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Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 512 (2023) Citer cet article

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Le microbiote intestinal humain produit des dizaines de petites molécules qui circulent dans le sang, s'accumulent à des niveaux comparables à ceux des médicaments pharmaceutiques et influencent la physiologie de l'hôte. Malgré l'importance de ces métabolites pour la santé et les maladies humaines, l'origine de la plupart des molécules produites par des microbes et leur devenir chez l'hôte restent largement inconnus. Ici, nous découvrons une voie co-métabolique hôte-microbe pour la génération d'acide hippurique, l'un des acides organiques les plus abondants dans l'urine des mammifères. En combinant le traçage des isotopes stables avec la génétique bactérienne et hôte, nous démontrons la réduction de la phénylalanine en acide phénylpropionique par les bactéries intestinales ; l'hôte réoxyde l'acide phénylpropionique impliquant l'acyl-CoA déshydrogénase à chaîne moyenne (MCAD). La génération de souris MCAD−/− mâles et femelles exemptes de germes a permis une colonisation gnotobiotique combinée à une métabolomique non ciblée pour identifier des métabolites microbiens supplémentaires traités par MCAD dans la circulation de l'hôte. Nos découvertes révèlent une voie hôte-microbe pour l'hippurate de métabolite abondant et non toxique de la phénylalanine et identifient la β-oxydation via MCAD comme un nouveau mécanisme par lequel les mammifères métabolisent les métabolites dérivés du microbiote.

Le microbiome intestinal humain produit de nombreuses petites molécules de type médicament qui ont un impact sur divers aspects de la biologie humaine1,2,3,4. Ces molécules sont produites dans l'intestin via le métabolisme de molécules dérivées de l'alimentation et de l'hôte telles que les glycanes, les protéines et les acides aminés. Les métabolites dépendants du microbiote impactent la physiologie localement dans l'intestin où leurs concentrations sont les plus élevées. Cependant, un sous-ensemble est absorbé à travers la paroi intestinale et circule dans tout le corps où il peut influencer la physiologie de l'hôte au niveau des organes distaux de l'intestin5,6,7,8,9. Malgré une abondante littérature récente documentant l'impact des métabolites microbiens sur l'hôte, des lacunes importantes existent dans nos connaissances sur ces molécules. Les principaux d'entre eux sont le manque de clarté sur la manière dont les métabolites générés par le microbiote interagissent avec le métabolisme de l'hôte, ainsi que sur l'identité et le devenir des principaux produits. Une telle compréhension est essentielle pour comprendre comment la génétique de l'hôte influence le spectre des métabolites microbiens chez un individu et identifiera de nouveaux biomarqueurs pour les fonctions microbiennes dans l'intestin.

Les métabolites microbiens intestinaux pénètrent dans la circulation de l'hôte où ils sont métabolisés par des enzymes impliquées dans le métabolisme de phase I (modification par oxydation, réduction et hydrolyse) et de phase II (conjugaison avec le glutathion, le sulfate, l'acide glucuronique ou les acides aminés, généralement la glycine ou la glutamine), classiquement connus pour leur rôle dans le métabolisme des médicaments. Les produits du métabolisme de phase I et de phase II des métabolites microbiens comprennent : (1) le sulfate d'indoxyle10,11,12, un co-métabolite hôte-microbe du tryptophane dont les taux plasmatiques augmentent lorsque les reins échouent, et on pense qu'il contribue aux séquelles cardiovasculaires dans l'insuffisance rénale terminale13, 14 ; (2) le sulfate de p-crésol, le produit sulfaté de la dégradation microbienne de la tyrosine, est associé à des lésions cardiovasculaires et rénales9, 15 ; (3) le N-oxyde de triméthylamine, un co-métabolite hôte-microbe de composés contenant du triméthyle comme la choline, dont les taux plasmatiques sont associés à des effets indésirables chez les patients atteints de maladies cardiovasculaires7. De nombreux métabolites dérivés du côlon chez l'homme sont soumis à des réactions de sulfatation et de glucuronidation16, mais la mesure dans laquelle les voies métaboliques alternatives de l'hôte contribuent au reste important de métabolites d'origine microbienne reste à définir.

Nous avons précédemment démontré le rôle du groupe de gènes de la phényllactate déshydratase (FldABC, Fig. 1a) dans le métabolisme réducteur des acides aminés aromatiques par les bactéries intestinales, représentant neuf métabolites qui circulent dans l'hôte17, dont l'acide indolepropionique (IPA) - un métabolite microbien de tryptophane qui module la perméabilité intestinale17, 18. Ici, nous avons cherché à comprendre comment l'hôte métabolise des composés supplémentaires générés par le locus fld qui entrent dans la circulation (Fig. 1 supplémentaire). En utilisant le profilage métabolique et la colonisation gnotobiotique de souris de type sauvage (wt), nous constatons que le locus fld est un déterminant clé pour l'un des métabolites urinaires humains les plus concentrés, l'acide hippurique. Des expériences gnotobiotiques avec des souris transgéniques révèlent que les produits du locus fld sont soumis à une β-oxydation chez l'hôte via l'acyl-CoA déshydrogénase à chaîne moyenne (MCAD). Nos découvertes révèlent un mécanisme auparavant méconnu pour le co-métabolisme hôte-microbe qui contribue aux métabolites qui circulent dans l'hôte.

a Aperçu schématique du locus du gène C. sporogenes et de la voie biochimique codée responsable du métabolisme réducteur des acides aminés aromatiques. fldC, sous-unité C de phényllactate déshydratase. b Des souris Swiss Webster exemptes de germes ont été mono-colonisées avec C. sporogenes de type sauvage ou son mutant fldC. Les fluides corporels ont été recueillis et analysés par métabolomique GC-TOF shotgun. c, e Métabolites significativement enrichis en WT (vert, changement de pli positif) ou souris colonisées par fldC (rouge, négatif) ; les métabolites significatifs sont colorés, des tests t bilatéraux appariés avec une procédure progressive linéaire en deux étapes de Benjamini, Krieger et Yekutieli, valeur P ajustée < 0,05. d, f Métabolites correspondant à (c, e) qui diffèrent significativement entre les souris colonisées par WT et fldC ; chaque colonne représente l'intensité maximale normalisée en ligne pour une souris individuelle, les métabolites ont été inclus dans la carte thermique s'ils étaient significatifs dans au moins deux compartiments hôtes échantillonnés. Toutes les découvertes importantes sont rapportées dans les données supplémentaires 2. g Altérations fldC-dépendantes des niveaux de métabolites dans les voies oxydatives et réductrices du métabolisme de la phénylalanine dans la lumière intestinale et métabolites potentiellement liés dans l'urine de l'hôte. Le schéma de la souris en b a été adapté de la réf. 17.

Des souris sans germes ont été mono-colonisées avec des sporogènes de Clostridium de type sauvage (WT) ou son mutant de phényllactate déshydratase (fldC) et le contenu caecal, les matières fécales, le sérum et l'urine ont été collectés pour le profilage métabolomique par chromatographie en phase gazeuse. spectrométrie (GC-TOF-MS) (Fig. 1b, Données supplémentaires 1, 2). Conformément au rôle du gène fldC dans le métabolisme réducteur des acides aminés aromatiques, dans les matières fécales et caecales de souris colonisées par fldC, nous avons détecté (i) une perte de produits finaux d'arylpropionate, (ii) une accumulation d'intermédiaires à proximité du bloc dans la voie (aryllactates et arylpyruvates), et (iii) une augmentation des produits de la voie oxydative (arylactates) (Fig. 1c, d). De même, dans le sérum et l'urine de souris colonisées par fldC, nous avons observé une diminution des taux d'arylpropionates, une augmentation des aryllactates et une augmentation du produit de la voie oxydative modifiée par l'hôte, la phénylacétylglycine (composé 4, un conjugué glycine hôte de phénylacétate) (Fig. 1e , F). Ces résultats confirment nos découvertes précédentes selon lesquelles un seul locus de gène microbien détermine l'abondance de plusieurs métabolites d'acides aminés aromatiques dans la lumière intestinale et la circulation de l'hôte17.

Curieusement, notre analyse métabolomique a identifié l'acide hippurique comme l'un des métabolites les plus enrichis dans le sérum et l'urine des souris colonisées par WT par rapport aux souris fldC (Fig. 1e, f, composé 11). L'identification de l'acide hippurique est remarquable pour les trois raisons suivantes : (1) l'acide hippurique est connu depuis longtemps pour être l'un des acides organiques les plus abondants dans l'urine des mammifères19, (2) il a été démontré que le microbiote intestinal contribue à l'acide hippurique dans l'hôte4, 20, 21, mais aucun microbe ou voie n'a été montré pour influencer ses niveaux, (3) tandis que le benzoate alimentaire22 et le toluène23 sont des précurseurs bien connus, et d'autres composés alimentaires, y compris la phénylalanine24 et les polyphénols19 ont été associés à des niveaux accrus d'acide hippurique , la contribution du métabolisme microbien des acides aminés dans l'intestin à l'acide hippurique hôte n'a pas été démontrée auparavant. De plus, l'abondance du produit final du métabolisme oxydatif de la phénylalanine, la molécule cardiotoxique phénylacétylglycine8, était plus élevée dans l'urine des souris colonisées par fldC, indiquant que le métabolisme microbien réducteur de la phénylalanine peut représenter une alternative saine. Étant donné que l'acide phénylpropionique était abondant dans les fèces et le contenu caecal des souris colonisées par WT (Fig. 1c, d; composé 3), mais indétectable dans le sérum et l'urine, nous avons estimé que l'acide phénylpropionique produit par des microbes pouvait être converti en acide hippurique par l'hôte (Fig. 1g).

