Identification de la lignocellulose fongique | Flacon d'échantillonneur automatique Foshan Co., Ltd

Communications Biology volume 5, Article number: 1254 (2022) Citer cet article

1857 accès

1 Citations

5 Altmétrique

Détails des métriques

Une correction de l'auteur à cet article a été publiée le 01 décembre 2022

Cet article a été mis à jour

Le profilage des protéines basé sur l'activité (ABPP) est devenu une méthode biochimique polyvalente pour étudier l'activité enzymatique dans diverses conditions physiologiques, avec des applications jusqu'à présent principalement en biomédecine. Ici, nous montrons le potentiel de l'ABPP dans la découverte de biocatalyseurs du champignon de la pourriture blanche thermophile et dégradant la lignocellulose Phanerochaete chrysosporium. En utilisant un crible fonctionnel basé sur ABPP, y compris un profilage direct des enzymes liées au substrat de bois, nous identifions les estérases glucidiques dégradant la lignocellulose (CE1 et CE15) et les glycosides hydrolases (GH3, GH5, GH16, GH17, GH18, GH25, GH30, GH74 et GH79) enzymes spécifiquement actives en présence du substrat. Comme l'expression des enzymes fongiques reste difficile, notre approche médiée par ABPP représente une procédure de présélection pour concentrer les efforts expérimentaux sur les biocatalyseurs les plus prometteurs. De plus, cette approche peut également permettre l'annotation fonctionnelle de domaines de fonctions inconnues (DUF). Le criblage de biocatalyseurs à base d'ABPP décrit ici peut ainsi permettre l'identification d'enzymes actives dans un processus d'intérêt et l'élucidation de nouveaux biocatalyseurs qui ne partagent aucune similarité de séquence avec leurs homologues connus.

Le profilage des protéines basé sur l'activité (ABPP) est devenu une méthodologie de protéomique chimique largement utilisée pour la recherche fondamentale en biologie1,2,3,4,5. Dans l'ABPP, les sondes basées sur l'activité (ABP) consistant en une "ogive" réactive, une fraction inhibitrice d'enzyme qui forme une liaison covalente irréversible avec leur(s) protéine(s) cible(s) et assure souvent une haute spécificité de classe enzymatique, un lieur et un rapporteur tag sont utilisés pour étiqueter, identifier et signaler les enzymes actives dans des conditions physiologiques natives. En tant que rapporteurs, la biotine, les fluorophores ou les marqueurs dits rapporteurs en deux étapes tels que les fragments alcyne ou azide sont fréquemment utilisés6. Au cours des dernières années, des efforts intensifs ont été entrepris, à la fois pour développer de nouveaux SPA ciblant de nouvelles familles d'enzymes et pour établir leur utilisation, entre autres, dans la découverte de médicaments (découverte de cibles et de pistes, engagement de cible)7,8,9,10,11 ,12, biologie végétale13 ou microbiologie14,15,16,17,18.

Une application ABPP alternative en évolution est son utilisation dans le criblage de biocatalyseurs et, par conséquent, la biotechnologie (nous définissons ici les biocatalyseurs comme des enzymes à usage industriel potentiel)19,20,21. Par exemple, l'ABPP peut être utilisé pour découvrir des biocatalyseurs microbiens capables de transformer une biomasse polymère complexe comme la lignocellulose, des entités très recherchées dans le contexte de l'énergie durable et des processus de bioéconomie circulaire22,23,24. Contrairement aux approches de criblage de biocatalyseurs basées sur l'homologie de séquence (par exemple, l'analyse des données génomiques25), l'ABPP exploite la sélectivité enzymatique établie des ABP pour identifier de nouveaux biocatalyseurs avec des préférences de substrat souhaitables, en principe, sans qu'il soit nécessaire d'attribuer des homologies de séquence (Fig. 1a)26,27. Dans ce que l'on appelle "l'enrichissement à base d'ABP", seules les enzymes actives et donc capables de réagir avec un ABP sont sélectionnées pour une identification ultérieure par séquençage basé sur LC-MS/MS, ce qui limite l'identification des protéines en fonction de la cible spécificité des SPA utilisés. En conséquence, l'expression et la purification biochimiques souvent fastidieuses des protéines sont limitées aux seuls biocatalyseurs présélectionnés par l'ABPP, ce qui représente une énorme réduction du travail par rapport aux méthodes de criblage qui reposent sur des expressions systématiques des protéines. Ceci est particulièrement pertinent dans les campagnes de criblage de biocatalyseurs fongiques, qui sont souvent entravées par l'expression et la purification difficiles de protéines hétérologues, par exemple, en raison de schémas de glycosylation complexes dans le cas d'enzymes dégradant le bois28,29. Malgré ces avancées intrinsèques, la découverte de biocatalyseurs basés sur l'ABPP a été appliquée principalement dans des études de preuve de concept utilisant des cultures pures, souvent d'organismes modèles, et, plus important encore, de milieux de culture standard pour leur croissance30,31,32,33,34 .

a Aperçu du flux de travail ABPP pour l'identification des enzymes dégradant la lignocellulose à partir de cultures en suspension de P. chrysosporium cultivées sur un milieu minimal avec des copeaux de bois de hêtre. Un ABP est ajouté soit au filtrat d'une culture de bois de hêtre P. chrysosporium (appelé surnageant) ou à la fraction liée au substrat solubilisé par le dodécylmaltoside (appelée SBF) après lyophilisation. Le prétraitement est suivi d'un flux de travail ABPP standard, consistant en une fixation par clic d'un résidu de biotine pour l'enrichissement par affinité (dans le cas d'un ABP en deux étapes), l'enrichissement par affinité des enzymes marquées, la digestion de la trypsine et l'identification ultérieure des protéines à base de MS . L'utilisation d'ABP spécifiques à une classe d'enzymes entraîne donc une identification ciblée de biocatalyseurs actifs et donc un criblage d'enzymes fonctionnelles et permet également l'identification indépendante de la séquence de nouveaux biocatalyseurs sans similitude avec des homologues connus. L'image d'entrée montre comment P. chrysosporium se lie à la surface du bois massif lors de la dégradation de la lignocellulose. b Structures chimiques des SPA et des concurrents utilisés dans cette étude. Il s'agit de FP-alcyne (la sérine hydrolase "classique" ABP) et JJB111 (GH ABP), ainsi que du concurrent FP paraoxon et des concurrents JJB111 KY371 et KY358. c La lignocellulose est un polymère complexe et récalcitrant constitué de cellulose, de xylane (hémicellulose) et de lignine. Sa dégradation nécessite l'action synergique de différentes enzymes.

Dans la présente étude, nous avons cherché à surmonter cette limitation et à mettre en valeur le potentiel de la technologie de criblage de biocatalyseurs ABPP dans un cadre expérimental plus complexe et pertinent sur le plan biotechnologique. En conséquence, nous avons appliqué l'ABPP à une culture en suspension constituée du champignon de la pourriture blanche Phanerochaete chrysosporium cultivé sur un milieu minimal et des copeaux de bois de hêtre massif comme seule source de carbone et d'énergie, similaire à des travaux récents concernant une approche ABPP fonctionnelle dans un ensemble de basidiomycètes35. La lignocellulose est le principal composant du bois mort et représente un complexe polymère hautement récalcitrant constitué de cellulose, de xylane (hémicellulose) et de lignine (Fig. 1b)36. Des méthodes durables pour sa dégradation efficace sont recherchées de toute urgence pour établir une conversion biotechnologique de la biomasse non alimentaire en une matière première industrielle37,38,39. Cela nécessite cependant une action synergique de différents biocatalyseurs tels que les glycoside hydrolases (GH), les carbohydrate estérases (CE), les polysaccharide lyases et d'autres enzymes appartenant à la classe des enzymes auxiliaires (activités auxiliaires, AA), telles que les polysaccharides monooxygénases lytiques ( LPMO)40,41,42. P. chrysosporium est un dégradeur efficace du bois mort et de la lignocellulose en particulier43. Son génome abrite un large répertoire d'enzymes lignocellulolytiques composé de plus de 69 familles différentes d'enzymes glucidiques actives (CAZyme), dont un total de 166 GH, 14 CE et 57 glycosyltransférases (GT) (comme répertorié dans la base de données CAZY (www. cazy.org44) 45. Cette énorme complexité fait de cet organisme une ressource prometteuse pour la découverte de biocatalyseurs. Cependant, en raison de sa taille, le sécrétome de P. chrysosporium ne peut pas être exploré en exprimant systématiquement toutes les enzymes. Au lieu de cela, une méthodologie pour présélectionner uniquement ceux des enzymes directement impliquées dans la dégradation de la lignocellulose sont nécessaires.A noter que l'expression de ces biocatalyseurs est régulée par la présence du substrat lignocellulosique, exigeant des essais de présélection en présence de copeaux de bois insolubles et donc des conditions très hétérogènes46.

