Les échantillons restants variaient de 33 869 à 133 538 lectures appariées avec une moyenne de 77 704 lectures appariées par échantillon. Qiime2 (version 2019.10) a été utilisé pour générer des tables de variantes de séquence d'amplicon (ASV) et des tables de taxonomie à partir des lectures d'ARNr 16S. Les lectures démultiplexées ont été coupées et filtrées pour la qualité avec le plug-in Qiime2 DADA260. Les ASV ont été annotés au niveau du genre avec la base de données de référence SILVA61 (version 132) en utilisant le classificateur Naïve Bayes dans Qiime2. Toutes les analyses ultérieures ont été effectuées dans R. ASV-level feature counts normalized by converting to relative abondance. Les ASV ont été filtrés pour n'inclure que ceux dont l'abondance relative moyenne était d'au moins 0,0001 dans tous les échantillons cæcaux. Pour l'analyse au niveau du genre, un seuil a été fixé à 0,0005 abondance relative moyenne dans tous les échantillons. Ces seuils ont également été appliqués à l'échantillon fécal ASV et aux profils de genres (boues fécales d'inoculum humain et matières fécales de souris avant le traitement diététique). L'efficacité de la greffe a été calculée comme le nombre de caractéristiques qui ont été détectées dans les matières fécales de souris avant le traitement d'au moins un animal par donneur ou donneur/groupe de régime divisé par le nombre de caractéristiques détectées dans la boue fécale du donneur. La détection positive a été définie comme toute caractéristique (ASV ou genre) qui s'est avérée supérieure à 0,0001 d'abondance relative dans un échantillon donné.

L'ADN génomique isolé du contenu caecal de 5 souris par groupe de traitement a été utilisé pour l'analyse métagénomique. Les bibliothèques ont été préparées à l'aide du kit sans PCR Illumina TruSeq en suivant les protocoles du fournisseur et séquencées à l'installation de séquençage d'ADN du Centre de biotechnologie de l'Université du Wisconsin. Tous les échantillons ont été analysés sur une seule ligne NovaSeq6000 2 × 150 S4-Flowcell. Les séquences résultantes ont été coupées pour la qualité à l'aide de Trimmomatic (version 0–39), puis alignées sur les génomes hôtes de référence (Mus musculus GRCm38_Rel98) avec bowtie2 (version 2.3.4) pour supprimer les lectures hôtes (le taux d'alignement moyen de l'hôte était de 5,3 %) ne laissant que des lectures non hôtes de haute qualité. Le nettoyage a finalement abouti à une moyenne de 29,4 millions de lectures appariées par échantillon.

Les lectures restantes après le découpage et la suppression des séquences hôtes ont été concaténées dans un seul fichier fastq et introduites dans HUMAnN3 (version 3.0.0.alpha.4) pour l'annotation fonctionnelle. Cela a abouti à un tableau d'abondance de la famille de gènes UniRef9062 en lectures par kilobase et à un tableau d'abondance relative des taxons microbiens pour chaque souris. Les tables d'abondance de la famille de gènes UniRef90 ont été converties en tables d'abondance de comptes par million de KO (CPM) avec les fonctions human_regroup_table et human_renorm_table. Une analyse d'abondance différentielle a été effectuée sur les KO qui étaient présents dans au moins 25 % des échantillons.

Les profils CAZyme de chaque échantillon ont été prédits à l'aide de run_dbcan (version 2.0.11). Nous avons assemblé des lectures nettoyées (coupées, sans hôte) dans des contigs avec metaSPAdes (version 3.14.0) avec plusieurs tailles de k-mer (metaspades.py -k 21, 33, 55, 77). Les contigs inférieurs à 500 pb ont été écartés du traitement ultérieur. Les cadres de lecture ouverts (ORF, c'est-à-dire les métagènes microbiens) ont été prédits à partir de contigs assemblés via Prodigal (version 2.6.3) à l'aide du modèle de Markov caché (HMM) avec des paramètres par défaut. Tous les gènes prédits inférieurs à 100 pb ont été écartés du traitement ultérieur. Les séquences ORF nucléotidiques ont été converties en séquences d'acides aminés et ont été utilisées comme entrée pour run_dbcan (version 2.0.11) pour prédire les profils CAZyme. L'annotation CAZyme était acceptée si un ORF était annoté par >= 2 outils (DIAMOND, HMMER, Hotpep). Cela a abouti à un tableau indiquant la présence ou l'absence de chaque famille CAZyme dans la base de données CAZyme. Pour estimer l'abondance de CAZyme, chaque famille de CAZyme s'est vu attribuer une valeur de comptage par million (CPM) de son ORF associé, comme prévu par Prodigal. Si plusieurs CAZymes étaient prédits à partir du même ORF, ils se voyaient tous attribuer la valeur CPM de l'ORF.