Pour explorer davantage le rôle du groupe de gènes fldC dans la production d'acide hippurique, nous avons d'abord validé nos découvertes GC-TOF-MS en colonisant des souris avec WT C. sporogenes ou le mutant fldC et en analysant les niveaux d'acide hippurique par chromatographie liquide à dilution isotopique stable - masse spectrométrie (LC-MS). Ces expériences ont révélé que les niveaux d'acide hippurique dans l'urine chez les souris colonisées par fldC étaient faibles - similaires aux souris sans germes - alors que les souris colonisées par WT avaient des niveaux millimolaires d'acide hippurique dans l'urine (Fig. 2a). Nous avons ensuite demandé si l'acide phénylpropionique administré par voie orale pouvait servir de précurseur de l'acide hippurique urinaire. Nous avons gavé oralement des souris sans germes avec de l'acide phénylpropionique marqué par un isotope stable (acide d9-phénylpropionique) et surveillé l'incorporation de l'étiquette dans l'acide hippurique (acide d5-hippurique) (Fig. 2b). L'acide hippurique marqué était indétectable au moment du gavage à l'acide d9-phénylpropionique (t = 0); cependant, nous avons noté une augmentation de l'acide hippurique marqué aux points temporels de 3 et 6 h, suivie d'une baisse à 9 h, et les niveaux étaient indétectables 24 h après le gavage, ce qui suggère que l'acide phénylpropionique est converti en acide hippurique par l'hôte (Fig. 2c). Pour tester directement l'hypothèse selon laquelle l'acide hippurique provient du métabolisme de la phénylalanine impliquant le gène fldC, nous avons effectué une expérience similaire de traçage des isotopes stables chez des souris sans germes et colonisées, cette fois en utilisant de la phénylalanine marquée (d5-phénylalanine). Chez les souris sans germes, aucun acide hippurique marqué n'a été détecté (Fig. 2e), ce qui suggère qu'il n'existe aucune voie endogène pour la production d'acide hippurique à partir de la phénylalanine. Cependant, nous avons noté des niveaux élevés d'acide hippurique marqué dans l'urine de souris colonisées par WT, alors que les niveaux étaient indétectables chez les souris colonisées par fldC (Fig. 2e). Pris ensemble, ces résultats révèlent une nouvelle voie co-métabolique hôte-microbe pour la conversion de la phénylalanine alimentaire en acide hippurique nécessitant le locus fld.

a L'urine a été recueillie sur des souris sans germes (n = 10), des souris colonisées par fldC (n = 4) ou des souris colonisées par C. sporogenes de type sauvage (n = 5) et l'acide hippurique a été mesuré à l'aide d'une masse de dilution isotopique stable spectrométrie (ANOVA unidirectionnelle avec comparaisons multiples post-hoc de Tukey, F(2, 16) = 60,90). b Des souris sans germes ont été gavées avec de l'acide d9-phénylpropionique et l'incorporation d'un marqueur cyclique dans l'acide hippurique a été quantifiée pour déterminer si l'acide phénylpropionique est un précurseur de l'acide hippurique. c L'administration d'acide d9-phénylpropionique à des souris exemptes de germes entraîne une accumulation d'acide d5-hippurique dans l'urine (n = 12 souris). d Des souris sans germe (n = 10 souris), colonisées par fldC (n = 5) ou colonisées par WT (n = 5) ont reçu par voie orale de la phénylalanine isotopiquement marquée et de l'acide hippurique marqué a été surveillé dans l'urine au fil du temps. e Acide d5-hippurique urinaire mesuré 0, 3, 6, 9 ou 24 h après l'administration orale de d5-phénylalanine en utilisant la spectrométrie de masse à dilution isotopique stable. Pour a, c, e : les cases désignent la médiane avec la distance interquartile ; moustaches, maxima et minima. En (c), une valeur aberrante à t = 3 h (55,88 µM d5-acide hippurique) a été testée et supprimée avec la méthode Extreme Studentized Deviate mise en œuvre dans GraphPad Prism 8. Le schéma de souris en b, d a été adapté de la réf. 17.

Après avoir identifié une voie co-métabolique hôte-microbe pour la production d'hippurate chez les souris gnotobiotiques mono-colonisées, nous nous sommes ensuite demandé si ces composés étaient présents chez les souris colonisées par un microbiote conventionnel. Pour résoudre ce problème, nous avons obtenu des souris isogéniques Swiss Webster élevées de manière conventionnelle dans trois animaleries différentes (Jackson labs, Taconic, Charles River, Fig. 3a). Nous avons ensuite quantifié l'acide hippurique et l'acide phénylpropionique dans le plasma et l'urine de ces souris par LC-MS. Curieusement, nous avons constaté que les niveaux d'acide hippurique étaient présents dans le plasma à des niveaux micromolaires uniquement chez les souris élevées à Jackson Labs (Jackson) (Fig. 3b). Conformément au rôle de l'acide phénylpropionique en tant que précurseur de l'acide hippurique, ses niveaux étaient également significativement plus élevés dans le plasma de souris élevées de manière conventionnelle de Jackson Labs (Fig. 3c). L'acide hippurique était également élevé dans l'urine de souris élevées dans les laboratoires de Jackson (Fig. 3d). Pour confirmer que le microbiote intestinal était responsable des niveaux élevés de ces composés, nous avons obtenu le contenu caecal de souris des laboratoires Jackson et Charles Rivers et les avons transplantés sur des souris Swiss Webster exemptes de germes (Fig. 3e). Ces expériences ont révélé que seul le contenu caecal obtenu à partir de souris élevées dans les laboratoires de Jackson conférait le phénotype de niveaux élevés d'acide hippurique et d'acide phénylpropionique dans le plasma (Fig. 3f, g) et d'hippurate dans l'urine (Fig. 3h) d'ex sans germes. souris. Ces résultats mettent en évidence deux découvertes clés : premièrement, que l'acide hippurique et son précurseur, l'acide phénylpropionique, circulent dans le sang des souris conventionnelles à des niveaux micromolaires. Deuxièmement, il existe une variabilité substantielle des niveaux d'acide hippurique entre les souris élevées dans différentes installations, ce qui suggère que les variations du microbiote contribuent aux modifications du métabolome circulant.

a Des échantillons de plasma et d'urine ont été obtenus à partir de souris conventionnelles Swiss Webster de Charles River, Jackson ou Taconic Laboratories. Les niveaux d'acide hippurique (b) et d'acide phénylpropionique (c) étaient significativement plus élevés chez les souris des laboratoires Jackson que chez Charles River ou Taconic. d L'acide hippurique était élevé dans l'urine de souris conventionnelles de Jackson Laboratories (normalisé à la concentration de créatinine). Pour b–d : ANOVA à un facteur avec les comparaisons post-hoc de Tukey, n = 5 souris/groupe, moyenne ± sem indiquée Acide hippurique plasmatique F(2,12) = 31,48, PPA plasmatique F(2,12) = 60,09, acide hippurique urinaire F(2,12) = 20,30. e Le contenu caecal dérivé de souris Swiss Webster conventionnelles obtenues auprès des laboratoires Charles River ou Jackson a été transplanté sur des receveurs exempts de germes ; des échantillons de plasma et d'urine ont été prélevés. GF, exempt de germes ; CONV-D, conventionnalisé. Après la transplantation cæcale, l'acide hippurique plasmatique (f) et l'acide phénylpropionique (g) étaient significativement plus élevés chez les receveurs des laboratoires de Jackson par rapport à Charles River (tests t bilatéraux non appariés). h L'acide hippurique était significativement plus élevé dans l'urine des souris avec le contenu caecal des souris des laboratoires de Jackson (test de Mann-Whitney bilatéral). Pour f–h : n = 4 souris/groupe, moyenne ± sem indiquée. Le schéma de la souris dans a, e a été adapté de la réf. 17.

Après avoir déterminé la voie microbienne contribuant à la génération d'acide hippurique, nous avons cherché à comprendre comment l'hôte produit l'acide hippurique à partir de l'acide phénylpropionique. Le produit de la voie oxydative de la phénylalanine (phénylacétate) est conjugué à la glycine par l'hôte, produisant de la phénylacétylglycine, comme on le voit chez les souris colonisées par fldC (Fig. 1f). Cependant, nous n'avons pas réussi à détecter le conjugué glycine correspondant du produit de la voie réductrice de la phénylalanine, la phénylpropionylglycine. Nous avons émis l'hypothèse que l'acide phénylpropionique peut être raccourci par l'hôte via une β-oxydation produisant de l'acide benzoïque, puis conjugué avec de la glycine pour former de l'acide hippurique (également connu sous le nom de benzoylglycine). Pour tester cette hypothèse, nous avons redérivé des souris knock-out pour l'acyl-CoA déshydrogénase (MCAD) à chaîne moyenne (MCAD-/-) 25 comme exemptes de germes pour permettre des expériences de colonisation gnotobiotique. Conformément aux études précédentes sur des souris MCAD-/- élevées de manière conventionnelle, nous avons noté un défaut biochimique distinctif chez les souris GF MCAD-/- caractérisé par des niveaux plus élevés d'acylcarnitines sériques (C6, C8, C10: 1 et C10) (Fig. 2a) et d'acide subérique urinaire et d'hexanoylglycine (Fig. 2b supplémentaire) après une période de jeûne de 24 heures.