Dans le but d'identifier rapidement des enzymes prometteuses de dégradation de la lignocellulose à partir de ce système complexe via une présélection basée sur ABPP, nous avons appliqué FP-alcyne, une sérine hydrolase (SH) bien établie ciblant ABP47,48, et les deux GH- ciblant les ABP KY371 (N-alcynyl-cyclophellitol aziridine) et JJB111 (l'équivalent biotine de KY371)49,50, sur des cultures de P. chrysosporium cultivées dans un milieu minimal avec des copeaux de bois de hêtre comme seule source de carbone et d'énergie (Fig. 1c). Le FP-alcyne est un dérivé marqué par un rapporteur des inhibiteurs bien connus de la fluorophosphonate sérine hydrolase et se lie donc spécifiquement à tous les SH, c'est-à-dire les sérine protéases et les SH métaboliques, sans spécificité au sein de cette classe d'enzymes51. En revanche, JJB111 est un analogue aziridine du cyclophelitol, un produit naturel inhibiteur des GH. JJB111 imite structurellement les fragments β-glucopyranosides et, par conséquent, réagit préférentiellement avec les β-glucosidases de rétention49 ; en outre, il marque également une variété de β-exoglycosidases52,53. Dans la dégradation de l'hémicellulose, les acétyl-xylane estérases, parmi lesquelles des membres de la famille SH, clivent comme l'une des premières étapes de la voie de dégradation globale des groupes acétyle du squelette glucidique/polysaccharidique54. Les GH, à leur tour, sont responsables de l'hydrolyse de la cellulose, de la pectine et du xylane. En plus des enzymes solubles extracellulaires trouvées dans le surnageant de culture, nous avons également appliqué notre approche ABPP aux enzymes liées au substrat isolées des copeaux de bois. Nos résultats démontrent ainsi que l'ABPP permet une identification ciblée directe et techniquement simple de biocatalyseurs actifs, y compris des enzymes avec des séquences de gènes précédemment non annotées (composées de domaines de fonction inconnue (DUF)), directement à partir de cultures fongiques/microbiennes cultivées sur des substrats lignocellulosiques complexes.

Des études antérieures sur l'identification des enzymes dégradant la lignocellulose de P. chrysosporium ont été réalisées via des analyses « classiques » du protéome complet des surnageants de culture55. Pour démontrer le potentiel de l'ABPP dans l'identification rapide des enzymes lignocellulolytiques, nous avons cultivé des cultures de P. chrysosporium (DSM 1566) pendant 5 jours à 37 ° C dans un milieu minimal contenant des copeaux de bois de hêtre (Fig. 2a). La formation d'hyphes fongiques ainsi que la dégradation macroscopique des substrats de croissance dans une culture liquide immergée ont confirmé une croissance efficace des cellules fongiques dans ces conditions. Le surnageant de culture a été filtré, lyophilisé, redissous dans du tampon, puis marqué avec 2 µM des deux ABP FP-alcyne ou JJB111, respectivement. Pour les expériences ABPP compétitives, un prétraitement avec du paraoxon 50 µM dans le cas du FP-alcyne ou du KY358 20 µM dans le cas du marquage JJB111 a été utilisé. Après enrichissement par affinité, l'identification de la cible a été réalisée par digestion trypsique sur billes et analyse LC-MS/MS. Chaque protéine identifiée a été quantifiée à l'aide d'une quantification relative basée sur l'intensité spectrale ; comme référence, des échantillons traités au DMSO ou à un concurrent correspondant ont été utilisés. Seuls les groupes de protéines avec un changement de facteur log2 (FC) ≥ 2 ont été conservés pour une analyse plus approfondie dans toutes les expériences de marquage basées sur l'ABPP.

un Workflow de l'analyse. Des cultures en suspension de P. chrysosporium ont été cultivées pendant 5 jours sur un milieu minimal additionné de copeaux de bois de hêtre. Le matériau solide a été séparé par filtration, le filtrat lyophilisé et le résidu a été soumis à ABPP avec les sondes correspondantes. b ABPP de SH sans (panneau de gauche, un changement de log2 fois ≥2 par rapport au DMSO est indiqué) ou après prétraitement avec 50 µM de paraoxon (expérience de compétition, panneau de droite) avec 2 µM de FP-alcyne après chimie du clic (n = 4 biologiquement échantillons indépendants). Les points verts indiquent les SH. c ABPP de GH sans (panneau de gauche, un changement log2 fois ≥ 2 par rapport au DMSO est indiqué) ou après prétraitement avec 20 µM de KY358 (expérience de compétition, panneau de droite) avec 2 µM de JJB111 (n = 4 échantillons biologiquement indépendants). Les points bleus indiquent les GH, tandis que le point rouge représente la protéine DUF avec quatre domaines de fonction inconnue Phchr2 | 3002168 avec une activité potentielle de GH.

Pour le traitement FP-alcyne, cette approche a conduit à l'identification de deux SH avec la protéine ID Phchr2 | 126075 du Joint Genome Institute (JGI) (predicted carbohydrate esterase family 1 (CE1) with a CBM1 domain, MW of 35.6 kDa) and Phchr2 |2912243 (prédit la famille 15 des estérases glucidiques (CE15), MW de 44,3 kDa) (tableau 1 et protéines marquées en vert sur la figure 2b ; voir les données supplémentaires 1 pour la liste complète des protéines identifiées). Phchr2|126075 présente une similarité de séquence élevée avec une acétyl-xylane estérase de P. chrysosporium étudiée précédemment, et son marquage a été concurrencé par un prétraitement avec l'inhibiteur d'estérase paraoxon56. En revanche, l'analyse de la séquence Phchr2|2912243 suggère que cette enzyme est un membre de la famille CE15 et donc probablement une 4-O-méthyl-glucuronoyl méthylestérase.

L'application de JJB111 a permis l'identification de douze GH (tableau 1 et protéines marquées en bleu sur la figure 2c; voir les données supplémentaires 2 pour la liste complète des protéines identifiées). Le prétraitement avec KY358 a participé au marquage de six d'entre eux appartenant aux familles GH3, GH5, GH16 et GH74. Fait intéressant, contrairement aux GH identifiées connues pour être impliquées dans la dégradation de la cellulose (GH3 et GH5), du xylane (GH3) ou du xyloglucane (GH74), notre analyse a également révélé un enrichissement significatif (changement de log2 : 5,39) de la protéine Phchr2| 3002168, qui est annotée en tant que glutaminase dans la base de données du génome JGI MycoCosm45 (tableau 1 et protéine marquée en rouge sur la figure 2c). Le marquage de Phchr2 | 3002168 a été concurrencé par pré-incubation avec KY358 et l'analyse de domaine par PFAM57 et InterProScan58 de sa séquence protéique a révélé la présence de quatre domaines DUF (DUF4964, DUF5127, DUF4965 et DUF1793) ainsi qu'un signal de sécrétion (Fig. .1a). L'analyse d'homologie structurale par HHpred59 a cependant prédit une β-glucosidase de la famille GH116 de Thermoanaerobacterium xylolyticum (code pdb 5O0S60, valeur e de 7.2e−34, 14% d'identité de séquence) et une xylosidase GH52 de Geobacillus thermoglucosidasius (code pdb 4C1O61, e -valeur de 7.1e-31, 10 % d'identité de séquence) en tant que protéines homologues (Fig. 1b supplémentaire). De plus, une analyse avec InterProScan a suggéré la présence d'un domaine de glycosidase à six épingles à cheveux qui est caractéristique des membres de la famille GH15, GH65, GH92 et GH116. La structure 3D prédite par Alphafold62 de Phchr2 | 3002168 a montré un chevauchement de structure secondaire élevé avec la GH52 β-xylosidase 4C1P ((α / α) 6 baril) de 70% même malgré sa faible similarité de séquence de 12% (Fig. 1c supplémentaire, d). Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que Phchr2 | 3002168 pourrait être un GH d'une famille de GH non encore caractérisée.