Les tracés PCoA et les mesures de diversité ont été générés à l'aide de profils ASV d'ARNr 16S avec le package phyloseq (version 1.40.0) dans R. Tous les tests PERMANOVA par paires ont été effectués entre les groupes alimentaires au sein de chaque groupe de donneurs à l'aide du package R pairwiseAdonis (version 0.4) avec 9999 permutations. L'analyse de l'abondance différentielle au niveau des caractéristiques de la taxonomie des amplicons d'ARNr 16S, des abondances de KO métagénomiques de fusil de chasse et des abondances de CAZyme métagénomiques de fusil de chasse a été réalisée à l'aide de la fonction MaAsLin 2 dans le package R MaAsLin 2 (version 1.10.0) avec les paramètres par défaut41. Pour évaluer l'enrichissement de la voie KO, des ensembles de KO significativement régulés positivement par l'alimentation FF (abondance différentielle MaAsLin 2, P ajusté <0,1) ont été générés pour chaque groupe de donneurs et utilisés comme entrée pour la fonction PerformKOEnrichAnalysis_KO01100 dans le package MicrobiomeAnalyistR (version 0.0.0.9000) dans R avec les paramètres par défaut. Cela a abouti à une liste de voies KEGG qui étaient significativement (P <0, 05) surreprésentées chez les souris nourries au FF au sein de chaque groupe de donneurs. Les familles de CAZymes étaient considérées comme très différentielles si elles appartenaient aux 10 % supérieurs de CAZymes classés par taille d'effet MaAsLin 2 au sein de chaque groupe de donneurs, quelle que soit la direction (valeur absolue de la taille d'effet).

Sauf indication contraire, les comparaisons des moyennes ont été effectuées à l'aide d'un test de somme des rangs de Wilcoxon bilatéral entre les groupes alimentaires au sein de chaque groupe de donneurs. Une variance égale a été déterminée pour tous les tests de moyenne (test de Levene, P > 0,05) à l'exception des comparaisons des plaques d'athérosclérose (taille, teneur en lipides, infiltration de macrophages) et des niveaux d'AGCC cæcaux qui se sont avérés avoir des variances significativement différentes entre les régimes (test de Levene, P < 0,05). Les corrélations entre les CAZymes et les niveaux d'AGCC caecal ont été réalisées en utilisant toutes les souris pour calculer le coefficient de corrélation de rang de Spearman. L'ajustement de la valeur P pour PERMANOVA a été effectué à l'aide de la méthode Bonferroni, tandis que toutes les autres valeurs P ajustées ont été calculées à l'aide de la méthode Benjamini-Hochberg.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données de séquençage rapportées dans cette étude sont disponibles auprès de l'European Nucleotide Archive (ENA) sous le numéro d'accès à l'étude PRJEB58699.

Le code utilisé dans cette étude est disponible sur demande.

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Les auteurs remercient le Dr Barbara Mickelson (Envigo) pour son aide avec les régimes. Nous remercions également l'installation de séquençage de l'ADN du Centre de biotechnologie de l'Université du Wisconsin-Madison pour avoir fourni des services de séquençage et de soutien. Nous remercions le Center for High Throughput Computing (CHTC) de l'Université du Wisconsin-Madison du Département d'informatique pour ses ressources informatiques, son soutien et son assistance. Ce travail a été en partie financé par des subventions du NIH HL144651 (FER), HL148577 (FER) et EB030340 (FER). Ce travail a également été soutenu par une bourse du Prix des Réseaux Transatlantiques d'Excellence de la Fondation Leducq (17CVD01). L'ERH a été soutenue en partie par le programme de formation sur le métabolisme et la nutrition NIH T32 (DK007665) et par l'Université du Wisconsin-Madison Food Research Institute (Robert H. et Carol L. Deibel Distinguished Graduate Fellowship in Probiotic Research). T.-WLC a été soutenu par les National Institutes of Health, dans le cadre du prix Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 HL007936 du National Heart Lung and Blood Institute au centre de recherche cardiovasculaire de l'Université du Wisconsin-Madison.

Programme de formation doctorale en microbiologie, Université du Wisconsin-Madison, Madison, WI, États-Unis

Evan R. Hutchison

Département de bactériologie, Université du Wisconsin-Madison, Madison, WI, États-Unis

Evan R. Hutchison, Kazuyuki Kasahara, Qijun Zhang, Eugene I. Vivas, Tzu-Wen L. Cross et Federico E. King

École de médecine Lee Kong Chian, Université technologique de Nanyang, Singapour, Singapour

Kazuyuki Kasahara

Département des sciences de la nutrition, Université Purdue, West Lafayette, IN, États-Unis

Tzu-Wen L. Croix

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ERH, T.-WLC et FER ont conçu l'étude. ERH, KK et EIV ont réalisé les expériences sur la souris et collecté les tissus. L'ERH a effectué une analyse du phénotype de l'athérosclérose. ERH et QZ ont effectué une analyse métagénomique intestinale. ERH et FER ont préparé le manuscrit. Ce manuscrit a été approuvé par tous les auteurs.

Correspondance à Federico E. Rey.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Hutchison, ER, Kasahara, K., Zhang, Q. et al. Dissection de l'impact du type de fibres alimentaires sur l'athérosclérose chez des souris colonisées par différentes communautés microbiennes intestinales. npj Biofilms Microbiomes 9, 31 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00402-7

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Reçu : 30 décembre 2022

Accepté : 18 mai 2023

Publié: 03 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41522-023-00402-7

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