Pour tester si MCAD est impliqué dans la production d'acide hippurique, nous avons dosé les niveaux d'acide hippurique dans l'urine de souris MCAD−/− et MCAD+/+ colonisées par WT C. sporogenes. Ces expériences ont révélé que les souris MCAD−/− colonisées par C. sporogenes avaient des niveaux réduits d'acide hippurique dans l'urine par rapport aux souris MCAD+/+ (Fig. 4a). De plus, nous avons constaté que les souris MCAD−/− accumulent de la phénylpropionylglycine dans l'urine à des niveaux complémentaires du défaut de concentration d'acide hippurique (Fig. 4b). Ces résultats suggèrent que chez les souris MCAD−/−, la β-oxydation de l'acide phénylpropionique est partiellement bloquée, ce qui incite à une voie accessoire pour l'élimination de l'acide phénylpropionique microbien sous forme de phénylpropionylglycine (Fig. 4c). À l'appui de nos données, des études antérieures ont montré une accumulation de phénylpropionylglycine dans l'urine d'humains présentant un déficit en MCAD26. Bien que la nature de la production résiduelle d'acide hippurique chez les souris MCAD−/− ne soit pas claire, nous supposons qu'elle pourrait impliquer des acyl-CoA oxydases peroxysomales27.

a, b L'urine a été collectée à partir de souris MCAD+/+ ou MCAD−/− soit à l'état sans germe (GF) soit après colonisation par C. sporogenes de type sauvage (Cs). Les taux d'acide hippurique (a) et de phénylpropionylglycine (b) ont été déterminés dans l'urine par spectrométrie de masse à dilution isotopique stable et normalisés aux taux de créatinine urinaire (n = 4 souris/groupe GF, n = 7 MCAD+/+ Cs-colonisé, n = 9 MCAD−/− Cs-colonisé ; tests t de Student bilatéraux non appariés). c Modèle du métabolisme de l'hôte de l'acide phénylpropionique impliquant le MCAD et présence d'une voie accessoire convertissant l'acide phénylpropionique en phénylpropionylglycine. d Des souris sans germes ont reçu par voie orale de l'acide phénylpropionique marqué isotopiquement et de la phénylpropionylglycine marquée a été quantifiée dans l'urine au fil du temps. e Niveaux urinaires de d9-phénylpropionylglycine après gavage à l'acide d9-phénylpropionique chez des souris GF MCAD−/− ou MCAD+/+ (n = 12 souris/groupe) par spectrométrie de masse à dilution isotopique stable et normalisés aux taux de créatinine urinaire. Pour a, b, e : les cases indiquent la médiane avec la distance interquartile, les maxima et les minima des moustaches. Le schéma de la souris en d a été adapté de la réf. 17.

À partir des données présentées ici, nous proposons que la phénylalanine soit convertie en acide hippurique via une voie impliquant des transformations bactériennes dans l'intestin et le métabolisme de l'hôte (Fig. 3 supplémentaire). En l'absence d'un gène MCAD fonctionnel, l'acide phénylpropionique est dérivé par une voie accessoire avec la glycine N-acyltransférase (GLYAT), produisant de la phénylpropionylglycine (Fig. 4c). Conformément à cela, les souris GF MCAD−/− gavées avec de l'acide d9-phénylpropionique (Fig. 4d) accumulent de la phénylpropionylglycine marquée, alors que les souris GF avec MCAD fonctionnel ne le font pas (Fig. 4e), acheminant cette molécule à la place vers l'acide hippurique (Fig. 2c ).

Après avoir caractérisé le rôle du MCAD dans le métabolisme de l'acide phénylpropionique en acide hippurique, nous avons ensuite demandé si d'autres métabolites microbiens étaient métabolisés par le MCAD. Pour résoudre ce problème, nous avons effectué une métabolomique non ciblée sur l'urine de souris MCAD + / + et MCAD − / − colonisées par GF et C. sporogenes (données supplémentaires 3). Pour nous concentrer sur les métabolites microbiens, nous avons limité notre enquête aux composés qui dépendaient de la colonisation de C. sporogenes (post-colonisation élevée par rapport à sans germes). À partir de ces analyses, nous avons identifié 29 caractéristiques LC-MS qui différaient en fonction du génotype de l'hôte, les plus élevées dans l'urine des souris MCAD−/− (Fig. 5a, Fig. 4a supplémentaire). En recherchant dans notre base de données de métabolites interne et dans les bases de données MS/MS accessibles au public, nous avons pu dériver des identifications structurelles présumées de quatre composés que nous avons ensuite vérifiées par comparaison avec des normes authentiques (Fig. 5b, Données supplémentaires 4). Nous avons été rassurés de trouver de la phénylpropionylglycine élevée dans l'urine de souris MCAD−/−, ce qui correspond au rôle de la MCAD dans le métabolisme de l'acide phénylpropionique en acide hippurique illustré à la Fig. 4. La cinnamoylglycine, le conjugué glycine de l'acide cinnamique, a été diminuée dans l'urine. de souris MCAD−/− (Fig. 4a supplémentaire) et est probablement un intermédiaire dans le métabolisme de l'acide phénylpropionique dépendant de MCAD (Fig. 3 supplémentaire). L'identification de deux métabolites supplémentaires, l'acide 3-(4-hydroxyphényl)propionique (4-OH-PPA) et l'isocaproylglycine était inattendue. Le 4-OH-PPA est le produit réducteur du métabolisme de la tyrosine par C. sporogenes, généré par la même voie pour le métabolisme de l'acide phénylpropionique (Fig. 1 supplémentaire), tandis que l'isocaproylglycine ressemble au produit final de C. sporogenes du métabolisme de la leucine, l'acide isocaproïque5 .

a Métabolites urinaires dépendants de la colonisation par C. sporogenes qui sont significativement différents entre les souris MCAD−/− (changement de pli positif, rouge) et MCAD+/+ (négatif, gris). Les métabolites sont colorés s'ils sont significatifs (valeur q < 0,05) et présentent un changement supérieur à deux fois (tests t appariés avec procédure linéaire en deux étapes de Benjamini, Krieger et Yekutieli). Les métabolites nommés sont colorés en bleu. b Chromatogrammes d'ions totaux et spectres de fragmentation MS/MS pour la validation de quatre métabolites prédits dans a. Les normes sont indiquées ci-dessus ; échantillons biologiques, ci-dessous en bleu. c Conversion de la tyrosine en acide 3-(4-hydroxyphényl)propionique par C. sporogenes et conversion prévue en acide 4-hydroxyhippurique via l'hôte MCAD et la conjugaison de la glycine donnant la 3-(4-hydroxyphényl)propionylglycine dans MCAD-/-. d Le 4-OH-PPA et le 4-OH-PPG s'accumulent en l'absence de MCAD, alors que l'acide 4-OH-hippurique est plus élevé chez les souris MCAD+/+ (acide 4-OH-PPA et 4-OH-hippurique : deux- test t de Student à queue, 4-OH-PPG : Mann-Whitney bilatéral). le métabolisme de la leucine par C. sporogenes produit de l'acide isocaproïque ; produits prédits en fonction de l'activité MCAD dans l'hôte. f L'isocaproylglycine s'accumule chez les souris déficientes en MCAD, ce qui indique que l'acide isocaproïque subit une β-oxydation de l'hôte dans des conditions homéostatiques (tests t de Student à deux queues non appariés). Pour d et f : n = 14 souris/groupe GF, n = 11 MCAD+/+ Cs-colonisées, n = 12 MCAD-/- Cs-colonisées ; les données ont été combinées dans deux expériences indépendantes. Les cases indiquent la médiane avec la distance interquartile, les moustaches indiquent les maxima et les minima. g Quatre composés précédemment démontrés dans la circulation de l'hôte sont le produit du métabolisme canonique de la phase I (flavine monooxygénases) et de la phase II (sulfatation, glutamine ou conjugaison de la glycine) de l'hôte de métabolites produits par voie microbienne. La β-oxydation de l'hôte (rouge) par le MCAD génère de l'acide hippurique et de l'acide 4-hydroxyhippurique, deux composés très abondants chez l'hôte.