Notre étude démontre jusqu'à présent que l'ABPP peut être utilisée pour détecter les enzymes SH et GH actives dans le surnageant de culture fongique. Cependant, la dégradation de la lignocellulose par P. chrysosporium implique une variété d'enzymes, qui se fixent partiellement au substrat à base de glucides respectif63. Naturellement, ces enzymes liées au substrat présentent un intérêt particulier pour les applications biotechnologiques car elles sont directement impliquées dans la dégradation de la lignocellulose. Lors de la préparation de l'échantillon, le substrat de lignocellulose a été filtré pour obtenir un matériau de départ homogène pour le marquage. En effet, une telle étape de rejet est fréquemment effectuée dans diverses approches de criblage fonctionnel et une approche techniquement simple pour l'analyse ciblée des biocatalyseurs attachés au substrat serait hautement souhaitable.

Pour déterminer si de telles enzymes peuvent être détectées par une approche ABPP ciblée sur le substrat, nous avons à nouveau cultivé P. chrysosporium en présence de copeaux de bois de hêtre. Après élimination du surnageant de culture et des cellules fongiques libres, les enzymes liées au substrat actif ont été détachées avec 0, 1% (p / v) du détergent dodécyl-β-d-maltoside compatible MS. Les protéines détachées ont ensuite été lyophilisées et le résidu a été résolu dans un tampon, suivi de l'ajout des ABP et du flux de travail standard de préparation et d'analyse des échantillons MS en aval (Fig. 3a).

un flux de travail de l'analyse SBF. Des cultures en suspension de P. chrysosporium ont été cultivées pendant 5 jours sur un milieu minimal additionné de copeaux de bois de hêtre. Les copeaux de bois de hêtre ont été isolés et les protéines liées au substrat ont été isolées via un traitement au dodécylmaltoside à 0,1 % (p/v). La solution de protéine obtenue a été lyophilisée et le résidu a été soumis à ABPP avec les sondes correspondantes. b ABPP de SH sans (panneau de gauche, un changement log2 fois ≥2 par rapport au DMSO est indiqué) ou après prétraitement avec 50 µM de paraoxon (expérience de compétition, panneau de droite) et 2 µM de FP-alcyne après chimie du clic (n = 4 biologiquement indépendants échantillons). Les points verts indiquent les CE annotés. c ABPP de GH sans (panneau de gauche, un changement log2 fois ≥2 par rapport au DMSO est indiqué) ou après prétraitement avec 20 µM de KY371 (expérience de compétition, panneau de droite) avec 2 µM de JJB111 (n = 3 échantillons biologiquement indépendants). Les points bleus indiquent les GH annotés.

L'emploi de FP-alcyne a conduit à l'identification de 53 protéines liées au substrat, dont dix-sept étaient enrichies d'un changement de facteur log2 ≥2. Leur annotation fonctionnelle a révélé la présence de quatre CE des familles CE1 et CE15 (tableau 2 et protéines marquées en vert sur la figure 3b ; voir les données supplémentaires 3 pour la liste complète des protéines identifiées). Notamment, seul le marquage des protéines de la famille CE1 Phchr2|2983171 et Phchr2|126075 a été inhibé avec succès par pré-incubation avec paraoxon. Ces protéines présentent un intérêt biotechnologique potentiel en raison de leur potentiel prédit en tant qu'acétyl ou féruloyl estérases. De plus, cinq sérine carboxypeptidases (S10) et quatre carboxylestérases ont été identifiées qui pourraient jouer un rôle dans l'activation enzymatique lors de la dégradation de la lignocellulose, par exemple les cellobiose déshydrogénases64. Le marquage de trois des carboxylestérases enrichies était en outre concurrencé par le paraoxon.

L'analyse de l'approche ABPP avec JJB111 a révélé sept GH, qui étaient enrichies d'un log2-FC ≥ 2 (protéines marquées en bleu sur la Fig. 3c, voir les données supplémentaires 4 pour la liste complète des protéines identifiées). Parmi ceux-ci, quatre ont été mis en compétition par pré-incubation avec KY371. Les protéines Phchr2|3002242, Phchr2|2945552 et Phchr2|3003144 sont des membres prédits de la famille GH3, tandis que la protéine Phchr2|2915237 appartient à la sous-famille GH5 9 ; les deux familles de GH sont connues pour catalyser la dégradation de la cellulose ou du xylane. En revanche, le marquage des protéines Phchr2|3004009 (GH17), Phchr2|2895579 (GH5) et Phchr2|3038646 (GH25) n'a pas été concurrencé par KY371. Il convient de noter que trois des protéines identifiées (c'est-à-dire Phchr2 | 291537, Phchr2 | 126075 et Phchr2 | 2912243) ont également été identifiées dans l'analyse ABPP du surnageant.

Dans l'ensemble, ces expériences démontrent que l'ABPP n'est pas seulement une approche ciblée techniquement simple pour identifier des biocatalyseurs de lignocellulose prometteurs, mais permet également de concentrer l'analyse sur des sous-fractions enzymatiques actives pertinentes, par exemple celles liées à un substrat insoluble.

Jusqu'à présent, notre approche ABPP a identifié plusieurs biocatalyseurs potentiels de dégradation de la lignocellulose. Leur annotation fonctionnelle ultérieure a été réalisée par analyse d'homologie de séquence. L'approche ABPP peut cependant, en principe, également permettre l'identification d'enzymes d'une nouvelle famille d'enzymes, car l'identification d'enzymes est basée sur la réactivité enzymatique de l'ABP et non sur l'homologie de séquence. Pour démontrer que notre approche ABPP a effectivement abouti à l'identification de biocatalyseurs dégradant la lignocellulose, nous avons sélectionné trois des enzymes identifiées par ABPP, Phchr2 | 126075, Phchr2 | 2915237 et Phchr2 | 3002168, pour une expression plus poussée et une caractérisation biochimique ultérieure (Fig. . 2).

L'acétyl-xylane estérase putative Phchr2 | 126075 (338 acides aminés; 35, 5 kDa) a été identifiée avec FP-alcyne dans le surnageant de P. chrysosporium (enrichissement log2 de 7, 18) et dans le SBF (enrichissement log 2 de 2, 37). Phchr2|126075 appartient à la famille CE1 et contient un motif fongique CBM1 pour la liaison aux glucides ainsi qu'un signal de sécrétion. Le domaine estérase englobe les résidus 80-288. Il convient de noter qu'une acétyl-xylane estérase homologue (Phchr2|129015, valeur e de 0,0, 89 % d'identité de séquence) de la même espèce a été précédemment caractérisée56. Pour la caractérisation, phchr2|126075 a été cloné dans le vecteur pKLAC2 et surexprimé dans Kluyveromyces lactis. Comme prévu d'après l'homologie de séquence, Phchr2 | 126075 a présenté une activité estérase contre le pNP-acétate et des analyses ultérieures ont révélé l'activité enzymatique la plus élevée à un pH de 8 et 40 ° C, respectivement (Fig. 3 supplémentaire). D'autres caractérisations cinétiques ont ensuite révélé un Vmax de 41, 7 U mg -1 de protéine et un KM de 0, 67 mM pour l'hydrolyse du pNP-acétate (Fig. 4a).

a Phchr2|126075 a été produit de manière hétérologue dans K. lactis et l'activité a été confirmée contre le pNP-acétate en suivant la libération de pNP avec un Vmax de 41,7 U mg-1 de protéine et un KM de 0,67 mM. b Spécificité de substrat de Phchr2|2915237 et WP_074995790 de S. misionensis. L'activité avec différents substrats à base de p-nitrophénol a été déterminée en mesurant la libération de pNP. L'activité sur les polysaccharides complexes a été déterminée via le test DNSA qui quantifie la formation d'extrémités réductrices lors du clivage du polysaccharide. Phchr2|2915237 a montré les activités les plus élevées avec pNP-Glc, pNP-Xyl, lichenan et xylane de bois de hêtre, tandis que WP_074995790, un proche homologue de Phchr2|3002168 a montré une activité uniquement avec pNP-Gal comme substrat avec une activité spécifique de 0,85 U protéine mg−1. c Caractérisation cinétique de Phchr2 | 2915237 en utilisant pNP-Glc, pNP-Xyl, lichenan et xylane de bois de hêtre comme substrats. Toutes les mesures d'activité ont été effectuées en triple (n = 3), les valeurs moyennes sont indiquées et les barres d'erreur indiquent l'écart type (SD).

