Les cils primaires contrôlent la structuration cellulaire des glandes de Meibomius pendant la morphogenèse mais pas la composition lipidique

Communications Biology volume 6, Article number: 282 (2023) Citer cet article

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Les glandes de Meibomius (MG) sont des glandes sébacées modifiées produisant les lipides du film lacrymal. Malgré leur rôle essentiel dans le maintien d'une vision claire, les mécanismes sous-jacents à la morphogenèse de la MG dans le développement et la maladie restent obscurs. Les signaux médiés par les cils sont essentiels au développement des annexes cutanées, y compris les glandes sébacées. Ainsi, nous avons étudié le rôle des cils dans la morphogenèse MG au cours du développement. La plupart des cellules étaient ciliées au début du développement de la MG, suivies d'un désassemblage des cils au cours de la différenciation. Dans les glandes matures, les cellules ciliées étaient principalement limitées à la couche basale du canal central de la glande proximale. L'ablation des cils dans les tissus exprimant la kératine14 a perturbé l'accumulation de cellules prolifératives à l'extrémité distale, mais n'a pas affecté le taux global de prolifération ou d'apoptose. De plus, une altération de la structuration cellulaire pendant l'allongement a entraîné une hypertrophie des MG matures avec une augmentation du volume de meibum sans altérer sa composition lipidique. Ainsi, les réseaux de signalisation des cils fournissent une nouvelle plate-forme pour concevoir des traitements thérapeutiques pour le dysfonctionnement de la MG.

Les glandes de Meibomius (MG) sont des glandes holocrines situées dans les plaques tarsiennes des paupières supérieures et inférieures. Ces glandes sébacées modifiées (SG) sont composées de grappes d'acini sécrétoires qui déchargent leur sécrétion dans plusieurs canaux plus courts se ramifiant à partir du canal central de la glande. Le produit de sécrétion, le meibum (composé de lipides, de protéines et d'acides nucléiques de la cellule entière), est finalement libéré au niveau du bord de la paupière. Le meibum s'étend ensuite sur la surface oculaire, en tant que couche la plus externe du film lacrymal, à chaque clignement1,2. Cette couche riche en lipides joue un rôle protecteur crucial pour la surface oculaire, car elle agit comme un lubrifiant pour les paupières pendant le clignement, empêche le débordement des larmes sur les paupières et réduit l'évaporation des larmes1,3.

Les MG défectueuses entraînent un dysfonctionnement des glandes de Meibomius (MGD), défini comme "une anomalie chronique et diffuse des MG, généralement caractérisée par une obstruction du canal terminal et/ou des modifications qualitatives/quantitatives de la sécrétion glandulaire"4. Une sécrétion lipidique réduite peut contribuer à l'instabilité du film lacrymal et faciliter l'entrée dans le cercle vicieux de la sécheresse oculaire (SSO), parmi les maladies ophtalmiques les plus couramment rencontrées avec une prévalence globale allant de 5 à 50 %5. Le SSO est subdivisé en deux catégories principales et non mutuellement exclusives : la sécheresse oculaire par déficience aqueuse (ADDE) et la sécheresse oculaire par évaporation (EDE)6. Le MGD est considéré comme la principale cause d'EDE et de DED6,7,8. Le développement récent de solutions thérapeutiques ciblant le MGD comprend des lubrifiants oculaires, des dispositifs de réchauffement des paupières et une lumière pulsée intense, se concentrant principalement sur le soulagement de l'obstruction de la MG ou le remplacement des lipides9. Cependant, il existe un besoin non satisfait de traitements pour prévenir l'atrophie MG et stimuler la production de lipides. Cette carence en cibles pharmacologiques efficaces actuelles est principalement due aux connaissances très limitées sur les réseaux moléculaires sous-jacents au développement et au renouvellement de la MG qui pourraient être la cible d'un traitement efficace et durable du MGD.

La formation de MG humaine se produit au cours du développement embryonnaire entre le troisième et le septième mois de gestation, correspondant à la phase de paupière scellée du développement des paupières1. Chez la souris, le développement de la MG commence au jour embryonnaire 18,5 (E18,5) et se poursuit après la naissance10. Comme chez l'homme, le développement de la MG chez la souris se produit pendant la phase de paupière scellée du développement des paupières, qui est indispensable au développement de la MG11,12.

Bien qu'il ait été suggéré que le développement de la MG partage des similitudes avec le développement de l'unité pilo-sébacée comprenant un follicule pileux et ses SG associés, les mécanismes de base sous-jacents au développement et au renouvellement de la MG restent mal compris. Comme les follicules pileux, les MG se développent à partir de la feuille ectodermique, qui s'invagine dans le mésoderme pour former un anlage. Puis, à l'instar de l'ébauche capillaire des cils, l'ébauche meibomienne développe des excroissances latérales qui se différencient ensuite en ductules et acini sébacées13. Dans le développement murin, une placode épithéliale se forme à E18.5, suivie d'une invagination dans le mésenchyme et d'un allongement de la placode, d'une ramification des MG commençant vers le jour postnatal 5 (P5) et de l'acquisition de leur morphologie mature par P1510.

Les cils primaires sont des organites cellulaires à base de microtubules qui proviennent du corps basal et s'étendent de la membrane plasmique. Le transport intraflagellaire (IFT), un mouvement bidirectionnel de particules protéiques le long de l'axonème, assure l'assemblage et le maintien appropriés des cils14,15,16,17,18. Le dysfonctionnement du cil primaire produit un groupe hétérogène de maladies appelées ciliopathies, dont certaines induisent des anomalies sévères du développement, soulignant le rôle crucial du cil primaire dans le développement tissulaire19. Le cil primaire joue un rôle essentiel dans le développement des tissus dérivés de l'ectoderme, notamment la peau, l'épithélium cornéen et l'unité pilosébacée20,21. En particulier, le cil primaire module l'épaississement de l'épithélium cornéen par la régulation de la prolifération cellulaire et de la migration verticale22. Au niveau de la peau, les cils primaires limitent l'hyperprolifération des kératinocytes dans l'épiderme23,24. De plus, l'ablation primaire des cils entraîne un arrêt de la morphogenèse du follicule pileux24,25,26,27,28,29,30 et une dérégulation du cycle de croissance des cheveux31. Les patients atteints du syndrome de Bardet-Biedl, une ciliopathie autosomique récessive, souffrent de plusieurs affections cutanées, dont la kératose pilaire et la dermatite séborrhéique32. Fait intéressant, l'ablation primaire des cils induit une hyperplasie des lobules SG, indiquant un rôle régulateur dépendant des cils dans le développement des SG23. Cependant, la pathogenèse de ces affections cutanées associées aux cils et les mécanismes sous-jacents à l'élargissement anormal des SG restent inconnus. Bien que le rôle du cil primaire ait été étudié dans divers tissus dérivés de l'ectoderme, son rôle dans le développement, le maintien et la fonction de la MG reste inconnu.

Dans cette étude, nous montrons que les cellules MG sont ciliées dans les premiers stades de développement et que les meibocytes perdent leur cil primaire à mesure qu'ils se différencient. Nous démontrons que le cil primaire est nécessaire pour réguler le diamètre du conduit central et la taille globale des MG. Nous proposons un mécanisme par lequel les cils primaires déterminent la structuration précoce des cellules MG en contrôlant la distribution spatiale des cellules proliférantes et mourantes dans les glandes en développement. Ces résultats suggèrent des voies de signalisation médiées par les cils comme cibles thérapeutiques potentielles pour contrer le MGD.