Dans notre métabolomique GC-TOF initiale, nous avons identifié l'acide 4-hydroxyhippurique (acide 4-OH-hippurique) dans l'urine comme dépendant de fldC (Fig. 4b supplémentaire) et, avec l'analyse métabolomique MCAD−/− non ciblée, nous avons émis l'hypothèse que 4 -OH-PPA subit une transformation dépendante du MCAD similaire à celle de l'acide phénylpropionique (Fig. 5c). Nous avons utilisé une dilution isotopique stable LC-MS pour quantifier le 4-OH-PPA, l'acide 4-OH-hippurique et la 3-(4-hydroxyphényl)propionylglycine (4-OH-PPG, synthétisée chimiquement pour cette étude) dans l'urine du germe -souris MCAD−/− et MCAD+/+ colonisées par C. sporogenes. Conformément au rôle du MCAD dans cette voie, l'acide 4-OH-hippurique urinaire est élevé chez les souris MCAD+/+ alors que le 4-OH-PPA est élevé chez les souris MCAD−/−, et le 4-OH-PPG tend vers une augmentation significative chez les souris MCAD−/− (Fig. 5d). Ces résultats soutiennent un modèle dans lequel le 4-OH-PPA est métabolisé via MCAD de la même manière que l'acide phénylpropionique. La voie MCAD ne se termine pas, car le 4-OH-PPA (le précurseur) et le 4-OH-PPG (le produit de la voie alternative) sont détectés dans l'urine de souris MCAD+/+ colonisées (Fig. 5d). Ces résultats identifient le 4-OH-PPA produit par voie microbienne comme substrat supplémentaire pour la β-oxydation de l'hôte via MCAD.

Nous avons prédit que l'acide isocaproïque microbien pourrait également être métabolisé par l'hôte MCAD (Fig. 5e). Étant donné que le produit MCAD à chaîne raccourcie et conjugué à la glycine de l'acide isocaproïque, l'isobutyrylglycine (Fig. 5e), co-élué avec la butyrylglycine, nous avons quantifié le produit qui, selon nous, s'accumulerait en l'absence de MCAD, l'isocaproylglycine. Conformément à nos attentes, les niveaux d'isocaproylglycine étaient élevés chez les souris MCAD - / - par rapport aux souris MCAD + / + par LC-MS (Fig. 5f). Contrairement à la phénylpropionylglyine (Fig. 4b) et au 4-OH-PPG (Fig. 5d), les souris MCAD−/− exemptes de germes ont des niveaux appréciables d'isocaproylglycine, ce qui suggère que les voies endogènes de l'hôte produisent ce métabolite. Cependant, les niveaux d'isocaproylglycine sont significativement plus élevés chez les souris MCAD-/- lors de la colonisation (P <0, 0001), ce qui indique que l'acide isocaproïque fourni par C. sporogenes dans l'intestin élève les niveaux d'isocaproylglycine chez les souris déficientes en MCAD (Fig. 5f). Ces données suggèrent que l'acide isocaproïque est un troisième produit du métabolisme bactérien métabolisé par l'hôte MCAD.

Le microbiome intestinal, grâce à son métabolisme de composés dérivés de l'alimentation et de l'hôte, élargit l'inventaire biochimique de l'hôte. Ici, nous nous sommes concentrés sur une voie microbienne spécifique, le métabolisme des acides aminés aromatiques codés par le locus fld, et avons identifié une voie co-métabolique hôte-microbe qui contribue à l'un des métabolites urinaires les plus abondants chez les mammifères, l'acide hippurique. Nos résultats indiquent que la phénylalanine est convertie en phénylpropionate dans l'intestin, qui est ensuite absorbé par l'hôte et soumis à une β-oxydation via MCAD avant d'être conjugué à la glycine et éliminé dans l'urine. Nous constatons également que l'hôte MCAD participe au métabolisme d'autres substrats d'origine microbienne tels que l'acide 3-(4-hydroxyphényl)propionique (également connu sous le nom de désaminotyrosine) et l'acide isocaproïque, un produit de la voie réductrice du métabolisme de la leucine. Ensemble, nos données révèlent que la β-oxydation de l'hôte par MCAD est un mécanisme non identifié auparavant pour le métabolisme de l'hôte des molécules dérivées du microbiote intestinal (Fig. 5g).

Plusieurs enzymes hôtes agissant sur les métabolites hôtes dépendants du microbiote ont été bien caractérisées. Ceux-ci comprennent le cytochrome P450, les flavine monooxygénases, les alcool déshydrogénases et les monoamine oxydases qui introduisent des groupes réactifs ou polaires dans les composés (métabolisme de phase I), après quoi les métabolites activés sont conjugués avec des espèces de glutathion, de glycine, de sulfate et d'acide glucuronique (phase II). Alors que la conjugaison de la glycine est généralement considérée comme un mécanisme de détoxification en augmentant la solubilité dans l'eau pour faciliter l'excrétion urinaire, plus récemment, il a été suggéré que la conjugaison de la glycine pourrait réguler les niveaux systémiques d'acides aminés aromatiques, tels que ceux utilisés comme neurotransmetteurs28. Cependant, à part le métabolisme du butyrate, la β-oxydation de l'hôte n'a pas été considérée comme un mécanisme important pour le métabolisme des métabolites microbiens. Notre identification de l'acide phénylpropionique, de l'acide 3-(4-hydroxyphényl)propionique et de l'acide isocaproïque comme substrats probables pour l'hôte MCAD est en accord avec sa préférence connue pour les acides gras dont la longueur varie de C6 à C1229. La démonstration de l'activité de la MCAD purifiée avec du phénylpropionyl-CoA comme substrat26 et des études chez des patients déficients en MCAD, qui ont identifié une augmentation des taux urinaires de phénylpropionylglycine, une diminution de l'acide hippurique26, 30 et une augmentation de l'isocaproylglycine31, corroborent davantage nos découvertes. Bien qu'il ait été suggéré que l'activité métabolique dans l'intestin soit responsable de la production de ces métabolites32, 33, nos résultats avec des souris gnotobiotiques et la génétique bactérienne fournissent maintenant des preuves définitives. Nos résultats impliquent également la MCAD dans la liste croissante des enzymes hôtes qui génèrent des métabolites circulants en grande abondance via le co-métabolisme avec les bactéries intestinales.

Un thème intéressant qui émerge de notre analyse du co-métabolisme hôte-microbe est que plusieurs métabolites microbiens sont excrétés sous forme de conjugués de glycine. Cela est probablement dû à l'activité de la glycine N-acyltransférase de l'hôte (GLYAT), une enzyme mitochondriale qui utilise l'acyl-CoA et la glycine comme co-substrats, formant des acylglycines et du CoASH. La justification métabolique de la conjugaison de la glycine chez les mammifères n'est pas entièrement claire, mais plusieurs hypothèses ont été suggérées (résumées dans la réf. 28): (1) La conjugaison de la glycine modifie la lipophilie des métabolites aromatiques tels que l'acide benzoïque, limitant leur toxicité. (2) La conjugaison de la glycine via GLYAT recycle le CoASH qui est nécessaire pour un certain nombre d'activités biochimiques d'importance critique. (3) Les niveaux réduits de glycine de l'hôte résultant de la conjugaison avec un excès de métabolites aromatiques pourraient représenter un circuit moléculaire influençant les préférences alimentaires.

L'acide hippurique dans l'urine humaine a été postulé comme étant d'origine microbienne4, 16, 20, 34,35,36, mais ni un microbe ni un gène microbien responsable de sa production n'ont été définis. Nos résultats chez des souris gnotobiotiques colonisées par C. sporogenes de type sauvage ou mutant fldC suggèrent que le métabolisme réducteur de la phénylalanine est une source majeure d'acide hippurique chez l'hôte. Cependant, des études antérieures ont suggéré que l'acide hippurique provient de mécanismes indépendants du microbiote (par exemple, l'ingestion d'acide benzoïque ou l'exposition au toluène) ou par la dégradation microbienne des polyphénols et des flavonoïdes alimentaires tels que ceux présents dans le café et le thé19. En effet, une littérature abondante a établi un lien entre l'excrétion d'acide hippurique chez l'homme et la consommation de thés, de jus et de fruits connus pour être riches en polyphénols (examiné dans la réf. 19). Ainsi, il semble probable que l'étendue de l'excrétion d'acide hippurique chez les individus soit multifactorielle, représentant les apports alimentaires non microbiens et ceux du métabolisme microbien de la phénylalanine (comme nous l'avons montré) et des polyphénols alimentaires. Le traçage des isotopes stables avec des composants alimentaires étiquetés sera probablement nécessaire pour distinguer les contributions relatives de ces sources alimentaires et microbiennes à la production d'acide hippurique. Dans cette optique, une étude récente sur l'alimentation de souris avec des composants alimentaires marqués aux isotopes a démontré que les protéines alimentaires sont un précurseur important de l'acide hippurique systémique avec une contribution estimée à 33 %37.