Phchr2|2915237 (422 acides aminés ; 46,5 kDa) a été identifié et enrichi en JJB111 à la fois dans le surnageant soluble (changement de facteur log2 : 10,71) et dans le SBF (changement de facteur log2 : 4,11). Une analyse avec InterProScan indique la présence d'un domaine cellulase GH5 englobant les résidus 67-330. Phchr2|2915237 contient également un signal de sécrétion extracellulaire mais pas de domaines transmembranaires. Une analyse HHpred59 prédit soit les β-1-3 glucanases65 (valeur e : 9,7e−35 ; 44 % d'identité de séquence :) soit les β-1-4-xyloglucanases66 (valeur e : 8,8e−24, 18 % d'identité de séquence) comme les homologues structuraux les plus proches. De plus, des homologues de Phchr2 | 2915237 sont présents dans différentes espèces fongiques dégradant le bois, telles que Trametes ou Pleurotus, identifiées via BLASTP67. L'homologue caractérisé le plus proche (valeur e : 9e-108, 45 % d'identité de séquence) de Phchr2|2915237 appartient à la levure Candida albicans et joue un rôle dans le métabolisme et la restructuration de la paroi cellulaire68.

Nous avons exprimé de manière hétérologue Phchr2|2915237 dans Aspergillus oryzae et étudié sa spécificité de substrat en utilisant une variété de conjugués chromogéniques p-nitrophénol-sucre ainsi que différents polysaccharides après purification. Phchr2 | 2915237 a montré une activité GH élevée si pNP-Glc et pNP-Xyl étaient utilisés comme substrats, tandis qu'avec pNP-Ara uniquement résiduel et avec pNP-Man, pNP-GlcNAc et pNP-Gal aucune activité hydrolytique n'a été observée (Fig. 4b ). Pour l'hydrolyse de pNP-Glc, un pH et une température optimum de 5 et 60 ° C, respectivement, ont été élucidés (Fig. 3 supplémentaire). Un test d'acide 3, 5-dinitrosalicylique (DNSA) a révélé que Phchr2 | 2915237 était également capable de dégrader à la fois le lichenan et le xylane de bois de hêtre, tandis que la carboxyméthylcellulose (CMC), le galactomannane, le xyloglucane et le curdlan n'étaient pas des substrats appropriés (Fig. 4b) . Des caractérisations cinétiques plus détaillées ont révélé une Vmax de 999 U mg-1 de protéine et un KM de 1,82 mM ainsi qu'une Vmax de 612 U mg-1 de protéine et un KM de 6,98 mM pour le pNP-glucopyranoside et le pNP-xylopyranoside, respectivement. Pour la dégradation des polysaccharides, une valeur Vmax de 107 U mg−1 de protéine avec une valeur KM de 5,5 mg mL−1 ainsi qu'une valeur Vmax de 71,6 U mg−1 de protéine et une valeur KM de 13,8 mg mL−1 ont été déterminées avec lichenane et xylane de bois de hêtre, respectivement, montrant que Phchr2 | 2915237 est également capable de cliver des polymères de sucre naturels plus complexes (Fig. 4c). Pour déterminer si Phchr2|2915237 fonctionne comme une exo- ou endo-glucanase/xylanase, nous avons analysé les produits d'hydrolyse du xylane et du lichénane générés par Phchr2|2915237 par chromatographie en couche mince. Aucun monosaccharide n'a été clivé des chaînes de glucane ; nous avons plutôt observé la formation de produits de dégradation de polysaccharides de longueur inconnue (Fig. 4 supplémentaire). De plus, un test couplé utilisant une glucose ou une xylose déshydrogénase n'a également montré aucune formation de glucose ou de xylose par Phchr2 | 2915237 lors de l'hydrolyse du lichénane et du xylane, respectivement.

Phchr2|3002168 (691 acides aminés ; 74,4 kDa) est une protéine non caractérisée qui a été enrichie en JJB111 ; son marquage JJB111 a été concurrencé par un prétraitement avec KY371. La protéine à quatre domaines Phchr2 | 3002168 est annotée comme une glutaminase, mais notre approche ABPP, ainsi que nos analyses de séquences supplémentaires décrites précédemment ont suggéré une activité GH possible. De plus, une analyse complète du protéome de différentes espèces de champignons, dont P. chrysosporium, a révélé que certaines d'entre elles sécrétaient des protéines homologues à Phchr2|3002168 en présence de lignocellulose69.

Nous avons donc tenté de caractériser cette protéine par des tests biochimiques. Cependant, toutes nos tentatives pour exprimer et purifier Phchr2|3002168 dans E. coli ou A. oryzae ont échoué, soulignant à nouveau les difficultés persistantes d'une expression par rapport à un criblage de biocatalyseurs fonctionnels à base d'ABPP de protéines fongiques. Pour confirmer l'activité de Phchr2|3002168 en tant que GH, nous avons donc recherché des homologues proches dans d'autres organismes et trouvé WP_074995790 de Streptomyces misionensis (valeur e : 0,0 ; 42 % d'identité de séquence) comme candidat prometteur. Veuillez noter que bien que WP_074995790 affiche la même structure à quatre domaines que Phchr2|3002168, l'annotation de la protéine InterPro répertorie uniquement le domaine DUF5127.

Nous avons donc surexprimé WP_074995790 (752 acides aminés ; 80,5 kDa) et, bien que cette enzyme soit difficile à manipuler en raison d'une forte tendance à l'agrégation dans les tests biochimiques, nous avons pu effectuer certains tests enzymatiques avec cette préparation. En raison de son affectation initiale en tant que glutaminase, nous avons commencé par des dosages enzymatiques glutaminase correspondants, mais nous n'avons pas pu détecter de conversion d'un substrat de glutamine. Nous avons ensuite criblé l'activité de la GH en testant le même ensemble de substrats de sucre à base de pNP utilisé auparavant avec Phchr2 | 2915237. De manière satisfaisante, nous avons pu détecter une faible activité β-galactosidase avec une activité spécifique totale de 0,85 U mg-1 de protéine. Cependant, tous les autres substrats pNP testés n'ont pas été hydrolysés (Fig. 4b). Au total, ces essais biochimiques ont donc démontré une activité GH de WP_074995790, bien que la faible activité β-galactosidase globale observée prédise que d'autres structures glucidiques, par exemple des glucides polymères plus complexes, peuvent représenter de meilleurs substrats.

Les champignons de la pourriture blanche présentent d'excellentes capacités de décomposition et sont responsables de la dégradation de la lignine dans la biomasse végétale ; ils ont donc suscité un intérêt considérable en tant que ressources pour identifier les enzymes biotechnologiquement pertinentes56,70. Parmi eux, l'espèce P. chrysosporium semble être particulièrement bien adaptée comme point de départ pour la découverte de biocatalyseurs car ses enzymes sont souvent thermostables en raison de son optimum de température de croissance plutôt élevé de 40 °C71. En conséquence, de multiples études protéomiques ont étudié son sécrétome pendant la croissance sur des substrats de lignocellulose dans le but d'identifier des biocatalyseurs dégradant la lignocellulose, bien que la plupart des biocatalyseurs identifiés n'aient jamais été validés biochimiquement46,55,69,72.