Pour déterminer l'implication des cils primaires dans la morphogenèse de la MG, nous avons généré le knock-out conditionnel K14-Cre;Ift88fl/fl (appelé ici cKO). Chez cette souris, le gène Ift88, codant pour une sous-unité de la machinerie IFT nécessaire à l'assemblage et au maintien des cils33, est excisé dans toutes les cellules épithéliales exprimant la kératine 14 (K14), y compris les tissus MG. L'expression de la recombinase K14-Cre a été suivie en utilisant la lignée de souris reporter mT/mG34 (Supplément Fig. 1). Dans la lignée transgénique K14-Cre;Ift88floxed;mT/mG, l'excision dépendante de Cre d'une cassette exprimant la tdTomato (mT) ciblée par membrane fluorescente rouge a entraîné l'expression d'une protéine fluorescente verte (mG) ciblée par membrane dans K14 -tissus exprimant (Supplément Fig. 1). Pour surveiller l'ablation des cils primaires dans les MG, nous avons immunodétecté ARL13B, une protéine associée à la membrane ciliaire35,36. À P3, des cils étaient présents sur pratiquement toutes les cellules MG des souris témoins. En revanche, les cils étaient absents ou très courts dans les cellules MG de souris cKO (supplément Fig. 1). Comme décrit précédemment, l'apparence externe des souris cKO nouveau-nées était généralement similaire à celle des souris témoins22,23. Étant donné que les défauts de fusion et d'ouverture des paupières au cours du développement peuvent affecter la morphogenèse de la MG, nous avons analysé en détail ces processus11. La fusion et l'ouverture des paupières chez les souris cKO et témoins se sont produites respectivement autour de E15.5 et P13, confirmant les résultats d'études antérieures22,23. Cependant, nous avons remarqué la présence de débris séborrhéiques multifocaux, blancs, granuleux à crayeux le long des bords des paupières de la plupart des souris cKO adultes, ce qui n'a pas été observé chez les souris témoins (Fig. 1a).

a Images représentatives des yeux adultes témoins et cKO (6 mois). La flèche indique un dépôt blanc, observé uniquement chez les souris cKO. b Images représentatives de plaques tarsiennes colorées avec ORO à P6 et P8. Les régions encadrées indiquent les zones affichées à un grossissement plus élevé. Barre d'échelle, 200 µm ; N, nasale ; T, temporal. c Le nombre de MG et la taille des MG ont été quantifiés à P6 et P8 (n = 20 témoins et 5 souris cKO à P6 ; n = 13 témoins et 9 souris cKO à P8). Par souris, la zone MG a été déterminée en faisant la moyenne de la zone MG de toutes les MG individuelles dans les paupières supérieures et inférieures. Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± ET. La signification statistique a été évaluée à l'aide du test de Mann-Whitney. ns, non significatif, P ≥ 0,05. d Images représentatives de plaques tarsiennes colorées avec ORO à P21. Les régions encadrées indiquent les zones affichées à un grossissement plus élevé. Barre d'échelle, 200 µm ; N, nasale ; T, temporal. e Images représentatives des MG témoins et cKO colorées avec HE à P6 et P21. Les régions encadrées indiquent les zones affichées à un grossissement plus élevé. Barre d'échelle, 200 µm.

La coloration au rouge d'huile O (ORO) de la plaque tarsienne a révélé que le nombre de MG par paupière (supérieure et inférieure) était similaire chez les souris témoins et cKO à P6 et P8 (Fig. 1b, c). Cependant, les zones colorées des MG cKO étaient 29% et 21% plus grandes que celles des souris témoins à P6 et P8, respectivement (Fig. 1c). Les MG matures, comme on le voit chez les souris à P21, sont apparues très proches les unes des autres chez les souris cKO et témoins, remettant en question le contour précis des glandes individuelles et donc la mesure de leur surface (Fig. 1d). Cependant, les MG sont apparues plus densément réparties dans les plaques tarsales du cKO que dans celles des souris témoins. Des foyers non colorés étaient visibles entre la région proximale des MG adjacentes dans le contrôle, mais pas dans le cKO (flèches sur la Fig. 1d). De plus, aucune différence significative dans les dimensions de la MG n'a été observée entre les hommes et les femmes du même génotype (supplément Fig. 2), et les deux sexes ont été regroupés pour l'ensemble de l'étude. Malgré les différences de taille de MG, l'analyse histologique a révélé que la morphologie des méibocytes basaux et en différenciation était similaire chez les mutants et les témoins, et aucun signe d'obstruction des canaux n'a été observé chez les souris mutantes (Fig. 1e).

Compte tenu de l'expansion significative des MG mutantes, nous avons demandé si la production et la composition des lipides étaient modifiées chez le mutant cil. Les profils lipidiques des extraits de plaque tarsienne ont été évalués par spectrométrie de masse (MS) à haute résolution en combinaison avec une chromatographie liquide ultra-haute performance en phase inverse isocratique et à gradient. Environ 150 analytes avec des combinaisons uniques de temps de rétention et de rapports masse/charge (m/z) ont été identifiés. Les spectres de masse représentatifs d'un échantillon témoin de type sauvage sont présentés sur les figures 2a à c. L'analyse en composants principaux (ACP) n'a produit aucun regroupement évident des échantillons de contrôle ou de cKO (Fig. 2d), ce qui implique que leurs compositions chimiques étaient similaires. Cependant, l'analyse d'échantillons pour un ensemble de 15 espèces lipidiques majeures des familles des esters de cire (WE) et des esters de cholestérol (CE) a montré une augmentation d'environ deux fois de la quantité de lipides produits chez le mutant cKO par rapport aux souris témoins ( Figure 2e). Collectivement, l'ablation primaire des cils dans les MG a entraîné l'expansion de la taille des MG et une multiplication par deux de la production de lipides sans affecter le processus de maturation global des meibocytes et, par conséquent, la composition lipidique du meibum.

a Un signal analytique du cholestérol libre (Chl) et des esters de cholestérol (EC) d'une souris témoin. b Un spectre d'observation du pool d'esters de cire de Meibomius (WE) d'une souris témoin. ( c ) Un spectre d'observation des pools de triacylglycérols (TAG), de diols α, ω-diacylés (DiAD) et d'esters de cholestérol d'acides gras ω-hydroxy (O) acylés (Chl-OAHFA) d'une souris témoin. d Un graphique des scores généré à l'aide de l'analyse en composantes principales (ACP) pour le contrôle (C, points jaunes) et cKO (M, points verts) Les données LC/MS ont démontré un fort chevauchement des échantillons de contrôle et mutants de lipides meibomiens sans regroupement clair des échantillons de différents types, indiquant leurs compositions biochimiques proches. e Cependant, l'ablation du cil primaire a entraîné une production globale de lipides plus élevée dans les plaques tarsiennes des souris cKO par rapport à la teneur en lipides des souris témoins (n ​​= 6 pour Ctrl et n = 6 pour cKO). Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± ET. La signification statistique a été évaluée à l'aide du test de Mann-Whitney.

Pour mieux comprendre le rôle des cils dans le contrôle de la taille des MG, nous avons cherché à déterminer la distribution spatio-temporelle des cils primaires dans les MG en développement et matures de la souris transgénique Arl13b-mCherry; Centrin2-GFP (Fig. 3). Cette souris exprime ARL13B, une protéine associée à la membrane des cils, fusionnée à la protéine fluorescente rouge monomère mCherry, et Centrin2, une protéine centriolaire, fusionnée à la GFP, ce qui donne des cils et des corps basaux marqués par fluorescence rouge et verte, respectivement35,36,37 ,38. Étant donné que la taille et la morphologie des MG varient en fonction de leur position dans la plaque tarsienne (Fig. 1b), nous avons numéroté les MG en partant de la plus grosse glande du côté temporal de la paupière (Fig. 3a). Tout au long de cette étude, nous avons analysé les glandes préférentiellement situées à une position médiane similaire dans la plaque tarsienne, comme illustré sur les figures 3a, b, chez des souris mutantes et témoins.