Au-delà de l'identification de la MCAD en tant qu'enzyme hôte responsable de la métabolisation des métabolites microbiens, notre travail a plusieurs autres implications importantes : premièrement, alors que l'acide hippurique est omniprésent et n'a pas été lié à des effets néfastes sur la santé chez l'homme, la phénylacétylglycine (phénylacétylglutamine chez l'homme), la glycine- produit conjugué du métabolisme oxydatif de la phénylalanine, est associé à un risque accru de maladie cardiaque8. Par conséquent, la conversion réductrice de la phénylalanine via l'acide phénylpropionique en acide hippurique, qui est largement considérée comme non toxique chez l'homme, représente une alternative relativement saine à la voie oxydative pour la production de phénylacétate. Deuxièmement, une voie microbienne qui fonctionne à haut flux, convertissant la phénylalanine en un produit final non toxique pourrait être d'un intérêt considérable en ce qui concerne les patients atteints de phénylcétonurie où leurs taux sanguins de phénylalanine sont élevés. Dans ce sens, des groupes précédents ont montré qu'Escherichia coli conçu pour dégrader la phénylalanine dans l'intestin peut réduire les niveaux dans le sang. L'identification de bactéries intestinales naturelles capables de dégrader la phénylalanine dans l'intestin représente une alternative aux souches modifiées.

Ce travail présente une voie métabolique omniprésente chez les mammifères comme une nouvelle voie par laquelle l'hôte métabolise plusieurs composés générés par le microbiote intestinal. En plus de l'acide phénylpropionique, de l'acide 3-(4-hydroxyphényl)propionique et de l'acide isocaproïque, plusieurs produits conjugués à la glycine non identifiés du métabolisme bactérien s'accumulent en l'absence de MCAD fonctionnel, indiquant que dans des conditions homéostatiques, ces molécules subissent une β-oxydation avant à la conjugaison de la glycine. L'hôte MCAD représente donc un mécanisme large et jusqu'alors insoupçonné pour le métabolisme des métabolites microbiens.

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées selon un protocole approuvé par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Stanford. Toutes les expériences sur les souris ont été menées dans une installation gnotobiotique dédiée à l'aide d'isolateurs d'éleveurs aseptiques à film flexible ou d'isolateurs expérimentaux, tous deux de Class Biologically Clean (Madison, WI). Dans certaines expériences plus courtes (<1 semaine), un système de rack IsoCage P avec filtration HEPA au niveau de la cage (Tecniplast, Buguggiate, Italie) a été utilisé. Les animaux ont été maintenus sur un cycle lumière/obscurité de 12 h et nourris avec de la nourriture standard (LabDiet 5K67) et de l'eau à volonté. La stérilité des animaux a été vérifiée par culture cellulaire anaérobie et aérobie bihebdomadaire des matières fécales pour les animaux représentatifs de chaque isolateur et PCR du locus ARNr 16S. Des expériences initiales de métabolomique non ciblées sur des souris ont été réalisées sur des souris sans germe gnotobiotiques Swiss Webster (mâles, âgés de 8 à 12 semaines, n = 5 par groupe) obtenues à l'origine auprès de Taconic Biosciences. Des expériences supplémentaires ont été réalisées sur des souris MCAD−/− (B6;129P2-Acadmtm1Uab/Mmmh)25 qui ont été initialement obtenues sous forme d'embryons du Mutant Mouse Resource & Research Center (MMRRC, Cat. # 011588-MU) et transférées au National Gnotobiotic Centre de ressources sur les rongeurs (NGRRC) où ils ont été redérivés par transfert d'embryons dans des souris C57/BL6 exemptes de germes. Des souris MCAD+/− hétérozygotes exemptes de germes ont été transférées dans notre installation de souris gnotobiotiques à Stanford où la colonie a été agrandie et la reproduction a été maintenue en tant que paires homozygotes MCAD−/− ou MCAD+/+ isogéniques, ces dernières servant de témoins. Des souris Swiss Webster conventionnelles ont été obtenues auprès de Taconic, Jackson Laboratories et Charles River Laboratories. Les souris ont été maintenues sur de la nourriture standard et logées dans des isolateurs à film flexible. Chaque expérience comparant l'état de colonisation et/ou le génotype de l'hôte a été réalisée avec des animaux de même sexe. Des souris mâles et femelles ont été utilisées; le sexe des animaux utilisés dans une expérience donnée a été déterminé par la disponibilité des animaux au sein de notre installation gnotobiotique.

Clostridium sporogenes ATCC 15579 a été cultivé en routine dans des milieux clostridiens renforcés (RCM, 10 g/L de peptone, 10 g/L d'extrait de bœuf, 3 g/L d'extrait de levure, 5 g/L de dextrose, 5 g/L de chlorure de sodium, 1 g/L L amidon soluble, 0,5 g/L de chlorhydrate de cystéine, 3 g/L d'acétate de sodium, 0,5 g/L d'agar) à 37 °C dans une chambre anaérobie de Coy Laboratories sous une atmosphère de 5 % d'hydrogène, 10 % de CO2 et 85 % de N2 . Le mutant fldC de C. sporogenes, qui porte une mutation d'insertion ClosTron, a été généré précédemment17 et a été cultivé dans des conditions identiques à la souche de type sauvage. Les cellules bactériennes ont été stockées à -80 ° C sous forme de stocks de glycérol à 25% v / v préparés de manière anaérobie scellés dans des flacons en verre à sertir de 12 × 32 mm. Les cultures liquides ont été transférées dans des cryotubes stériles de 2 ml avec filetage intérieur avant le gavage. Toutes les manipulations avec C. sporogenes ont été effectuées dans la chambre anaérobie et avec des réactifs et des milieux pré-réduits pendant au moins 48 h.

Le génotype de la souris MCAD a été confirmé par PCR ADN ciblant l'insert de néomycine, qui fait la distinction entre MCAD+/+ et MCAD+/− ou MCAD−/− ainsi que RT-PCR pour détecter le transcrit MCAD. Le kit Qiagen DNeasy Blood and Tissue (cat # 69506) a été utilisé pour extraire l'ADN du poinçon d'oreille. Les amorces utilisées étaient : NeoF 5′-CATTCGACCAAGCGAAACATC-3′, NeoR 5′-ATATCACGGGTAGCCAACGCTATG-3′25. Le produit a été analysé sur un gel d'agarose à 3 % avec une taille de bande attendue de 289 pb pour le génotype hétérozygote et knock-out, et aucun produit pour le génotype de type sauvage. L'ARN a été extrait du clip de queue avec le kit Qiagen RNeasy Mini (cat # 74104) et la RT-PCR a été réalisée avec le kit Qiagen One Step RT-PCR (cat # 210212). Les amorces utilisées étaient : M11588F 5′- ATGTGGCGGCCATTAAGACCAAAG-3′, M11588R 5′- GCTGATTGGCAATGTCTCCAGCAA-3′. Les produits ont été imagés sur un gel d'agarose à 3 % ; les animaux MCAD+/+ et MCAD+/− ont un seul produit de 550 pb, tandis que les animaux MCAD−/− ont un effet d'échelle, avec des tailles de produit approximatives de 700, 800, 1000 pb et plus.

Des souris Swiss Webster exemptes de germes (mâles, âgés de 8 à 12 semaines, n = 5 par groupe) ont été colonisées soit par des sporogènes de Clostridium de type sauvage ATCC 15579, soit par sa souche mutante fldC17 (1 × 107 UFC par souris, 200 µL). Quatre semaines après la colonisation, l'urine et les matières fécales ont été recueillies, puis les souris ont été euthanasiées et le sang a été prélevé par ponction cardiaque et le contenu caecal a été récolté. Le sérum a été obtenu à partir de sang total à l'aide de microtainers BD (cat # 365967) conformément aux directives du fabricant, puis congelé dans de l'azote liquide et stocké à -80 ° C. L'urine, les matières fécales et le contenu caecal ont été transférés dans des tubes à bouchon à vis de 2 ml et congelés instantanément dans de l'azote liquide immédiatement après la collecte, puis stockés à -80 ° C. Les échantillons ont été expédiés sur de la neige carbonique au West Coast Metabolomics Center de l'Université de Californie à Davis, où les métabolites ont été extraits, dérivés et analysés par chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse à temps de vol (GC-TOF-MS).

Les échantillons (sérum 30 µL, matières fécales et caecales ~ 20 mg et urine 20 µL) ont été décongelés à 4 °C, puis les métabolites ont été extraits, dérivés et analysés par GC-MS en utilisant des protocoles standard, comme décrit précédemment38. Les données rapportées (données supplémentaires 1) représentent les hauteurs de pic pour chaque ion de quantification correspondant normalisées à la somme des hauteurs de pic pour tous les métabolites nommés au sein d'un groupe de traitement.

Les métabolites qui ont été identifiés dans la plateforme de métabolomique shotgun ont été inclus dans l'analyse en aval. Pour la détermination de la signification statistique, la découverte a été déterminée à l'aide de la procédure linéaire en deux étapes de Benjamini, Krieger et Yekutieli, avec Q = 5 %, mise en œuvre dans GraphPad Prism v.8.4.1. Les zones de pic ont été normalisées en log10 et chaque métabolite a été analysé individuellement sans supposer un écart-type cohérent avec un total de 225 tests t pour chaque compartiment hôte.

Pour les expériences de traçage des isotopes stables de l'acide phénylpropionique, des souris exemptes de germes ont reçu 200 µL d'une solution filtrée stérile de 50 mM d'acide d9-phénylpropionique (isotopes C/D/N Cat. # D-5666) dissous dans l'eau par gavage oral en utilisant une seringue à tuberculine de 1 ml équipée d'une aiguille de gavage de calibre 18–19 (Popper 7900). L'urine a été recueillie à t = 0, 3, 6, 9, 24 h après le gavage et l'acide d5-hippurique a été quantifié dans l'urine par LC-MS (voir la section méthode LC-MS pour plus de détails).