Ici, nous avons décrit une approche alternative pour identifier les enzymes biotechnologiquement pertinentes via ABPP avec des ABP spécifiques à la classe d'enzymes qui permet de concentrer l'analyse sur les seules enzymes actives pertinentes pour le processus biologique global. Cette approche peut être utilisée pour analyser rapidement les biocatalyseurs extracellulaires solubles (surnageants). Plus important encore, cependant, il peut également être utilisé, comme décrit ici pour la première fois, pour identifier des biocatalyseurs liés au substrat, par exemple, dans notre cas, des enzymes attachées à la lignocellulose solide sous la forme de copeaux de bois de hêtre. L'approche ABPP représente une étape de présélection des biocatalyseurs les plus prometteurs. Son application à des enzymes solubles ou à des enzymes directement liées à des substrats permet ainsi un criblage fonctionnel techniquement simple qui, selon nous, pourrait trouver une application plus large dans la découverte ciblée de biocatalyseurs. L'utilisation d'ABP supplémentaires, par exemple, des sondes dirigées vers la GH avec une spécificité α/β différente ou une sélectivité en sucre différente50, permettra ainsi d'élucider des enzymes supplémentaires pour la dégradation de la lignocellulose.

Pour démontrer l'applicabilité de cette approche, nous avons validé biochimiquement trois des «hits» ABPP identifiés. Nous avons sélectionné une cible SH du FP-alcyne ainsi qu'une cible GH de l'approche de marquage JJB111 ABPP. De plus, nous avons choisi de caractériser un homologue bactérien d'une enzyme cible, Phchr2 | 3002168, qui n'a pas été attribué comme enzyme active sur les glucides (CAZyme) sur la base d'analyses de séquence. La protéine de la famille CE1 identifiée par FP-alcyne Phchr2 | 126075 était homologue à une acétyl-xylane estérase73 caractérisée, et nous avons pu confirmer une puissante activité hydrolytique contre le pNP-acétate. Ceci suggère une application biotechnologique potentielle de cette enzyme dans les premières étapes de la dégradation de l'hémicellulose, qui est le clivage des groupes acétyle sur la lignocellulose. Phchr2|2915237 a été identifiée comme une β-endoglucanase dissociée et hautement catalytiquement active, clivant des polysaccharides, qui présente une activité à la fois contre le xylane et le lichénane ainsi que contre pNP-Glc et pNP-Xyl et ne libère ni glucose ni xylose des chaînes de lichénane ou de xylane, respectivement . Il contribue donc très probablement à la dégradation de la lignocellulose dans P. chrysosporium. Phchr2|2915237 contient un signal de sécrétion pour le transport extracellulaire et devrait appartenir à la sous-famille GH5 9. Jusqu'à présent, seules quelques enzymes de cette sous-famille sont connues, dont la plupart contiennent de l'exo-β-1,3- ou de l'exo-β -Activité 1,4-glucanase en plus d'une activité endo-1,6-glucanase chez certains membres de la famille. Au total, 17 membres de la famille ont été caractérisés, tous appartenant à différentes espèces de levures ou d'Aspergillus, alors qu'aucun homologue n'a été décrit dans aucun basidiomycète jusqu'à présent. Des homologues caractérisés de Phchr2|2915237 se sont avérés jouer un rôle clé dans les processus morphogénétiques au cours du développement et de la différenciation, par exemple chez Candida albicans où les exo-β-1,3-glucanases hydrolysent partiellement les zones de la paroi cellulaire, permettant l'insertion de nouvelles parois cellulaires. matériau, et peut en outre également cliver les liaisons glycosidiques 1,4 et 1,668. Chez S. pombe, une protéine de la sous-famille GH5 9 était capable d'hydrolyser les liaisons glycosidiques β-1,3 et β-1,674,75. Cependant, il a également été démontré que différents homologues fonctionnent comme des enzymes antifongiques ou sont impliqués dans la dégradation de la paroi cellulaire des plantes76,77. Fait intéressant, Phchr2|2915237 montre également une certaine similitude avec les endo-1-4-glucanases qui catalysent le clivage de différents xylo/gluco-oligosaccharides66. En ce qui concerne le clivage des parois cellulaires fongiques chez P. chrysosporium, jusqu'à présent, la plupart des enzymes GH16 et GH55 ont été attribuées comme étant impliquées dans la morphogenèse de la paroi cellulaire et le recyclage des nutriments78. Bien que l'on ne connaisse pas les fonctions exactes in vivo de Phchr2|2915237, son exportation semble être induite lorsque P. chrysosporium est cultivé sur lignocellulose et sa double activité endo-glucanase/xylanase permettrait à l'enzyme de participer à la dégradation de la plante. matériau de la paroi cellulaire. L'activité enzymatique globale élevée et la large spécificité de substrat de Phchr2 | 2915237, associées à sa compatibilité avec l'expression hétérologue dans un organisme de production industriel pertinent tel que A. oryzae, font de cette enzyme un biocatalyseur prometteur pour une dégradation efficace des glucides. Enfin, nous avons pu montrer le potentiel de l'ABPP pour annoter également des protéines de fonction inconnue ou mal assignée. Phchr2|3002168 a été identifié par marquage avec la sonde GH JJB111. Cependant, comme nous n'avons pas réussi à exprimer directement cette protéine, nous avons plutôt caractérisé la protéine hautement homologue WP_074995790 de S. misionensis, une bactérie également connue pour dégrader la cellulose sous forme de bagasse de canne à sucre79. Nous avons pu confirmer une activité β-galactosidase même si l'activité spécifique totale était faible. Cela indique que WP_074995790 pourrait effectivement posséder une activité GH mais que nous n'avons pas été en mesure d'identifier les substrats natifs de ces nouvelles enzymes jusqu'à présent. Cependant, sur la base de notre approche de marquage, de notre analyse de séquence et de nos dosages enzymatiques, nous suggérons que les protéines contenant les domaines DUF4964, DUF5127, DUF4965 et DUF1793, telles que Phchr2|3002168 ou WP_074995790, peuvent fonctionner comme des glycosides hydrolases.

Cependant, il convient de noter que l'approche ABPP rapportée dans cette étude présente également certaines limites. L'identification des protéines cibles ABPP potentielles est influencée par les conditions de culture cellulaire car la composition des protéines sécrétées par P. chrysosporium dépend du temps de croissance de la culture et de la source et du traitement de la biomasse lignocellulosique. Les deux facteurs étant fixés dans cette étude, la portée des cibles potentielles est limitée aux protéines produites et sécrétées dans ces conditions. De plus, l'utilisation d'ABP supplémentaires, de préférence avec une spécificité de cible différente, peut permettre l'identification d'autres enzymes. Le marquage ABPP peut également être abaissé par la présence ou la production à médiation enzymatique de métabolites concurrents. Enfin, la plupart des méthodes ABBP nécessitent actuellement une analyse bioinformatique ultérieure et la vérification des résultats cibles via l'expression et la purification en raison d'une petite proportion d'étiquetage non spécifique lors du profilage ABPP.

En conclusion, notre approche ABPP peut aider à surmonter un défi persistant dans la découverte de biocatalyseurs : la difficulté de lier les données d'un écran fonctionnel aux informations de séquence. L'approche ABPP raccourcit cela et permet de restreindre l'analyse aux enzymes actives ciblées par la sonde ABP sélective enzymatique. Au fur et à mesure que de plus en plus d'ABP deviennent disponibles, cela peut permettre d'identifier des ensembles de biocatalyseurs même pour la dégradation de substrats complexes uniquement en assemblant des enzymes identifiées à partir de différentes campagnes de criblage d'ABPP.

Les produits chimiques pour la culture d'Escherichia coli et de P. chrysosporium DSM 1556, y compris l'extrait de levure, l'extrait de malt, le soja, le bouillon de lysogénie, le TRIS, le MES et les sels pour milieux minimaux ont été obtenus auprès de Carl Roth (Allemagne). Des copeaux de bois de hêtre pour la croissance ont été obtenus auprès de J. Rettenmaier Söhne GmbH & Co. KG. (Allemagne). La carboxyméthylcellulose (CMC), le lichénane, le mannane, le xyloglucane et le glucomannane ont été achetés auprès de Sigma Aldrich (États-Unis) et le xylane de bois de hêtre a été acheté auprès de Carl Roth (Allemagne). para-nitrophénol (pNP), para-nitrophényl-β-d-galactopyranoside (pNP-Gal), para-nitrophényl-acétate (pNP-acétate), para-nitrophényl-β-d-glucopyranoside (pNP-Glc), para- nitrophényl-β-d-xylopyranoside (pNP-Xyl), para-nitrophényl-β-d-mannose (pNP-Man), para-nitrophényl-β-d-arabinofuranoside (pNP-Ara) et para-nitrophényl-N- l'acétyl-β-d-glucosamine (pNP-GlcNAc) ont été achetés auprès de Megazyme (Irlande), le n-dodécyl β-d-maltoside (DDM) a été obtenu auprès de Thermo Scientific (États-Unis) et l'albumine de sérum bovin (BSA) auprès de VWR Chemicals ( ETATS-UNIS). Les sources d'approvisionnement en réactifs plus spécifiques à la méthodologie sont signalées dans la section de procédure correspondante.