a Pour faciliter la comparaison de MG similaires, les MG ont été numérotées du côté temporal (MG#1) au côté nasal (MG#11). La zone encadrée indique la région dans laquelle les MG ont été étudiées pour toutes les expériences suivantes b Plaque tarsienne entière à P3 imagée par microscopie confocale. Les MG ont été colorées avec un anticorps contre K14 (en blanc). Les follicules pileux (marqués d'un *) étaient également colorés mais se distinguaient facilement des MG en raison de la présence d'une tige pilaire. La région encadrée indique le MG montré à un grossissement plus élevé en c et d. Barre d'échelle, 100 µm. c Reconstruction 3D avec Imaris de MG#7 Chez les souris Arl13b-mCherry;Centrin2-GFP, mCherry marque les cils primaires en rouge et GFP marque les corps basaux en vert. A P3, les cils étaient visibles tout le long du MG. Barre d'échelle, 15 µm. d Coupe optique prise au centre de MG#7. Les corps basaux (en vert) et les cils primaires (en rouge) ont été localisés sur le côté apical des cellules basales MG (entourées d'une ligne pointillée jaune). Barre d'échelle, 15 µm. e Coupe longitudinale MG représentative en P6. Les MG (soulignées par une ligne pointillée jaune) ont été colorées avec un anticorps contre K14 (en blanc), les noyaux ont été colorés avec du DAPI (en bleu), les corps basaux ont été marqués avec GFP (en vert) et les cils primaires ont été marqués avec mCherry (en rouge). Les cellules MG sont ciliées tout le long du MG, y compris dans l'extrémité distale de la glande (i), les acini en formation (ii) et le canal central en formation (iii). Barre d'échelle, 15 µm. f Coupe longitudinale représentative d'une MG morphologiquement mature à P25. Les MG (soulignées par une ligne pointillée jaune) ont été colorées avec un anticorps contre K14 (en blanc), les noyaux ont été colorés avec du DAPI (en bleu), les corps basaux ont été marqués avec GFP (en vert) et les cils primaires ont été marqués avec mCherry (en rouge). Aucun cil primaire n'était visible dans les acini (i), mais des cils primaires (flèches) étaient toujours présents dans les canalicules (ii) et le canal central (iii). Barre d'échelle, 100 µm ; Ac, acini ; CD, conduit central. g Quantification du pourcentage de cellules ciliées tout au long du développement (n = 3 pour chaque âge). Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± ET. La signification statistique a été évaluée à l'aide du test de Kruskal-Wallis. Pour plus de clarté, seules les différences statistiquement significatives sont indiquées sur le graphique. h Distribution spatiale des cellules ciliées au sein des MG à P12 et P25. Le pourcentage de cellules ciliées a été quantifié spécifiquement dans les acini et dans le canal central des MG à P12 et P25 (n = 3 pour chaque âge). Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± ET. La signification statistique a été évaluée à l'aide du test de Mann Whitney (Ctrl contre cKO) et du test des rangs signés de Wilcoxon (acini contre canal). ns, non significatif, P ≥ 0,05.

À P3, plus de 70% des cellules MG présentaient des cils primaires émanant du côté apical des cellules basales vers le centre de la glande en développement (Fig. 3c, d, g). Une proportion similaire de cellules MG était ciliée au début de la ramification MG à P6 et P8 (Fig. 3e, g). À P6, les cils primaires étaient visibles dans la pointe distale allongée, le canal en développement et les acini en herbe ; cependant, les corps basaux des méibocytes matures situés au centre du canal central ne présentaient pas de cils (Fig. 3e, pointes de flèches jaunes). Au fur et à mesure que les MG continuaient à mûrir, le pourcentage de cellules ciliées diminuait progressivement à 30% et 12% à P12 et P25, respectivement (Fig. 3g). Le pourcentage de cellules ciliées était similaire dans le canal et les acini des MG à P12 (Fig. 3h); cependant, à P25, les cils primaires étaient absents des acini (Fig. 3f, h). À P25, la plupart des cils primaires ont été détectés sur les cellules basales de la région proximale du canal central. Pourtant, certains étaient également parfois visibles sur les cellules basales des conduits de connexion (Fig. 3f). Ainsi, les cils primaires se sont localisés dans les cellules basales des MG en développement et se sont désassemblés au fur et à mesure que le développement des MG progressait et que les meibocytes mûrissaient. Cependant, les cils persistaient sur les cellules basales du canal central des glandes matures. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent un rôle des cils au cours d'une étape précoce du développement de la morphogenèse MG impliquant principalement des cellules en division et indifférenciées.

Plusieurs études ont montré que la résorption du cil primaire est nécessaire à la prolifération cellulaire et ont démontré soit une réduction, soit une perte des cils primaires dans divers néoplasmes épithéliaux (revue dans39,40,41). Ainsi, nous avons examiné si l'expansion anormale de la taille des MG du mutant cil était due à une augmentation des taux de prolifération cellulaire. Les taux de prolifération ont été déterminés en comptant le nombre de cellules EdU-positives 6 h après l'injection d'EdU et normalisés au nombre total de cellules identifiées par coloration nucléaire DAPI. Pour évaluer avec précision les taux de prolifération des glandes, nous avons compté les cellules EdU-positives et DAPI-positives sur des coupes en série de la paupière, couvrant l'épaisseur totale des MG pour chaque glande. Les taux de prolifération cellulaire ont été évalués à P4, P6 et P21 lorsque les MG s'allongeaient, commençaient à se ramifier et atteignaient leur morphologie mature, respectivement10. Le pourcentage global de cellules en division dans les MG des souris mutantes et témoins était d'environ 40 % à P4, a diminué à environ 25 % à P6 et a atteint des valeurs de référence d'environ 5 % à P21 sans aucune différence significative détectée entre les souris témoins et cKO à l'un des points temporels analysés (Fig. 4a – d).

a – c La prolifération cellulaire a été évaluée par coloration EdU dans les MG à P4, P6 et P21 chez les souris témoins ( a , b et c ) et cKO ( a ', b ' et c '), respectivement. Barre d'échelle, 100 µm ; *, follicule de cheveux; Elm, marge de la paupière ; d, distale ; p, proximale. d–e Les taux de prolifération ont été quantifiés à P4, P6 et P21 dans les MG complètes (d), et plus particulièrement dans la moitié proximale (p) (du bord de la paupière au centre de la glande) et la moitié distale (d) ( du milieu à la pointe de la glande) des MG e. Les taux de prolifération ont été déterminés en normalisant le nombre de noyaux EdU-positifs au nombre total de noyaux colorés par DAPI (n = 4/groupe). Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± ET. La signification statistique a été évaluée à l'aide du test de Mann Whitney (Ctrl vs cKO) et du test des rangs signés de Wilcoxon (distal vs proximal). ns, non significatif, P ≥ 0,05. ( f ) La mort cellulaire a été évaluée par coloration TUNEL dans les MG à P21 chez les souris témoins ( f ) et cKO ( f '), respectivement. Barre d'échelle, 100 µm ; *, follicule de cheveux; Elm, marge de la paupière ; d, distale ; p, proximale. (g – h Les taux de mortalité cellulaire ont été quantifiés à P21 dans les MG complètes (g) et plus particulièrement dans le canal central (h). Les taux de mortalité cellulaire ont été déterminés en normalisant le nombre de noyaux TUNEL-positifs au nombre total de noyaux colorés par DAPI (n = 3/groupe). Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± écart-type. La signification statistique a été évaluée à l'aide du test de Mann-Whitney (total, Ctrl contre cKO) et du test de rang signé de Wilcoxon (distal contre proximal). ns, non -significatif, P ≥ 0,05.