Pour les expériences de traçage des isotopes stables de la phénylalanine, les souris ont reçu 200 µL d'une solution stérile filtrée de 50 mM de d5-phénylalanine (Sigma Cat. # 615870) dissoute dans l'eau par gavage oral à l'aide d'une seringue à tuberculine de 1 mL équipée d'un calibre 18–19. aiguille de gavage (Popper 7900). L'urine a été recueillie à t = 0, 3, 6, 9, 24 h après le gavage et l'acide d5-hippurique a été quantifié dans l'urine par LC-MS (voir la section méthode LC-MS pour plus de détails). Le traçage des isotopes stables a d'abord été effectué sur des souris sans germe pour tester la conversion endogène de la phénylalanine marquée. Par la suite, les mêmes souris ont été colonisées avec des sporogènes de Clostridium de type sauvage ou mutant fldC par gavage oral (200 µL, ~ 1 × 107 UFC) et un traçage des isotopes stables a été effectué une semaine après la colonisation.

Les souris MCAD−/− ont été redérivées comme exemptes de germes aux fins de cette étude. Des souris MCAD−/− ou des témoins MCAD+/+ ont été maintenus dans des isolateurs ou des cages gnotobiotiques stériles avec alimentation en air filtré HEPA. Le traçage des isotopes stables a été effectué comme décrit ci-dessus : l'urine de souris GF MCAD-/- et MCAD+/+ a été recueillie dans des conditions stériles immédiatement avant le gavage avec de l'acide d9-phénylpropionique 50 mM et 3, 6, 9 et 24 h après. Sept jours plus tard, les souris ont été mono-colonisées avec C. sporogenes de type sauvage par gavage de 200 µL de culture saturée pendant la nuit. Une semaine après la colonisation, le gavage à l'acide d9-phénylpropionique et la collecte d'urine à 0, 3, 6, 9 et 24 h ont été répétés. La colonisation de C. sporogenes a été vérifiée avec un étalement de dilution en série. La créatinine urinaire, l'acide hippurique, la phénylpropionylglycine marquée et non marquée ont été quantifiés par LC-MS (voir la section méthode LC-MS pour plus de détails).

Au cours de cette étude, nos laboratoires sont passés de l'utilisation principale d'un spectromètre de masse triple quadripôle (Agilent 6470) à un spectromètre de masse quadripolaire à temps de vol (Q-TOF) (Agilent 6545XT), donc des méthodes de quantification LC-MS de les métabolites différaient légèrement, comme décrit ci-dessous. Les solvants de qualité LC-MS ont été achetés auprès de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA); d3-créatinine, de Cambridge Isotope Laboratories (Tewksbury, MA). Aucune tentative n'a été faite pour corriger l'abondance naturelle des isotopes lourds, car les composés deutérés que nous avons choisis pour l'administration aux souris et les étalons internes étaient suffisamment distincts pour que les analytes d'intérêt soient affectés de manière négligeable (par exemple, la pureté isotopique de l'acide d2-hippurique contient < 0,1 % d'acide hippurique et d'acide d5- hippurique).

Pour la confirmation des niveaux d'acide hippurique dans l'urine de souris colonisées sans germes, WT et fldC (Fig. 2a), et pour le traçage des isotopes stables de l'acide d9-phénylpropionique et de la d5-phénylalanine chez les souris Swiss Webster (Fig. 2c, e), nous avons utilisé la spectrométrie de masse à dilution isotopique stable avec un spectromètre de masse triple quadripôle Agilent 6470. L'acide hippurique non marqué a été acheté chez Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Pour la préparation de l'échantillon, 5 µL d'urine ont été dilués avec 45 µL d'eau de qualité LC-MS, puis 50 µL d'acide sulfosalicylique à 6 % v/v dans de l'eau ont été ajoutés pour précipiter les protéines. Après centrifugation à 12 000 × g pendant 5 min, 50 µL de surnageant ont été transférés dans un nouveau tube et 75 µL d'acétonitrile à 50 % contenant 2,5 µM d'acide d5-hippurique (Cambridge Isotope Laboratories, Tewksbury, MA) comme étalon interne a été ajouté. Pour les expériences où l'acide d5-hippurique devait être détecté dans l'urine de souris (par exemple, pour le traçage des isotopes stables), l'acide 2,2-d2-hippurique (isotopes C/D/N, Pointe-Claire, Québec, Canada) a été utilisé comme un étalon interne, suivant sa transition SRM correspondante (180.1→136.1). Les tubes ont été brièvement mélangés au vortex, puis centrifugés et transférés dans une plaque d'échantillonneur automatique à 96 puits équipée d'un bouchon en silicone et conservés à 4 ° C avant l'analyse. Les composés ont été séparés à l'aide d'un UPLC Agilent 1290 Infinity II équipé d'une colonne C18 Agilent RRHD de 1,8 µm de taille de particules (2,1 × 50 mm) et détectés avec un spectromètre de masse Agilent 6470 Triple Quad équipé d'une source d'ionisation par électronébulisation à jet. L'éluant A consistait en 0,1 % d'acide formique (v/v) dans l'eau et l'éluant B consistait en 0,1 % d'acide formique (v/v) dans l'acétonitrile. Des échantillons (5 μL) ont été injectés via un échantillonneur automatique réfrigéré dans une phase mobile et une séparation chromatographique à 40 °C a été réalisée à un débit de 0,5 mL min-1 en utilisant le gradient suivant : 0–1,5 min, 10–12 % B ; 1,5–1,75 min, 12–90 % B ; 1,75–2,75 min, 90 % B ; 2,75–3 min, 90–10 % B ; 3–4,75 min, 10% B. La première 0,5 min a été détournée vers les déchets, puis les isotopes de l'acide hippurique ont été détectés en mode d'ionisation négative en utilisant les transitions SRM spécifiques pour l'acide hippurique (178,1 → 134,0) et l'étalon interne, l'acide d5-hippurique ( 183.1 → 139.1) avec un temps de séjour de 200 ms, une tension fragmentaire de 100 V et une énergie de collision de 9 V. Les zones de pic ont été normalisées à l'aide de l'étalon interne et les concentrations ont été déterminées par comparaison avec des courbes d'étalonnage préparées à partir de séries de dilution de l'étalon authentique. (acide hippurique, Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Les paramètres d'ionisation par électrospray comprenaient une température de gaz de 300 °C, un débit de gaz de 6 L/min, une température de gaz de gaine de 350 °C, un débit de gaz de gaine de 12 L/min et une tension capillaire de 2 500 V.

Pour la quantification de l'acide hippurique et de la N-(3-phénylpropionyl)glycine (PPG) dans l'urine de souris gnotobiotique MCAD+/+ et MCAD−/− (Fig. 3), nous avons utilisé une dilution isotopique stable avec un Agilent 6545XT Q-TOF. Nous avons également quantifié la créatinine urinaire de manière à pouvoir normaliser les solutés urinaires chez les animaux. Des échantillons d'urine de souris (5 μL) ont été mélangés avec des étalons internes (10 μL, d3-créatinine et acide 2,2-d2-hippurique, 0,5 mM chacun) et dilués avec de l'eau de qualité LC-MS (15 μL) dans 96 puits V -plaques inférieures des États-Unis scientifiques. 90 μL de mélange acétonitrile/méthanol 3:1 ont été ajoutés pour précipiter les protéines. La solution a été mélangée cinq fois par pipetage, puis la plaque a été centrifugée à 5000 × g pendant 10 min à 4 °C. Le surnageant (40 μL) a été transféré dans des plaques d'échantillonneur automatique à 96 puits contenant 160 μL d'eau, bien mélangé et un tapis de protection a été placé sur les plaques. Les échantillons ont été analysés par LC-MS à l'aide d'un UPLC Agilent 1290 Infinity II équipé d'une colonne BEH C18 Waters de 1,7 μm de granulométrie (2,1 × 100 mm) et détectés à l'aide d'un Agilent 6545XT Q-TOF équipé d'une source d'ionisation par électronébulisation à double jet. fonctionnant sous plage dynamique étendue (EDR 1700 m/z). L'éluant A consistait en 0,1 % d'acide acétique (v/v) dans l'eau et l'éluant B consistait en 0,1 % d'acide acétique (v/v) dans l'acétonitrile. Des échantillons (0,5 μL) ont été injectés via un échantillonneur automatique réfrigéré dans une phase mobile et une séparation chromatographique à 40 °C a été réalisée à un débit de 0,4 mL min-1 en utilisant le gradient suivant : 0-2 min, 1 % B ; 2 à 6 min, 1 à 98 % B ; 6-7 min, 98 % B ; 7−7,5 min, 98–1 % B ; 7,5 à 11 min, 1 % B. La quantification de la créatinine a été effectuée en mode ESI positif en utilisant la d3-créatinine comme étalon interne. La quantification de l'acide d5-hippurique et de la d5-N-(3-phénylpropionyl)glycine a été effectuée en mode ESI négatif en utilisant l'acide 2,2-d2-hippurique comme étalon interne. Les paramètres d'ionisation par électrospray comprenaient une tension fragmentaire de 140 V, une température de gaz de 300 ° C, une température de gaz gaine de 275 ° C et une tension capillaire de 4000 V. Les zones de pic ont été normalisées à l'aide de l'étalon interne (acide d2-hippurique pour l'acide hippurique et la phénylpropionylglycine , d3-créatinine pour la créatinine), et les concentrations ont été déterminées par comparaison avec des courbes d'étalonnage préparées à partir de séries de dilution d'étalons authentiques (créatinine, acide hippurique et phénylpropionylglycine, Toronto Research Chemicals, North York, Ontario, Canada) dopés dans une solution de PBS 1 × comme matrice de substitution. La plage d'étalonnage pour la créatinine était de 0,029 à 30 mM et de 0,020 à 20 mM pour l'acide hippurique et la phénylpropionylglycine. Un modèle de régression d'étalonnage linéaire a été appliqué à la créatinine et à l'acide hippurique ; un modèle de régression quadratique a été appliqué à la phénylpropionylglycine, en utilisant un algorithme de régression des moindres carrés pondérés 1/x. R2 = 0,996 pour la créatinine et 1,000 pour l'acide hippurique et la phénylpropionylglycine.