P. chrysosporium DSM 1556 a été obtenu auprès du DSMZ (Allemagne). Pour un stockage à long terme, P. chrysosporium DSM 1556 a été cultivé sur des plaques de gélose MYP (6 g L-1 d'extrait de malt ; 1 g L-1 de peptone de soja, 0,5 g L-1 d'extrait de levure) pendant 2 jours à 37 °C. . Ensuite, les cellules ont été grattées, remises en suspension dans des aliquotes de 100 µL de glycérol stérile à 50 % (v/v) et stockées à -80 °C sous forme de stock de glycérol. Pour la croissance de cultures solides, 1,5 % (p/v) de MYP-Agar a été inoculé avec 20 µL de stock de glycérol de P. chrysosporium DSM 1556 et cultivé pendant 2 jours à 37 °C jusqu'à ce que toute la plaque de gélose soit recouverte d'hyphes fongiques. Ensuite milieu minimal contenant 2,5 g L−1 K2HPO4, 0,02 g L−1 KH2PO4, 0,1 g L−1 NaCl, 0,02 g L−1 CaCl2, 0,1 g L−1 (NH4)2SO4, 0,02 g L−1 MgSO4, 0,001 g L−1 FeSO4 et 40 g L−1 de copeaux de bois de hêtre à pH 5 additionnés de 100 µg mL−1 de chloramphénicol pour inhiber la croissance bactérienne ont été inoculés avec P. chrysosporium DSM 1556 cultivé sur plaque. Les cultures en suspension ont été incubées pendant 5 jours à 37 °C sous agitation constante (180 tr/min). La croissance cellulaire a été suivie en suivant la formation d'hyphes fongiques ainsi que par la dégradation macroscopique du substrat de croissance. E. coli Rosetta DE3 a été cultivé soit dans du milieu LB standard (10 g L-1 de tryptone, 10 g L-1 de NaCl, 5 g L-1 d'extrait de levure) dans des précultures, soit dans du milieu TB (22 g L-1 de levure extrait, 12 g L-1 tryptone, 4 mL L-1 glycérol, 0,072 M K2HPO4, 0,017 M KH2PO4, pH 7,2) pour la surexpression hétérologue des enzymes. Kluyveromyces lactis GG799 a été cultivé dans le milieu fourni par le kit d'expression protéique NEB K. lactis (New England Biolabs, USA) ou dans le milieu YPGlu (extrait de levure 10 g L−1, peptone 20 g L−1, glucose 2 %, pH 7 ) pour la surexpression hétérologue.

Après 5 jours, le surnageant a été retiré et stérilisé par filtration à travers un filtre de 0,2 µm (Filtropur S 0,2 ; Sarstedt, Allemagne). Pour obtenir des échantillons MS, 50 ml (marquage) de surnageant de culture ont été congelés instantanément, lyophilisés pendant la nuit, puis stockés à -20 ° C jusqu'à une analyse plus approfondie. Pour l'isolement des protéines liées au substrat, P. chrysosporium DSM 1556 a été cultivé sur 40 g L-1 de copeaux de bois de hêtre dans un milieu minimal dans 50 ml de culture submergée par répétition pour un total de trois ou quatre répétitions biologiques, respectivement. Après un temps de croissance de 5 jours, les copeaux de bois de hêtre ont été séparés du milieu de culture et des cellules fongiques libres par décantation et les copeaux de bois restants ont été lavés trois fois avec 50 mL de tampon (TRIS 50 mM, pH 8) par centrifugation (3000 × g, 10 min, 4 ° C) pour éliminer toutes les protéines et cellules non liées. Les copeaux de bois granulés ont ensuite été incubés dans 5 mL de TRIS 50 mM pH 8 contenant 0,1 % (p/v) du détergent DDM compatible MS à 37 °C pendant 30 min sous agitation constante à 180 tr/min pour solubiliser tous les substrats liés. protéines. Semblable au surnageant, 5 ml de la solution de détachement ont été congelés instantanément, lyophilisés pendant la nuit, puis stockés à -20 ° C jusqu'à une analyse plus approfondie.

Toutes les sondes et compétiteurs ont été dissous dans du DMSO. Pour identifier les cibles enzymatiques de FP-alcyne et JJB111, les protéines lyophilisées ont été remises en suspension dans 2 mL (surnageant) ou 100 µL (SBF) de Na2PO4 50 mM (pH 8,0) (marquage FP-alcyne) ou de NaOAc 50 mM (pH 5,0) (marquage JJB111), respectivement, et la concentration en protéines a été déterminée avec Roti®-Nanoquant (test de Bradford modifié ; Carl Roth, Allemagne). Une quantité totale de 400 µg (surnageant) ou 100 µg (fractions liées au substrat) de protéine a été marquée avec 2 µM de la sonde indiquée (1 h, 37 °C, agitation vigoureuse). Pour la compétition de marquage avec les ABP indiqués, soit 50 µM de paraoxon (marquage FP-alcyne) soit 20 µM de KY358-acyl ou KY371 (marquage JJB111) ont été utilisés comme indiqué (30 min, 37 °C, agitation vigoureuse). Les protéines marquées FP-alcyne ont ensuite été soumises à une réaction de clic avec 10 µM TAMRA-biotine-N3 (Jena Bioscience, Allemagne), 100 µM TBTA (Sigma Aldrich, USA), 2 mM TCEP (Sigma Aldrich, USA) et 1 mM CuSO4 (Sigma Aldrich, USA ; 1 h, température ambiante, dans l'obscurité).

Avant l'enrichissement par affinité, une précipitation modifiée au méthanol-chloroforme80 a été effectuée pour nettoyer les protéines. En bref, des solutions de protéines ont été incubées avec quatre équivalents de méthanol (-20 ° C, pendant la nuit) avant d'ajouter un équivalent de chloroforme et trois équivalents d'eau de qualité MS (VWR Chemicals, États-Unis). Les protéines précipitées ont été lavées deux fois avec du méthanol, séchées à l'air, puis dissoutes dans un volume final de 8 ml de SDS à 0,2 % (p/v) dans du PBS 1 × (NaCl 155 mM, Na2HPO4 3 mM, KH2PO4 1,06 mM, pH 7,4 ) sous agitation douce (37 °C, 30 min). Pour l'enrichissement des protéines ayant réagi avec l'ABP, la solution de protéines obtenue a été incubée avec 100 µL de bouillie de billes d'avidine (Thermo Scientific, USA) tout en tournant doucement (1 h, température ambiante). Ensuite, les billes ont été lavées cinq fois avec du SDS à 0,2 % (p/v) (10 min, température ambiante, rotation douce), suivies de trois lavages avec H2O de qualité MS (5 min, température ambiante, agitation vigoureuse), et recueillies par centrifugation (400 × g, température ambiante, 5 min). Les billes lavées ont été reprises dans 100 µL d'urée 0,8 M (GE Healthcare Life Sciences, USA) dans du bicarbonate d'ammonium 50 mM (ABC), les protéines ont été réduites avec du dithiothréitol 5 mM (DTT, Sigma Aldrich, USA) dans du ABC 50 mM (30 min, 37 ° C, agitation vigoureuse), puis alkylé en ajoutant 10 mM d'iodoacétamide (IAM) dans 50 mM ABC (30 min, 37 ° C, dans l'obscurité). La réaction d'alkylation a été désactivée en ajoutant du DTT à une concentration finale de 10 mM. Pour la digestion des protéines, 1 µg de trypsine (Thermo Fisher Scientific, USA) dans de l'acide acétique 50 mM a été ajouté (37 °C, 16 h, agitation vigoureuse). Les billes ont été recueillies par centrifugation (5 min, température ambiante, 650 × g) et le surnageant a été récupéré et mélangé avec de l'acide formique (FA) à une concentration finale de 0,5 % (v/v). Pour laver les billes, 40 µL de FA à 1 % (v/v) ont été ajoutés (5 min, température ambiante, agitation vigoureuse) et le surnageant a été combiné avec le mélange de digestion récupéré. Pour éliminer les billes restantes de la solution de peptide, le mélange a été centrifugé (5 min, température ambiante, 100 × g) à travers une membrane en microfibre de verre à deux disques maison (GE Healthcare, USA ; taille des pores 1,2 µm, épaisseur 0,26 mm) StageTip . La solution de peptide clarifiée a ensuite été dessalée sur des StageTips C18 maison comme décrit (pour le protocole utilisé, voir ci-dessous).