En outre, nous avons examiné la distribution des cellules proliférantes le long de l'axe proximal-distal des glandes. Chez les souris témoins, 52 % et 28 % des cellules se divisent dans la moitié distale de la glande à P4 et P6, respectivement. En revanche, seulement 32 % et 22 % des cellules proliféraient dans la moitié proximale de la glande chez les souris témoins à P4 et P6, respectivement. Ainsi, lors du développement des MG témoins, les cellules proliférantes étaient plus abondantes dans la région distale que proximale (Fig. 4a, b, e). En revanche, les cellules proliférantes étaient réparties uniformément sur la longueur des glandes chez le mutant (Fig. 4a ', b', e). En P21, l'enrichissement distal des cellules prolifératives le long de l'axe proximo-distal n'était plus visible (Fig. 4c, e). Ainsi, au cours du développement de la MG, l'ablation primaire des cils n'a pas modifié les taux de prolifération cellulaire globaux, mais a plutôt eu un impact sur la concentration préférentielle des cellules en division dans la moitié distale des glandes. Cependant, le nombre de corps basaux associés à un cil primaire n'était pas significativement différent entre les moitiés distale et proximale des MG à P3, P6 et P8 (supplément Fig. 3).

Ensuite, nous avons évalué si la perturbation de l'architecture des glandes, observée avec l'ablation des cils, altérait de la même manière le nombre ou la distribution des cellules apoptotiques. Nous avons quantifié le pourcentage de cellules apoptotiques dans les MG matures à P21 par coloration TUNEL et DAPI. Le pourcentage global de cellules TUNEL positives (TUNEL +) détectées dans les canalicules, les acini et le canal central de la glande, où la majorité des cellules apoptotiques étaient localisées, était similaire chez les souris témoins et cKO (Fig. 4f, g). Bien que nous n'ayons pas détecté de ségrégation spatiale des cellules apoptotiques dans la MG des souris témoins et cKO (Fig. 4g), lorsque nous ne considérions que le canal central de la glande, un pourcentage plus élevé de cellules TUNEL + était localisé dans la moitié distale que dans la moitié proximale chez les souris témoins (Fig. 4h). En revanche, dans le canal central des souris cKO, les cellules apoptotiques étaient uniformément réparties entre les moitiés distale et proximale des glandes (Fig. 4h). Ainsi, l'ablation des cils primaires n'affecte pas les taux de mort cellulaire, mais affecte plutôt la localisation des cellules TUNEL + dans le canal central MG. Collectivement, ces résultats indiquent que l'absence de cils affecte la distribution des cellules en division et apoptotiques plutôt que les taux globaux de prolifération et de mort cellulaire, ce qui modifie par la suite l'architecture et la taille des MG mutantes.

Pour déterminer comment l'absence de cils affecte la morphogenèse de la MG et conduit à des glandes anormalement plus grandes, nous avons examiné la formation de modèles cellulaires au cours des premières étapes morphogénétiques du développement de la MG. Le rapporteur mG exprimé lors de la recombinaison homologue dépendante de Cre chez la souris mT / mG nous a permis de suivre la morphogenèse de MG à la résolution cellulaire chez le mutant et le contrôle. À P1, lorsque l'invagination épithéliale du bord de la paupière s'allonge dans le mésenchyme de la paupière, les ébauches meibomiennes du mutant présentaient une taille et une forme globale similaires à celles observées chez le témoin (Fig. 5a, b). Cependant, alors que les cellules de l'ébauche épithéliale invaginante dans le contrôle semblaient bien organisées en une couche de cellules basales entourant une couche de cellules suprabasales, chez le mutant, ce modèle cellulaire semblait moins défini et les couches basale et interne n'étaient pas clairement reconnaissables (Fig. 5a, b). Au fur et à mesure que la morphogenèse progressait, par P3 MG, les ébauches du mutant étaient plus courtes mais plus larges que celles du témoin (Fig. 5c – g). De plus, le rapport du nombre de cellules basales par rapport au nombre de cellules au centre de la glande était significativement réduit chez les souris cKO, indiquant qu'il y avait plus de cellules dans la partie centrale des MG cKO (Fig. 5h, i).

a–b Vue d'ensemble représentative des plaques tarsiennes entières du montage à P1 imagées par microscopie confocale. Les MG ont été visualisées par le rapporteur fluorescent mG. Les régions encadrées indiquent les MG montrées à un grossissement plus élevé, pour lesquelles des sections optiques en série sont affichées. Barre d'échelle, 50 µm. c–d Un aperçu représentatif des plaques tarsiennes entières du montage à P3 imagées par microscopie confocale. Les MG ont été visualisées par le rapporteur fluorescent mG. Les régions encadrées indiquent les MG montrées à un grossissement plus élevé en e. Barre d'échelle, 50 µm. Longueur MG (f) et largeur MG (g) des souris cKO normalisées au contrôle (n = 5 souris/groupe). Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± ET. La signification statistique a été évaluée à l'aide du test de Mann-Whitney. h Les cellules basales (en violet) et les cellules centrales (en bleu) ont été manuellement codées par couleur, puis comptées. i Le rapport entre les cellules basales et les cellules centrales a été calculé (n = 5 souris/groupe). Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± ET. La signification statistique a été évaluée à l'aide du test de Mann-Whitney.

Au fur et à mesure que les MG continuent à se développer, les cellules du cordon central de l'épithélium se dilatent en P6, le canal central commence à se former et des branches latérales apparaissent10. À P6 et P21, la largeur du canal central mutant était respectivement 10% et 30% plus grande que celle du témoin (Fig. 6a – d). Parce que la prolifération cellulaire, l'apoptose et la taille des cellules sont restées inchangées dans les MG du mutant et du contrôle, nous avons estimé que, au moins pendant les premiers stades de développement, la masse globale des glandes dans les deux génotypes resterait similaire. En utilisant la microscopie à deux photons sur des échantillons entiers de plaques tarsales, nous n'avons trouvé aucune différence significative dans le volume moyen global entre les MG mutantes et témoins à P1, P3 ou P4 (Fig. 6e, f). En revanche, à P8, le volume moyen des glandes mutantes était presque le double de celui des glandes témoins (Fig. 6g, h). Enfin, le nombre d'acini n'était pas significativement différent entre les deux génotypes (Fig. 6i). Ainsi, les cils primaires favorisent la ségrégation des cellules proliférantes à l'extrémité distale des MG en croissance, ce qui assure à son tour une croissance équilibrée en longueur et en largeur du canal MG (Fig. 6j). Pour déterminer si l'ablation des cils perturbe le résultat des cascades de signalisation médiées par les cils connues, nous avons examiné les niveaux d'expression de gènes sélectionnés connus pour être des cibles transcriptionnelles ou des composants essentiels des voies Hedgehog (Hh), Wnt ou Notch dans la plaque tarsienne de l'adulte. cKO et souris témoins par PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR). Les niveaux d'expression des gènes associés aux cascades de signalisation Wnt et Notch détectés chez le mutant étaient indiscernables de ceux trouvés chez le témoin (Fig. 6k). En revanche, nous avons détecté une réduction significative des niveaux d'ARNm du gène Gli1, facteur de transcription et cible transcriptionnelle de la voie Hh, chez le mutant par rapport au témoin (Fig. 6k). Cependant, les niveaux d'expression de gènes supplémentaires de la voie Hh, y compris les ligands Hh Desert (Dhh), Indian (Ihh) et Sonic hedgehog (Shh) et les cibles transcriptionnelles, y compris CyclinD et Ptch1, sont restés inchangés dans les deux cas. De futures études impliquant une analyse unicellulaire permettront d'approfondir notre compréhension du rôle des cils primaires dans la morphogenèse et le renouvellement de la MG.