Pour les expériences de traçage des isotopes stables de l'acide d9-phénylpropionique, la d9-N-(3-phénylpropionyl)glycine a été quantifiée. Des échantillons d'urine ont été préparés et analysés selon le protocole ci-dessus, sauf que le surnageant (20 μL) a été dilué dans des plaques d'échantillonneur automatique à 96 puits avec 180 μL d'eau. Quantification des acides organiques urinaires et des métabolites apparentés. Pour la quantification de l'acide adipique, de l'acide subérique et de l'hexanoylglycine, des échantillons d'urine de souris (2,5 μL) ont été mélangés avec des étalons internes (15 μL, d3-créatinine et d2-acide isovalérique, 0,2 mM chacun) et dilués avec de l'eau de qualité LC-MS ( 7,5 μL) dans des plaques à fond en V à 96 puits de USA Scientific. Un mélange acétonitrile/méthanol 3:1 (75 μL) a été ajouté pour précipiter les protéines. La solution a été mélangée cinq fois par pipetage, puis la plaque a été centrifugée à 15 000 × g pendant 5 min à température ambiante. Le surnageant (10 μL) a été transféré dans des plaques d'échantillonneur automatique à 96 puits contenant 90 μL d'eau, bien mélangé et un tapis de protection a été placé sur les plaques. Les échantillons ont été analysés par LC-MS à l'aide d'un UPLC Agilent 1290 Infinity II équipé d'une colonne BEH C18 Waters de 1,7 μm de granulométrie (2,1 × 100 mm) et détectés à l'aide d'un Agilent 6545XT Q-TOF équipé d'une source d'ionisation par électronébulisation à double jet. fonctionnant sous plage dynamique étendue (EDR 1700 m/z). L'éluant A consistait en 0,1 % d'acide acétique (v/v) dans de l'eau et l'éluant B consistait en 0,1 % d'acide acétique (v/v) dans du méthanol. Des échantillons (2 μL) ont été injectés via un échantillonneur automatique réfrigéré dans une phase mobile et une séparation chromatographique à 60 °C a été réalisée à un débit de 0,4 mL min-1 en utilisant le gradient suivant : 0-1 min, 1 % B ; 1-15,5 min, 1-45 % B ; 15,5 à 15,6 min, 45 à 99 % B ; 15,6 à 16,9 min, 99 % B, 16,9 à 17 min, 99 à 1 % B ; 17 à 19 min, 1 % B. La quantification de la créatinine a été effectuée en mode ESI positif en utilisant la d3-créatinine comme étalon interne. La quantification de l'acide adipique, de l'acide subérique et de l'hexanoylglycine a été effectuée en mode ESI négatif en utilisant l'acide d2-isovalérique comme étalon interne. Les paramètres d'ionisation par électrospray comprenaient une tension de fragmentation de 70 V, une température de gaz de 250 °C, une température de gaz de gaine de 250 °C et une tension capillaire de 4 000 V. Les zones de pic ont été normalisées à l'aide de l'étalon interne et les concentrations ont été déterminées par comparaison avec les courbes d'étalonnage préparées à partir de séries de dilution d'étalons authentiques. La plage d'étalonnage est de 0,005 à 40 mM pour la créatinine, de 0,010 à 10 mM pour l'acide adipique, de 0,020 à 10 mM pour l'acide subérique et de 0,005 à 20 mM pour l'hexanoylglycine. Le modèle de régression d'étalonnage linéaire a été appliqué à l'acide adipique et à l'acide subérique, et le modèle de régression quadratique a été appliqué à la créatinine et à l'hexanoylglycine, en utilisant l'algorithme de régression des moindres carrés pondérés 1/x. R2 = 0,996, 0,998, 0,999 et 1,000 pour l'acide adipique, l'acide subérique, l'hexanoylglycine et la créatinine.

Le contenu caecal a été récolté sur des souris Swiss Webster de différents fournisseurs (Taconic, Jackson Laboratories, Charles River Laboratories), congelé instantanément dans de l'azote liquide et stocké à -80 ° C. Le contenu cæcal de n = 5 souris a été décongelé sur de la glace, regroupé et gavé par voie orale chez des souris Swiss Webster sans germes receveuses. Les souris ont ensuite été maintenues sous alimentation standard dans un système de rack de cage Isocage P pendant 2 semaines jusqu'à ce que des échantillons d'urine et de plasma soient collectés pour une analyse LC-MS.

Les métabolites ont été extraits d'échantillons de plasma et d'urine, dérivés avec de la 3-nitrophénylhydrazine et analysés par LC-MS comme décrit précédemment39.

Une métabolomique non ciblée a été réalisée sur des échantillons d'urine de souris prélevés avant l'administration de d5-phénylalanine ou d'acide d9-phénylpropionique (t = 0 h). Des échantillons d'urine de souris (2,5 μL) ont été dilués avec de l'eau de qualité LC-MS (5 μL) et mélangés avec un standard interne (7,5 μL, d3-créatinine, 1 mM ; acide d9-phénylpropionique, 0,2 mM ; 2,2-d2-hippurique acide, 0,2 mM), puis 60 μL de solvant d'extraction contenant des étalons de référence (d7-glucose, d3-méthionine, L-4-hydroxyphényl-d4-alanine, acide d5-hippurique, d5-tryptophane, d3-leucine, di-n -phtalate d'octyle-3,4,5,6-d4, acide d19-décanoïque, acide d15-octanoïque, acide d27-tétradécanoïque, 2-fluorophénylglycine, d9-carnitine dans du méthanol) a été ajouté pour précipiter les protéines. La solution a été vortexée, puis la plaque a été centrifugée à 15 000 × g pendant 5 min à 4 °C. Le surnageant (60 μL) a été transféré dans une nouvelle plaque et 20 μL de chacun ont été dilués avec 60 μL d'eau de qualité LC-MS. Le reste du surnageant a été stocké à -80 ° C en tant que sauvegarde. Trois blancs de procédure ont été inclus en utilisant la même méthode de préparation avec de l'eau LC-MS (2,5 μL) au lieu de l'échantillon d'urine. Les contrôles de qualité (CQ) ont été regroupés à partir de chaque échantillon prêt pour la LC-MS.

Les échantillons (0,5 μL) ont été soumis à une analyse LC-MS/MS en mode positif ESI et en mode négatif. La méthode du mode négatif était la même que celle décrite dans le paragraphe ci-dessus. La méthode en mode positif a appliqué les mêmes paramètres de gradient et d'ionisation par électrospray avec l'éluant A constitué de 0,1 % d'acide formique (v/v) dans l'eau et l'éluant B constitué de 0,1 % d'acide formique (v/v) dans le méthanol. L'acquisition a été effectuée en mode de fragmentation All-Ions en utilisant des énergies de collision de 0, 20 et 40 eV. L'identification des caractéristiques a été effectuée avec MS-DIAL (version 4.24) en recherchant soit (a) notre propre bibliothèque standard authentique interne40 ou (b) par comparaison avec les spectres MSMS disponibles sur la Mass Databank of North America (MoNA). Paramètres de recherche inclus : précision de la masse : tolérance MS1 : 0,005 Da, tolérance MS2 : 0,025 Da. Hauteur de pic minimale de détection de pic : amplitude de 2000, largeur de tranche de masse : 0,05 Da. Paramètres de déconvolution : valeur de la fenêtre sigma : 0,5, seuil d'abondance MS/MS : 5 amplitude. Fichier MSP d'identification : Spectres LC-MS/MS téléchargés à partir de la base de données MoNA, tolérance de masse précise (MS1) : 0,01 Da, tolérance de masse précise (MS2) : 0,05 Da. Temps de rétention et bibliothèque basée sur la masse précise : bibliothèque de composés de Stanford, tolérance de temps de rétention : 0,1 min, tolérance de masse précise : 0,01 Da. Paramètres d'alignement : fichier de référence : QC01, tolérance temps de rétention : 0,1 min, tolérance MS1 : 0,015 Da. Les pics des modes positif et négatif ont été normalisés avec la hauteur de l'acide 2,2-d2-hippurique et exportés vers MS-CleanR41 pour l'élimination des caractéristiques dégénérées. Un rapport de blanc minimum de 0,8, une masse incorrecte et un défaut de masse relative de 50 à 3 000 ont été appliqués comme filtres. Une corrélation de Pearson ≥ 0,8 a été utilisée pour calculer les clusters et les pics les plus intenses ont été conservés dans chaque cluster. Les composés annotés par temps de rétention/bibliothèque de masse précise ont été sélectionnés pour la collecte ciblée de spectres MS/MS et comparés aux normes de référence pour la confirmation de l'identité (toutes les données fournies dans les données supplémentaires 3).