Toutes les solutions de peptides après digestion et élimination des matières solides ont été dessalées à l'aide de C18 StageTips maison, comme décrit précédemment81. Toutes les étapes de centrifugation ont été effectuées dans la plage de 400 à 800 × g et pendant 1 à 3 min à température ambiante. En bref, les digestions trypsiques acidifiées ont été passées sur des StageTips à deux disques et les peptides immobilisés ont été lavés deux fois avec 0,5 % (v/v) de FA. Les peptides ont été élués des StageTips par une élution en deux étapes avec 80 % (v/v) d'acétonitrile contenant 0,5 % (v/v) de FA. Après élution des StageTips, les échantillons ont été séchés à l'aide d'un concentrateur sous vide (Eppendorf, Allemagne) et les peptides ont été remis en suspension dans 15 µL de FA à 0,1 % (v/v). Les échantillons ainsi préparés ont été directement utilisés pour les expériences LC-MS/MS (voir ci-dessous pour plus de détails).

Les expériences LC-MS/MS ont été réalisées sur un spectromètre de masse Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Fisher Scientific, USA) couplé à un système de chromatographie liquide (LC) EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, USA). La LC fonctionnait en mode une colonne et la colonne analytique était un capillaire en silice fondue (diamètre intérieur 75 μm × 36–46 cm) avec un émetteur PicoFrit intégré (New Objective, USA) emballé en interne avec Reprosil-Pur 120 C18-AQ 1,9 μm (Dr Maisch, Allemagne). La colonne analytique était entourée d'un four à colonne (Sonation, Allemagne) et fixée à une source d'ions flexibles nanospray (Thermo Fisher Scientific, États-Unis). La température du four à colonne a été ajustée à 50 °C lors de l'acquisition des données. Le LC était équipé de deux phases mobiles : le solvant A (0,1 % (v/v) FA, dans l'eau) et le solvant B (0,1 % (v/v) FA, 20 % (v/v) H2O, dans l'acétonitrile). Tous les solvants étaient de qualité UHPLC (chromatographie liquide à ultra haute performance) (Honeywell, Allemagne). Les peptides ont été directement chargés sur la colonne analytique avec un débit maximal qui ne dépasserait pas la limite de pression définie de 980 bars (généralement autour de 0,5 à 0,8 µL min−1). Les solutions de peptides ont ensuite été séparées sur la colonne analytique en utilisant différents gradients (longueur de 105 min ; pour plus de détails, voir le fichier supplémentaire Sample_Legend_and_LC-MS_Settings, section "LC_Settings").

Le spectromètre de masse a été exploité à l'aide du logiciel Xcalibur v4.3.7.3.11. Le spectromètre de masse a été réglé en mode ions positifs. Le balayage des ions précurseurs (MS1) a été effectué dans l'analyseur Orbitrap (FTMS ; Fourier Transform Mass Spectrometry avec l'option de masse de verrouillage interne activée (la masse de verrouillage était de 445,120025 m/z, polysiloxane))82. L'exclusion dynamique a été activée (exclure après n fois = 1 ; durée d'exclusion (s) = 120 ; tolérance de masse = ± 10 ppm). Les spectres d'ions produits MS2 ont été enregistrés uniquement à partir d'ions de charge supérieure à +1 et de manière dépendante des données dans l'ITMS (Ion Trap Mass Spectrometry). Tous les paramètres MS individuels pertinents (résolution, fréquence de balayage, plage de balayage, AGC, temps d'acquisition des ions, états de charge, fenêtre d'isolement, type et détails de fragmentation, temps de cycle, nombre de balayages effectués et divers autres paramètres) pour les expériences individuelles peuvent se trouvent dans le fichier supplémentaire Sample_Legend_and_LC-MS_Settings, section "MS_Settings").

Les spectres RAW ont été soumis à une recherche Andromeda dans MaxQuant83 (version 1.6.10.43) en utilisant les paramètres par défaut. La quantification sans étiquette et la correspondance entre les séries ont été activées. Les données des spectres MS/MS ont été recherchées dans la base de données UniProt P. chrysosporium (Phanerochaete_chrysosporium_Uniprot_210114.fasta; 430 entrées) et Joint Genome Institute P. chrysosporium (Phanerochaete_chrysosporium_JGI_210114.fasta)42 (modèle le mieux filtré, 13602 entrées). Toutes les recherches comprenaient une base de données sur les contaminants (telle qu'implémentée dans MaxQuant, 246 séquences). La base de données sur les contaminants contient des contaminants MS connus et a été incluse pour estimer le niveau de contamination. Les recherches d'Andromède ont permis l'oxydation des résidus méthionine (16 Da), l'acétylation de l'extrémité N-terminale de la protéine (42 Da) sous forme de modifications dynamiques et la modification statique de la cystéine (57 Da, alkylation avec IAM). La spécificité enzymatique a été fixée à "Trypsine/P". Le type d'instrument dans les recherches Andromeda a été défini sur Orbitrap et la tolérance de masse des précurseurs a été définie sur ± 20 ppm (première recherche) et ± 4,5 ppm (recherche principale). La tolérance de correspondance MS/MS a été fixée à ±0,5 Da. Le spectre peptidique correspondait au FDR et le FDR protéique était fixé à 0, 01 (sur la base de l'approche cible-leurre). La longueur minimale du peptide était de sept acides aminés. Pour la quantification des protéines, les peptides uniques et rasoirs étaient autorisés. Des peptides modifiés avec des modifications dynamiques ont été autorisés pour la quantification. Le score minimum pour les peptides modifiés était de 40. La correspondance entre les analyses a été activée avec une fenêtre de temps de correspondance de 0,7 min et une fenêtre de mobilité des ions de 0,05 min84. Une analyse plus poussée des données et un filtrage de la sortie MaxQuant ont été effectués dans Perseus v1.6.2.3.85 Les intensités de quantification sans étiquette (LFQ) ont été chargées dans la matrice à partir du fichier proteinGroups.txt et des contaminants potentiels, ainsi que des occurrences de la base de données inversée et les hits uniquement identifiés par les peptides avec un site de modification, ont été supprimés. Des répliques biologiques apparentées ont été combinées en groupes catégoriels pour permettre la comparaison de différents traitements ou milieux de culture. Les données ont été transformées à l'échelle log2 et seules les protéines qui ont été trouvées dans deux des trois ou trois des quatre répétitions, respectivement, ont été étudiées séparément. Avant la quantification, les valeurs manquantes ont été imputées à partir d'une distribution normale (largeur 0,3, rétrogradation 1,8).

Dans les expériences de marquage, l'enrichissement log2 des groupes de protéines par FP-alcyne ou JJB111 a été calculé sur la base d'un test t de Student bilatéral (FDR basé sur la permutation : 0,05, s = 0,1, 250 randomisations) par rapport au contrôle DMSO . Les protéines avec un changement de facteur log2> 2 ont été considérées comme significativement enrichies et toutes les protéines avec un changement de facteur positif ont été tracées par rapport à leur ordre numérique. Pour examiner l'effet du prétraitement concurrent sur l'enrichissement en protéines, un test t de Student bilatéral (FDR basé sur la permutation : 0,05, s = 0,1, 250 randomisations) a été effectué pour calculer la différence d'abondance en protéines entre les sondes non compétitives et prétraitées. échantillons marqués et la signification statistique du changement de pli. Le changement de facteur log2 pour les échantillons préincubés avec les concurrents correspondants par rapport aux échantillons non compétitifs marqués avec la sonde respective a été tracé par rapport à la valeur -log p. Les protéines avec une réduction de > 75 % de leur abondance et une valeur ap < 0,01 ont été considérées comme des résultats primaires, tandis que les protéines avec une valeur ap < 0,05 ont été signalées comme des résultats secondaires. L'ID de la protéine a été signalé comme JGI ID ou Uniprot ID.