a–d Coupes longitudinales MG représentatives à P6 (a) et P21 (c) et quantification du diamètre du conduit central à P6 (b) et P21 (d). Les MG ont été visualisés par le rapporteur fluorescent mG, et le diamètre du conduit central MG (souligné par des lignes pointillées blanches) a été mesuré (n = 5 souris/groupe). Barre d'échelle, 100 µm. e Vue d'ensemble représentative des plaques tarsiennes entières du montage à P3 imagées par 2 photons. Barre d'échelle, 100 µm. f Le volume de MG à P1, P3 et P4 a été quantifié après la reconstruction 3D des z-stacks à l'aide d'Imaris (n = 4 souris/groupe à P1, n = 5 souris/groupe à P3 et n = 3 souris/groupe à P4). Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± ET. La signification statistique a été évaluée à l'aide du test de Kruskal-Wallis. ns, non significatif, P ≥ 0,05. g Vue d'ensemble représentative de l'ensemble des plaques de tarse de montage à P8 imagées par 2 photons. Barre d'échelle, 100 µm. h Le volume de MG à P8 a été quantifié après la reconstruction 3D des z-stacks à l'aide d'Imaris (n = 4 souris/groupe). Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± ET. La signification statistique a été évaluée à l'aide du test de Kruskal-Wallis. ns, non significatif, P ≥ 0,05. i La ramification de la MG a été évaluée en comptant le nombre d'acini par glande à P8 (n = 5 témoins et n = 4 cKO). Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± ET. La signification statistique a été évaluée à l'aide du test de Mann-Whitney. ns, non significatif, P ≥ 0,05. ( j ) Modèle de morphogenèse MG et de formation de motifs cellulaires survenant au cours du développement précoce (de P1 à P3) dans cKO et contrôle. k L'analyse RT-qPCR des gènes cibles Hh (Dhh, Ihh, Shh, CyclinD, Gli1, Ptch1), Notch (Hes1, Hey1, Maml1, Notch1), Wnt (Axin2) dans des plaques tarsales isolées de cKO et le contrôle montre une régulation négative significative de Expression de Gli1 dans le tissu mutant par rapport au contrôle à l'âge adulte (n = 7 contrôles et n = 5 cKO). Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± ET. La signification statistique a été évaluée à l'aide du test de Mann-Whitney. ns, non significatif, P ≥ 0,05.

La fonction principale des MG est de sécréter le meibum, une couche lipidique qui protège la surface oculaire des facteurs environnementaux dangereux et de la dessiccation1,42,43. Plusieurs facteurs peuvent entraîner des défauts fonctionnels des MG pour lesquels il n'existe pas de traitements efficaces à long terme. Malgré leur rôle essentiel dans le maintien d'une vision claire, les mécanismes moléculaires et les réseaux de signalisation sous-jacents au développement et au maintien des MG restent mal compris. Notre étude dévoile le rôle critique des cils primaires dans le contrôle de la taille des MG et de la quantité de meibum produite. Ces découvertes mettent en lumière les mécanismes fondamentaux du développement et de la maintenance de la MG avec des implications importantes pour la conception des traitements de la MGD. Ici, nous avons montré qu'une souris mutante dépourvue de cils, via l'ablation du gène Ift88 dans un tissu exprimant K14, développe des MG anormalement grandes, qui contiennent deux fois plus de lipides que d'habitude. Cependant, l'élargissement de la glande n'a pas été obtenu par des modifications des taux de prolifération ou d'apoptose. Au lieu de cela, nous avons démontré que l'ablation des cils dans les glandes en développement modifiait l'organisation cellulaire et la localisation des cellules en division le long de leur axe proximal-distal, modifiant leur structure cellulaire et entraînant une augmentation des dimensions des glandes.

En utilisant un modèle de souris transgénique avec des cils et un corps basal marqués par fluorescence, nous avons montré que les cils primaires étaient présents sur les meibocytes principalement au début du développement de la MG. Ainsi, pour expliquer comment les processus de développement dans les tissus exprimant K14 déficients en cils ont conduit à des MG plus grandes chez les souris adultes sans modification des taux de prolifération ou d'apoptose, nous avons examiné la morphogenèse et la structuration cellulaire des MG en développement chez les souris témoins et cKO. Nous avons constaté qu'à P1, le modèle cellulaire des glandes de contrôle bourgeonnant à partir du bord fusionné de la paupière apparaissait organisé en une couche de bordure de cellules basales et une couche de cellules suprabasales au centre du bourgeon allongé. En revanche, ce modèle cellulaire était perturbé dans les bourgeons MG du mutant cil, où les cellules semblaient organisées de manière aléatoire avec des couches mal discernables (Fig. 5). A P3, le cordon épithélial solide a continué à s'invaginer dans le mésenchyme de la plaque tarsienne, et le nombre de couches centrales/suprabasales est passé à 2 ou 3. Pendant la phase d'élongation entre P4 et P6, la majorité des cellules en division localisées au pointe distale des glandes en développement du contrôle mais étaient uniformément réparties sur la longueur des glandes chez le mutant. Ainsi, les cils des MG pourraient être essentiels pour détecter les signaux mitogènes nécessaires à l'allongement proximo-distal. Nous proposons que le défaut de ségrégation spatiale des cellules en division dans la glande en croissance pourrait interférer avec le processus d'allongement à l'extrémité distale des glandes. Puisqu'aucune différence de prolifération n'a été détectée, une croissance plus lente à l'extrémité distale conduirait par conséquent à une expansion latérale anormale des cordons épithéliaux invaginants. En effet, nous avons constaté que le nombre de couches cellulaires centrales/suprabasales augmentait anormalement à 4 ou 5 dans la glande du mutant cil, et par conséquent, les glandes en développement étaient à la fois plus larges et plus courtes que les glandes témoins. Conformément à cette possibilité, le volume total des glandes est resté similaire chez le mutant et le témoin jusqu'à au moins P4 (voir le modèle de la Fig. 6j). A P8, le volume des MG mutantes augmente significativement par rapport au témoin ; cependant, la longueur de la glande était similaire dans les deux cas. Ainsi, nous émettons l'hypothèse qu'à mesure que les glandes se développent, des signaux inhibiteurs pourraient entraver leur élongation, qui finit par s'arrêter à la pleine maturation morphologique des glandes (P15). Par conséquent, alors que les MG témoins ont cessé de s'allonger, les glandes mutantes ont continué à croître et ont finalement atteint la longueur des glandes témoins. Cependant, comme le canal central était plus grand dans les glandes mutantes, la taille globale et la teneur en lipides des MG mutantes ont augmenté par rapport au témoin. Une dynamique similaire pourrait également se produire lors de la genèse des ductules. Des études futures visant à élucider le rôle des cils primaires dans la détermination de la localisation des cellules en division à l'extrémité distale de la MG en développement pourraient révéler un nouveau rôle des cils dans la morphogenèse tissulaire.

Contrairement aux SG, les MG ne sont pas structurellement liés au follicule pileux1. Cependant, il n'est pas clair si les follicules pileux des cils, qui intercalent les MG, affectent leur développement ou leur homéostasie. Dans la peau, l'ablation des protéines ciliogènes dans les tissus exprimant K14 conduit à la dégénérescence des follicules pileux via l'inactivation de la voie de signalisation Hh23,29,44. Cependant, des défauts dans la formation et l'entretien des follicules pileux n'étaient évidents que trois semaines après la naissance, un point auquel les MG ont déjà atteint leur configuration mature23. Ainsi, nous pouvons exclure tout rôle indirect des follicules pileux sur les défauts dépendants des cils affectant les MG comme rapporté dans cette étude. Il est largement admis que le compartiment ciliaire est nécessaire à la propagation de la voie de signalisation Hh et que l'ablation d'Ift88 inhibe la réactivité de Hh dans plusieurs tissus45,46. En conséquence, nous avons détecté des niveaux réduits d'ARNm du facteur de transcription et du gène cible transcriptionnel Gli1 dans la plaque tarsienne mutante par rapport au témoin. Des études sur la peau ont montré que la voie Hh est essentielle au développement des SG, qui partagent plusieurs caractéristiques de base avec les MG47. Ainsi, nos résultats montrant un élargissement anormal des MG déficientes en cils via l'ablation Ift88 peuvent être incompatibles avec le développement de la MG médiatrice de Hh. Fait intéressant, cependant, l'ablation des cils dans les cellules exprimant K14 a compromis la croissance et le maintien des cheveux via l'épuisement de la signalisation Hh, mais a également entraîné une SG élargie et multilobée dans la queue de la souris. Ainsi, ces preuves suggèrent une implication inhabituelle et complexe des cils dans l'axe de signalisation cils-Hh dans les SG et les MG. Une enquête approfondie de cette interaction pourrait révéler des informations mécanistes fondamentales dans la conception de stratégies thérapeutiques pour traiter à la fois les affections cutanées associées aux ciliopathies, telles que la kératose pilaire et la dermatite séborrhéique, et le MGD32.