Les mêmes échantillons sur lesquels la métabolomique non ciblée a été effectuée ont été analysés plus en détail pour les métabolites d'intérêt identifiés lors des analyses non ciblées (Données supplémentaires 4). La quantification de l'acide phénylpropionique, de la N-cinnamoylglycine, de la phénylpropionylglycine, de l'acide 4-hydroxyhippurique, de l'acide 3-(4-hydroxyphényl)propionique, de la N-(3-(4-hydroxyphényl)propionyl)glycine et de l'isocaproylglycine a été effectuée à l'aide du même instrument et de la même colonne en mode négatif ESI. L'éluant A consistait en 0,1 % d'acide acétique (v/v) dans de l'eau et l'éluant B consistait en 0,1 % d'acide acétique (v/v) dans du méthanol. Des échantillons (0,5 μL) ont été injectés via un échantillonneur automatique réfrigéré dans une phase mobile et une séparation chromatographique à 50 °C a été réalisée à un débit de 0,3 mL min-1 en utilisant le gradient suivant : 0-1 min, 1 % B, 1-9 min , 1−99 % B, 9−11 min, 99 % B, 11−11,5 min, 99–1 % B, 11,5−16 min, 1 % B. Les paramètres d'ionisation par électrospray comprenaient une tension de fragmentation de 70 V, une température de gaz de 250 °C, température du gaz gaine de 250 °C et tension capillaire de 4000 V. Les aires de pic ont été normalisées à l'aide de l'étalon interne et les concentrations ont été déterminées par comparaison avec des courbes d'étalonnage préparées à partir de séries de dilution d'étalons authentiques. La plage d'étalonnage pour l'acide phénylpropionique était de 0,020 à 30 mM, 0,003 à 12 mM pour la phénylpropionylglycine, 0,020 à 30 mM pour l'acide 4-hydroxyhippurique, 0,049 à 30 mM pour l'acide 3-(4-hydroxyphényl)propionique, 0,020 à 12 mM pour N -(3-(4- hydroxyphényl)propionyl)glycine, 0,003-12 mM pour l'isocaproylglycine et 0,12-30 mM pour la N-cinnamoylglycine. Le modèle de régression d'étalonnage linéaire a été appliqué à la N-(3-(4-hydroxyphényl)propionyl)glycine et à la créatinine, et le modèle de régression quadratique a été appliqué aux autres composés, en utilisant l'algorithme de régression des moindres carrés pondérés 1/x. R2 = 0,999, 0,999, 0,999, 0,998, 0,998, 1,000 et 0,990 pour la créatinine, l'isocaproylglycine, l'acide 4-hydroxyhippurique, l'acide 3-(4-hydroxyphényl)propionique, la N-(3-(4-hydroxyphényl)propionyl)glycine, la phénylpropionylglycine et la N-cinnamoylglycine.

Les profils d'acylcarnitine ont été évalués à l'aide d'un test de spectrométrie de masse à dilution isotopique cliniquement validé avec un spectromètre de masse triple quadripôle SCIEX 4500. L'ensemble complet de non étiquetés (cat #s : NSK-B-US-1, NSK-B-G1-US-1, ULM-7195-PK) et étiquetés (cat #s : NSK-B, NSK-B-G1 , DLM-9067-0.1MG) les étalons d'acylcarnitine ont été achetés auprès de Cambridge Isotopes (Tewksbury, MA). Pour la préparation des échantillons, 20 μL de plasma ont été précipités avec 300 μL d'acétonitrile avec 0,1 % d'acide formique contenant l'ensemble complet d'étalons internes isotopiques. Après centrifugation à 13 000 × g pendant 5 min, les surnageants ont été transférés dans un nouveau tube et évaporés à l'azote. Ensuite, les échantillons ont été dérivés avec 100 μL d'acide chlorhydrique 3 N dans du butanol à 65 ° C pendant 15 min. Après dérivation, les échantillons ont été évaporés avec de l'azote. Ensuite, les échantillons séchés ont été reconstitués avec de l'acétonitrile à 80 % dans de l'eau et transférés dans des flacons d'échantillonneur automatique à 96 puits équipés d'un bouchon en silicone. L'échantillonneur automatique réfrigéré a été réglé à 4 °C. Les échantillons (4 μL) ont été injectés immédiatement après la préparation des échantillons. Les extraits ont été introduits dans le spectromètre de masse par analyse par injection de flux. Les conditions isocratiques de la phase mobile étaient 100 % d'acétonitrile avec un débit de 0,1 mL min-1. Les espèces d'acylcarnitine ont été détectées en polarité positive ESI à l'aide d'un balayage d'ions précurseurs de 85 m/z sur la plage de masse de 200 à 550 m/z. Les paramètres d'ionisation par électrospray étaient de 5500 V pour la tension de pulvérisation d'ions, de 200 ° C pour la température de la source et d'une pression de 20 PSI pour les gaz 1 et 2. Pour la quantification, les hauteurs de pic ont été normalisées à l'aide de l'étalon interne et les concentrations ont été déterminées par comparaison à l'étalonnage. courbes préparées pour chaque acylcarnitine.

MS-DIAL a été utilisé pour l'appel de pointe et l'intégration des données métabolomiques non ciblées MCAD+/+ vs MCAD−/− LC-MS. Toutes les autres analyses et visualisations ont été réalisées avec Excel et GraphPad Prism (versions 8 et 9, graphpad.com).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données de spectrométrie de masse non ciblées générées dans cette étude ont été déposées dans la base de données Metabolomics Workbench. Les données métabolomiques brutes du fusil de chasse GC-TOF sont disponibles sous le numéro d'accession ST001606 ; données LC-MS non ciblées, ST001633. Nos analyses de ces ensembles de données sont fournies dans les données supplémentaires 1 à 4 ; toutes les données restantes générées dans cette étude sont fournies dans le fichier Source Data. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions Lalla Fall pour l'assistance technique à l'analyse LC-MS, Shuo Han pour l'assistance à la conservation des normes authentiques, Tim Meyer pour la fourniture de solutés urémiques et le ChEM-H Metabolomics Knowledge Center de l'Université de Stanford pour l'assistance au développement de la méthode LC-MS et l'accès à l'instrumentation. Ce travail a été financé en partie par une bourse de recherche prédoctorale de la Fondation Ford et un programme de bourses de recherche pour diplômés de la National Science Foundation (GRFP) à KMP, National Institutes of Health Grants DK110335 (DD), GM142873 (DD), AT011396 (DD), DK101674 (JLS) , DK085025 (JLS). JLS et MAF sont les enquêteurs de Chan Zuckerberg Biohub.

Curt R. Fischer

Adresse actuelle : Octant Bio, Emeryville, Californie, États-Unis

Département de microbiologie et d'immunologie, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Kali M. Pruss, William Van Treuren, Steven K. Higginbottom, Michael A. Fischbach, Justin L. Sonnenburg et Dylan Dodd

Département de pathologie École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Haoqing Chen, Yuanyuan Liu, John B. Jarman, Tina M. Cowan et Dylan Dodd

ChEM-H, Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Curt R. Fischer et Michael A. Fischbach

Stanford Healthcare, Palo Alto, Californie, États-Unis

Justin Mak et Beverly Wong

Département de bioingénierie, Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Michel A. Fischbach

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, Californie, États-Unis

Michael A. Fischbach et Justin L. Sonnenburg

Centre d'études sur le microbiome humain, Stanford, Californie, États-Unis

Justin L. Sonnenburg

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Déclaration DD, JLS, MAF et TMC ont conçu et conçu cette étude. KMP, DD, WVT, JBJ, YL et SH ont réalisé des expériences sur des souris et aidé à la préparation des échantillons. HC, DD, JM, BW et CF ont conçu et réalisé des tests LC-MS. Tous les auteurs ont fourni des contributions intellectuelles. KMP, HC, DD, JLS et MAF ont rédigé l'article et tous les auteurs ont fourni des commentaires.

Correspondance avec Dylan Dodd.

DD et MAF sont cofondateurs de Fédération Bio. Tous les auteurs restants ne déclarent pas d'intérêts concurrents.

Nature Communications remercie André Marette et les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Pruss, KM, Chen, H., Liu, Y. et al. Le co-métabolisme hôte-microbe via MCAD génère des métabolites circulants, dont l'acide hippurique. Nat Commun 14, 512 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36138-3

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Reçu : 30 octobre 2022

Accepté : 17 janvier 2023

Publié: 31 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-36138-3

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