Ici, nous avons montré que les meibocytes perdent leur cil primaire à mesure qu'ils mûrissent. Semblables à d'autres épithéliums, y compris l'épiderme et l'épithélium cornéen, les cils étaient présents sur les cellules basales mais désassemblés à mesure que les cellules se différencient et se déplacent apicalement22,23,24. Dans les glandes matures, les cellules ciliées étaient limitées à la région proximale du canal central et à la couche basale des canalicules et des acini. Curieusement, il a été démontré que dans les MG adultes, les cellules à division lente, qui reflètent une caractéristique des cellules souches, se localisent dans les canalicules au point où le canal central passe aux acini48. Ainsi, il serait intéressant de déterminer si les cellules à cycle lent sont ciliées. Dans la peau, les cils primaires jouent un rôle interfolliculaire indépendant de Hh dans la stratification de l'épiderme à l'homéostasie23,24. L'ablation d'Ift88 a augmenté les taux de prolifération et conduit à une expansion de la couche basale avec des cellules de type basal. Cependant, l'hyperprolifération n'a pas entraîné la formation de tumeurs ou de cloques23. Ceci est en contraste avec notre découverte indiquant que l'expansion de MG n'implique pas une augmentation du taux de prolifération. Cependant, il convient de noter que l'ablation d'Ift88 dans l'épithélium cornéen hautement proliférant au cours du développement ou de la réparation n'a eu aucun effet sur les taux de prolifération22. Suggérant que la prolifération cellulaire pourrait être un effet secondaire et indirect de l'ablation des cils. Fait intéressant, dans la peau et la cornée, les cils primaires des cellules basales épithéliales ont modulé la voie Notch indépendamment de la prolifération cellulaire22,24. Bien que nos résultats de RT-qPCR du tissu de la plaque tarsienne suggèrent que le cil primaire dans les MG de souris adultes n'est pas nécessaire pour transduire la signalisation Notch, il est possible que des différences potentielles dans les niveaux d'ARNm des gènes cibles Notch entre le mutant et le contrôle soient sous la marge détectable de cette approche. En effet, nous avons montré que seul un petit nombre de cellules restent ciliées dans les MG matures. Ainsi, de futures études au niveau de la cellule unique pourraient fournir une compréhension plus complète de l'implication des cils dans la maintenance de Notch et de MG. Fait intéressant, il a été montré que la suppression de la voie de signalisation Notch dans les cellules progénitrices des SG conduisait à une atrophie de la glande49. En revanche, l'ablation Notch à l'extérieur du compartiment des cellules souches a entraîné l'expansion du SG49. Dans une autre étude, l'ablation de Notch1 dans le tissu exprimant K14 a conduit à la formation de structures ressemblant à des kystes remplaçant le MGs50. Ainsi, il serait intéressant de déterminer une éventuelle implication du cil primaire dans la transduction de la voie Notch au niveau de la cellule unique en relation avec le maintien de la niche des cellules souches dans les MGs51.

L'analyse des lipides a montré que l'ablation des cils au cours du développement de la MG entraînait une double augmentation de la teneur en lipides. Bien que nous ayons démontré l'implication des cils dans la régulation de la taille de la MG, il n'est pas clair si le cil joue également un rôle plus direct dans la production de meibum. Le récepteur-γ activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPARγ) est un membre de la famille des récepteurs nucléaires des facteurs de transcription activés par des ligands impliqués dans la régulation de la différenciation des adipocytes et des sébocytes ainsi que dans la lipogenèse52,53. De plus, PPARγ est également impliqué dans la différenciation des meibocytes in vivo et in vitro et est nécessaire à la régulation à la hausse des gènes impliqués dans la production de lipides54,55,56. Des études récentes ont montré que dans le contexte de l'adipogenèse induite par une blessure, l'ablation des cils chez les progéniteurs fibro/adipogéniques (FAP) via la délétion Ift88 inhibait la production de PPARγ et la différenciation FAP en adipocytes57,58. Ces études plaideraient contre une implication directe des cils MG dans la lipogenèse dépendante de PPARγ ou la différenciation des méibocytes puisque l'ablation des cils dans les MG a entraîné une augmentation de la quantité de lipides et une expansion de la masse des méibocytes. Cependant, contrairement à la plupart des types de cellules, les cils primaires des FAP et les cellules du bourgeon des membres en développement inhibent l'expression de GLI1 et PATCHED1 en favorisant la formation de répresseurs GLI3. Par conséquent, l'ablation des cils a entraîné une augmentation, plutôt qu'une diminution, de l'activité de signalisation Hh59. Plusieurs études ont montré le rôle complexe de la voie Hh dans l'adipogenèse et la régulation de PPARγ60,61,62,63. Ainsi, les recherches futures portant sur le rôle des protéines GLI et, plus largement, sur le rôle de la voie Hh dans le développement et l'homéostasie des MG fourniront des informations mécanistes essentielles sur notre compréhension de la différenciation, du renouvellement et de la méibogenèse des méibocytes.

À ce jour, les options de traitement pour le MGD et le DED sont limitées. Les traitements physiques visant à augmenter la qualité et la quantité de meibum n'ont pas donné de résultats satisfaisants à long terme64,65,66. D'autres approches visant à remplacer la couche lipidique par l'application topique de larmes et d'émulsions artificielles contenant des lipides sont difficiles compte tenu de la structure et de la composition complexes de la couche lipidique de la surface oculaire42,67 Ainsi, élargir les stratégies de traitement en ciblant directement le renouvellement de la MG et la production de lipides ont le potentiel non seulement de soulager l'inconfort de la surface oculaire, mais également d'améliorer la qualité de vie des patients concernés. Ce travail a révélé que les voies médiées par les cils contrôlent l'expansion des MG et la production de lipides sans affecter la composition lipidique, indiquant une nouvelle cible thérapeutique pour combattre le MGD.

Souches de souris Ift88tm1Bky (ci-après dénommées Ift88fl/fl)68, B6N.Cg-Tg(KRT14-cre)1Amc/J (K14-Cre, Jackson Laboratory stock No 018964)69 et Gt(Rosa)26Sor(tm4(ACTB -tdTomato, -EGFP)Luo)/J (mT/mG), Jackson Laboratory stock No 007676)34 ont été maintenus sur des fonds génétiques mixtes C57Bl/6, FVB et 129. Les KO conditionnels Ift88 (cKO) ont été générés en croisant des mâles K14-Cre;Ift88fl/+ avec des femelles Ift88fl/fl. D'autres combinaisons alléliques que K14-Cre;Ift88fl/fl (cKO) ont été considérées comme contrôles (Ctrl). Les souches de souris Tg(CAG-Arl13b/mCherry)1 K et Tg(CAG-EGFP/CETN2)3-4Jgg/KandJ (appelées ici Arl13b-mCherry;Centrin2-GFP)37 ont été achetées au Jackson Laboratory (stock n° 027967) . Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives et à l'approbation du comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université Johns Hopkins et à la déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.

Les paupières supérieures et inférieures des souris P6 et P21 ont été disséquées, fixées pendant la nuit dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS et incluses dans de la paraffine pour analyse histologique. La coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (HE) a été réalisée selon les procédures standard. Les sections ont été imagées avec un scanner de diapositives Olympus VS200 (Olympus, Center Valley, PA). Les paupières des souris P3 ont été disséquées, fixées pendant 30 min à 2 h dans du PFA à 4 % dans du PBS et incorporées dans un composé à température de coupe optimale (OCT Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance, CA). Les cryosections ont été traitées pour la coloration primaire du cil. Après 10 min de fixation avec de l'acétone froide (-20 °C) et 20 min de perméabilisation avec 0,5 % de Triton X-100 dans du PBS, les coupes ont été incubées avec un anticorps de souris anti-tubuline acétylée (1:1000, T6793, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) et/ou un anticorps de lapin anti-ARL13B (1:800, 17711-1-AP, ProteinTech Group, Rosemont, IL) dans 2 % BSA/0,1 % Triton X-100/PBS pendant une nuit à 4 °C. Les coupes ont ensuite été incubées dans des anticorps fluorescents secondaires d'âne anti-lapin Alexa Fluor™ 647 (1:500, A-31573, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), d'âne anti-souris fluorescéine (FITC) (1:200, 715-095 -150, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA) et Rhodamine anti-souris d'âne (TRITC) (1:200, 715-025-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) dans 2 % BSA/PBS pendant 2 h. Les sections ont été montées avec le milieu de montage antifade VECTASHIELD (H-1000, Burlingame, CA) et imagées avec un microscope confocal Zeiss LSM880 (Zeiss, Jena, Allemagne).

Les paupières des souris P1, P3, P4 et P8 K14-Cre;Ift88fl/fl;mT/mG (cKO) et K14-Cre;Ift88fl/+;mT/mG (Ctrl) ont été disséquées, fixées dans du PFA à 4 % dans du PBS pendant 1 h et lavé dans du PBS. Au cours de la fixation, la plupart des tissus conjonctifs et des muscles recouvrant la plaque tarsienne ont été retirés manuellement. Les MG ont été montées dans du glycérol à 90 % et imagées avec un microscope confocal LSM880 (pour les échantillons à P1) ou un microscope à deux photons LSM710/NLO (pour les échantillons à P3, P4 et P8). Des sections optiques en série ont été acquises par étapes de 1 ou 2 µm à travers l'ensemble de la MG. Le volume de MG a été quantifié après reconstruction 3D des z-stacks avec Imaris (Bitplane, South Windsor, CT), et le nombre d'acini par MG a été compté manuellement.

Les paupières des souris P6, P8 et P21 ont été disséquées, fixées dans du PFA à 4 % dans du PBS pendant 1 h et lavées dans du PBS. Lors de la fixation, la plupart des tissus conjonctifs et des muscles recouvrant la plaque tarsienne ont été retirés. Les MG ont été colorées pendant 1 h dans une solution ORO (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) à température ambiante (RT), rincées avec H2O distillée, montées dans du glycérol à 90 % et imagées avec un microscope à dissection Olympus MVX10 (Olympus). La taille de la MG a été déterminée en faisant la moyenne de la surface MG des MG individuelles mesurées avec Fiji70.

Les paupières des souris P3, P6, P8, P12 et P25 Arl13b-mCherry;Centrin2-GFP ont été disséquées et fixées pendant 1 h dans 4 % PFA/1 % Triton X-100 (Mallinckrodt Pharmaceuticals, Staines-upon-Thames, Royaume-Uni) dans PBS. Les paupières ont ensuite été traitées pour la coloration K14 sur des MG entières ou intégrées dans l'OCT. Pour les MG entières, avant la coloration, la plupart des tissus conjonctifs et des muscles recouvrant la plaque tarsienne ont été retirés et les plaques tarsiennes ont été perméabilisées pendant 1 h avec 2 % de BSA/1 % de Triton X-100/PBS à température ambiante. Les MG pour les échantillons de montage entiers et les cryosections ont été colorées avec un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre K14 (1: 1000, 905301, BioLegend, San Diego, CA). Les noyaux ont été contre-colorés avec du DAPI sur des cryosections. Les montures entières MG (P3, P6 et P8) et les cryosections (P12 et P25) ont été imagées avec un microscope confocal Zeiss LSM880. Des coupes optiques en série ont été acquises par pas de 1 µm. Après la reconstruction 3D des z-stacks avec Imaris, les MG ont été décrites à l'aide de l'outil Surfaces, et les cils primaires et les corps basaux ont été comptés dans les MG à l'aide de l'outil Spots. Les centrioles marqués Centrin2-GFP ont été considérés comme un seul corps basal lorsqu'ils étaient distants de moins de 2 µm. Étant donné que le nombre de corps basaux était similaire au nombre de noyaux, comme indiqué dans le supplément Fig. 4, le nombre de cellules ciliées dans les MG a été déterminé en normalisant le nombre de cils primaires au nombre de corps basaux et exprimé en pourcentage.

Les souris à P4, P6 et P21 ont reçu une seule injection intrapéritonéale de 50 mg/kg d'EdU (EdU-Click 594, baseclick, Allemagne) et ont été sacrifiées après 6 h, comme décrit ailleurs71. Les paupières ont été disséquées et congelées en OCT. Des cryosections de vingt microns ont été traitées conformément aux instructions du fabricant (EdU-Click 594, baseclick, Allemagne). En bref, les coupes ont été fixées pendant 15 min avec du PFA à 4 % dans du PBS, perméabilisées pendant 20 min avec du Triton X-100 à 0,5 % dans du PBS puis colorées pendant 30 min avec le cocktail réactionnel dans l'obscurité à TA. Les MG ont été localisées à l'aide du rapporteur fluorescent mT/mG ou colorées à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin anti-K14 (1:1000, 905301, BioLegend). Les noyaux ont été contre-colorés avec du DAPI. Les coupes ont été imagées avec un microscope Leica DMI6000 équipé d'un disque rotatif confocal Yokogawa ou d'un microscope confocal Zeiss LSM880. Pour chaque cryosection, des coupes optiques en série ont été acquises par pas de 2,45 μm. Pour chaque souris, des cryosections en série ont été traitées pour acquérir l'intégralité des MG. Après la reconstruction 3D des z-stacks avec Imaris, les MG ont été décrites à l'aide de l'outil Surfaces, et les noyaux EdU-positifs et les noyaux DAPI-positifs ont été comptés dans chaque MG à l'aide de l'outil Spots. La quantification a été réalisée sur les MG situées au centre de la paupière supérieure. Le taux de prolifération cellulaire par MG a été déterminé en normalisant le nombre de noyaux EdU-positifs au nombre de noyaux DAPI-positifs. La quantification des noyaux EdU-positif et DAPI-positif a également été réalisée, en séparant la partie proximale (du bord de la paupière au milieu de la glande) et la partie distale (du milieu de la glande à la pointe) des MG.

Les paupières des souris P21 ont été disséquées, fixées pendant la nuit avec du PFA à 4 % dans du PBS et incluses dans de la paraffine. Les sections ont été traitées pour la coloration immunofluorescente d'apoptose en utilisant le kit de détection de mort cellulaire in situ, TMR Red (Roche Applied Science, Mannheim, Allemagne), comme décrit dans72. Les coupes ont été perméabilisées pendant 15 min avec 10 µg/mL de protéinase K dans 10 mmol/L de Tris/HCl (pH 7,4) à température ambiante, puis colorées pendant 1 h avec le mélange réactionnel à 37 °C dans l'obscurité. Les noyaux ont été contre-colorés avec du DAPI. Les sections ont été imagées avec un microscope confocal Zeiss LSM880. Les noyaux TUNEL-positifs et DAPI-positifs ont été comptés sur 3 coupes en série, à 20 µm l'un de l'autre. Le taux de mortalité cellulaire par MG a été déterminé en normalisant le nombre de noyaux TUNEL-positifs au nombre de noyaux DAPI-positifs.

Les plaques tarsiennes ont été isolées par dissection et ont été immédiatement immergées dans du RNAlater (AM7020, ThermoFisher, Waltham, MA) et stockées à -20 ° C pendant 1 mois maximum. L'ARN a été extrait des paupières à l'aide du mini kit RNeasy (Qiagen, Germantown, MD) conformément aux instructions du fabricant. Un microgramme d'ARN a été soumis à une transcription inverse à l'aide du kit de transcriptase inverse SuperScript III (18080051, ThermoFisher) conformément aux instructions du fabricant. La PCR quantitative a été réalisée à l'aide d'un mélange maître PCR vert SYBR (4309155, ThermoFisher) dans 20 µL en double sur une machine CFX96 qPCR (BioRad, Hercules, CA), utilisant un cycle en 2 étapes avec une température de recuit de 60 ° C. La quantification a été réalisée en utilisant la méthode 2-ΔΔcT73 avec la moyenne géométrique de Gapdh et Polr2a utilisée comme normalisation74. Les séquences d'amorces sont répertoriées dans le tableau 1.

Les lipides meibomiens ont été extraits de plaques de tarse de souris excisées chirurgicalement (4 de chaque souris) à 4 ° C en utilisant trois extractions séquentielles avec un mélange de solvants chloroforme: méthanol (3: 1, vol: vol). Les extraits (3 x 1 mL) ont été regroupés et le solvant a été évaporé sous un courant d'azote comprimé à 37 °C. Le résidu huileux a été redissous dans 1 ml d'isopropanol de qualité LC / MS et stocké dans un flacon auto-injecteur HPLC de 2 ml rincé à l'azote et scellé par sertissage à -80 ° C avant les analyses.

Les analyses par chromatographie liquide en phase inverse à gradient et isocratique/spectrométrie de masse à ionisation chimique (LC/MS) à haute résolution et à temps de vol à pression atmosphérique ont été effectuées à l'aide, en conséquence, d'un Acquity UPLC C18 (1 mm × 100 mm ; particules de 1,7 µm taille) et une colonne Acquity UPLC C8 (2 mm × 100 mm ; taille de particule 1,7 µm) (toutes deux de Waters Corp., Milford, MA, USA) comme décrit en détail dans nos publications antérieures pour le meibum de souris et humain75,76,77 . Entre 0,5 et 1,0 µL de la solution d'échantillon ont été injectés par expérience. Un système LC binaire ultra-haute performance Waters Acquity M-Class (UPLC, Waters Corp.) a fonctionné à un débit de 20 µL/min. Les analytes ont été élués en utilisant des mélanges de solvants isocratiques acétonitrile/isopropanol avec 5 % de formiate d'ammonium 10 mM comme additif. Les analytes ont été détectés à l'aide d'un spectromètre de masse Synapt G2-Si QToF haute résolution [équipé d'une interface ZSpray, d'une source d'ions IonSabre-II à ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et d'une unité LockSpray (tous de Waters Corp.)]. Toutes les expériences ont été menées en mode ions positifs. La plupart des lipides ont été détectés sous forme d'adduits (M + H)+ et (M + H – H2O)+. Les principaux analytes lipidiques ont été identifiés à l'aide de la routine EleComp du progiciel MassLynx v.4.1 (Waters Corp.). Cependant, certains des composés, par exemple les triacylglycérols et les esters de cholestérol, ont subi une fragmentation spontanée à la source produisant des espèces (M + H - acide gras) + et ont en outre été caractérisés comme (M + Na) +, (M + K) + , et (M + NH4)+ adduits. Enfin, les temps de rétention chromatographiques et les spectres de masse des principaux analytes ont été comparés à ceux des étalons lipidiques authentiques (le cas échéant). Les résultats d'une analyse détaillée du lipidome MG de souris mutantes doivent être rapportés séparément.

La production totale de lipides par les MG a été estimée sur la base des chromatogrammes ioniques totaux de leurs extraits lipidiques enregistrés dans des expériences isocratiques LC/MS APCI comme décrit récemment77. L'analyse impartiale et non ciblée des données lipidomiques a été réalisée à l'aide des progiciels Progenesis QI et EZinfo (Waters Corp.). L'approche d'analyse en composantes principales (ACP) a été utilisée pour évaluer les différences entre les échantillons de contrôle et de cKO.

Pour chaque expérience, les compagnons de portée témoins et mutants cKO d'au moins 2 portées différentes ont été comparés. Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± ET. Le test de Mann Whitney a été utilisé pour comparer le mutant cKO aux souris témoins, le test de rang signé de Wilcoxon a été utilisé pour comparer différentes régions des mêmes glandes (acini vs conduit et moitiés proximales vs distales des MG ou canaux centraux), et le Le test de Kruskal-Wallis avec le test post-hoc de Dunn a été utilisé pour comparer le pourcentage de cellules ciliées par glande tout au long du développement de MG et le volume de MG tout au long du développement de MG. Des tests statistiques ont été effectués avec les calculateurs statistiques Web en ligne https://astatsa.com/ ou RStudio78. Une valeur de PA < 0,05 était considérée comme significative.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données sources pour les figures principales et supplémentaires sont fournies en tant que données supplémentaires 1. Des données supplémentaires qui appuient les conclusions de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant (CI) sur demande raisonnable.

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Les auteurs remercient Qing Liu pour son implication au cours des premières étapes de ce projet, Hoku West-Foyle du Microscope Facility de Johns Hopkins pour son assistance technique, le centre d'histologie de référence de l'Université Johns Hopkins pour les sections de paraffine, et les membres de le groupe Wilmer Cornea pour leurs contributions et discussions utiles. Ce travail a été soutenu par des subventions du National Eye Institute, National Institute of Health (EY030661 à CI, EY024324 et EY027349 à IB), une subvention de base au Wilmer Eye Institute (EY001765), une subvention du Bureau du directeur, NIH ( S10RR024550 à SC Kuo, Microscopy Facility de l'Université Johns Hopkins ); par une subvention de la famille Eisinger; par un Wilmer Eye Institute Seed Fund à CI ; et par une subvention sans restriction du RPB au Wilmer Eye Institute.

Céline Portal

Present address: Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, 17 rue Moreau, F-75012, Paris, France

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Yvonne Lin, Varuni Rastogi.

Département d'ophtalmologie, Wilmer Eye Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, 21231, États-Unis

Céline Portal, Yvonne Lin, Varuni Rastogi, Samuel Chi-Hung Yiu, James W. Foster & Carlo Iomini

Département de pathobiologie moléculaire et comparée, École de médecine de l'Université Johns Hopkins, Baltimore, MD, 21205, États-Unis

Cornelia Peterson

Département d'ophtalmologie, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, 75390, États-Unis

Amber Wilkerson & Igor A. Butovitch

École supérieure des sciences biomédicales, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, 75390, États-Unis

Igor A. Butovitch

Département de biologie cellulaire, École de médecine de l'Université Johns Hopkins, Baltimore, MD, 21231, États-Unis

Carlo Iomini

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C.Portal., IB et CI ont conçu et conçu l'étude ; C.Portal, YL, VR, JF, AW, IB et CI ont réalisé des expériences et analysé et visualisé des données ; C.Peterson et SY ont fourni des conseils conceptuels et expérimentaux ; IB et CI ont acquis un financement ; C.Portal, IB et CI ont rédigé l'article avec des modifications et des commentaires de tous les auteurs. CI a supervisé et administré le projet.

Correspondance à Carlo Iomini.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Duarte Barral et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Tiago Dantas et Eve Rogers. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Portal, C., Lin, Y., Rastogi, V. et al. Les cils primaires contrôlent la structuration cellulaire des glandes de Meibomius au cours de la morphogenèse, mais pas la composition lipidique. Commun Biol 6, 282 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04632-5

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Reçu : 04 août 2022

Accepté : 27 février 2023

Publié: 17 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04632-5

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