Pour la synthèse d'ADNc de P. chrysosporium DSM 1556, des cultures en suspension ont été cultivées sur un milieu minimal avec des copeaux de bois de hêtre pendant 5 jours. Ensuite, les cellules ont été séparées des copeaux de bois de hêtre par décantation et collectées par centrifugation (6000 × g, 4 ° C, 30 min) et remises en suspension dans 5 ml de tampon (TRIS 10 mM, pH 8). Environ 500 µL de cellules ont ensuite été transférés dans un flacon de billes de 0,1/0,5 mm (Zymo Research, USA) et lysés dans un batteur à billes (Precellys 24, VWR, USA). Ensuite, les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation (16 000 × g, 2 min) et l'ARN a été isolé à partir de 300 µL de cellules lysées à l'aide du kit d'isolement d'ARN total Monarch (New England Biolabs, USA), en mélangeant avec 300 µL de tampon de lyse d'ARN. . Après isolement de l'ARN, une banque d'ADNc de P. chrysosporium DSM 1556 a été synthétisée à l'aide du kit de synthèse d'ADNc SMARTer PCR (Takara Bio Europe, France). L'ADNc a été stocké à -20 ° C et utilisé pour l'amplification et le séquençage des gènes ciblés. Le gène phchr2|126075 de P. chrysosporium a été amplifié sans introns à partir d'ADNc à l'aide de la polymérase Q5® (New England Biolabs, États-Unis) et des amorces spécifiques aux gènes suivantes (Eurofins Genomics, Allemagne) 5′-ATGAGGTTGACATGTCCC-3′ et 5′-ACCTCCAATTCCTCGG -3′. Le produit PCR résultant a ensuite été utilisé comme matrice pour l'amplification de phchr2|126075 contenant des sites de restriction spécifiques supplémentaires pour le vecteur pKLAC2 en utilisant les amorces suivantes : 5′-GAGGAGCATATGATGAGGTTGACATGTCCC-3′ et 5′-GAGGAGCTCGAGACCTCCAATTCCTCGG-3′ (NdeI et XhoI sites de restriction soulignés). Ensuite, les produits de PCR ont été purifiés à l'aide du kit de nettoyage Wizard® SV Gel et PCR (Promega, USA). Phchr2|126075 a été cloné dans le vecteur pKLac2 (Novagen, USA), après digestion de restriction des produits de PCR purifiés et du vecteur vide avec les enzymes de restriction respectives (NEB, USA). Le produit de PCR restreint et le vecteur ont été utilisés dans un rapport molaire de 1: 4 pour la ligature à l'aide de l'ADN ligase T4 (New England Biolabs, USA) à 16 ° C pendant une nuit. Des cellules E. coli DH5α (Novagene, USA) ont été transformées avec les constructions obtenues et la présence de gènes clonés avec succès a été confirmée par séquençage à l'aide des amorces spécifiques aux gènes ci-dessus. pKLAC2:phchr2|126075 a ensuite été transformé dans K. lactis GG799 en suivant les instructions du fabricant (New England Biolabs, USA). L'intégration correcte de phchr2|126075 a été confirmée par PCR à l'aide des amorces d'intégration fournies. Les clones transformés ont été inoculés dans 2 ml de milieu YPGlu pour tester la sécrétion de Phchr2 | 126075. Les clones d'expression ont été isolés et remis en suspension dans 250 µL de glycérol stérile à 20 % (v/v) et stockés pour une utilisation ultérieure à -80 °C. Pour l'expression de phchr2|3002168 de P. chrysosporium et WP_074995790 de Streptomyces misionensis dans E. coli Rosetta DE3, les séquences codantes des deux gènes ont été synthétisées par BioCat (Allemagne) sans signaux de sécrétion pour le clonage dans le vecteur pET20b (avec C-terminal Son étiquette). Pour la surexpression hétérologue, E. coli Rosetta DE3 a été fraîchement transformé avec le plasmide correspondant.

La production recombinante de Phchr2 | 126075 a été réalisée dans K. lactis GG799 (New England Biolabs, USA). Après transformation, le surnageant de culture a été collecté par centrifugation (4000 × g, 30 min, 4 ° C) et criblé pour le clone ayant la plus forte activité contre le pNP-acétate (volume de culture de 50 ml). Pour ce faire, 100 µL du surnageant ont été incubés avec 100 µL de TRIS 50 mM pH 8 et 400 µM de pNP-acétate, et la libération de p-NP a été déterminée à 410 nm dans une plaque 96 puits (BRANDplates®, BRAND , Allemagne) à l'aide d'un lecteur de plaques Tecan Infinity M200 (Tecan Trading AG, Suisse). Pour l'expression des protéines, 50 mL de culture ont été inoculés avec 1 % (v/v) d'une pré-culture et incubés pendant 3 jours à 30 °C. Ensuite, les cellules ont été centrifugées (4000 × g, 30 min, 4 °C) et le surnageant passé à travers un filtre de 0,45 µm (filtre seringue Rotilabo®, Carl Roth, Allemagne) avant d'être utilisé pour la détermination de l'activité estérase de Phchr2|126075 .

Pour la production de WP_074995790, une culture fraîchement inoculée d'E. coli Rosetta DE3 [pET20b::WP_074995790] dans un milieu terrific bouillon (TB) (500 mL), additionné de 150 µg mL−1 d'ampicilline et 50 µg mL−1 de chloramphénicol, a été cultivé jusqu'à une DO600 de 0,8 à 37 °C sous agitation constante (180 tr/min). L'expression des protéines a été induite par l'ajout de 1 mM d'isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG). Les cellules ont ensuite été incubées à 18 °C pendant encore 16 h, recueillies par centrifugation (6000 × g, 20 min, 4 °C) et remises en suspension dans 10 mL de tampon A (50 mM TRIS-HCl pH 7,8, 200 mM KCl , imidazole 10 mM) par gramme de poids humide. La lyse cellulaire a été réalisée par sonication à l'aide d'un sonicateur UP 200 S (Hielscher Ultrasonics GmbH, Allemagne) pendant 3 × 7 min (50 % d'amplitude, 0,5 s−1) sous refroidissement constant suivi d'une centrifugation (14 000 × g, 60 min, 4 ° C). Pour une purification plus poussée de WP_074995790, le lysat clarifié a été passé à travers un filtre de 0,45 µm (filtre seringue Rotilabo®, Carl Roth, Allemagne) et appliqué sur une colonne Ni-IDA de 5 ml (Cytiva, USA) équilibrée avec le tampon A à une vitesse d'écoulement de 5 ml min−1. Après lavage avec le tampon A (20 volumes de colonne), l'élution a été effectuée avec un gradient linéaire de tampon B (TRIS 50 mM pH 7,8, KCl 200 mM, imidazole 400 mM). Le tampon d'élution a été remplacé par un tampon de stockage (TRIS 50 mM pH 8,0, KCl 20 mM, glycérol 10 % (v/v)) à l'aide de filtres centrifuges Amicon® (seuil 50 kDa, Merck, Allemagne) par concentration et dilution répétées. Pour le stockage, les protéines ont été congelées rapidement dans de l'azote liquide et stockées à -80 ° C.

Un gène synthétique codant pour Phchr2|2915237 a été commandé sous forme de gBlock à IDTdna (USA), intégré dans le génome d'Aspergillus oryzae et exprimé sous forme d'enzyme extracellulaire comme décrit ailleurs86. Un his-tag C-terminal (6xHis) a été ajouté pour faciliter la purification en aval. Le bouillon de fermentation a été filtré de manière stérile et 500 mM de NaCl ont été ajoutés et ajustés à pH 7,5 par addition de NaOH. L'échantillon a été chargé sur une colonne Ni-Sepharose™ 6 Fast Flow (GE Healthcare, USA) équilibrée dans HEPES 50 mM, pH 7,5 avec NaCl 500 mM (tampon A). Après le chargement, la colonne a été lavée avec 10 volumes de colonne de tampon A et les protéines liées ont été éluées avec 500 mM d'imidazole dans le tampon A. Les fractions contenant l'enzyme ont été regroupées et appliquées à un Sephadex™ G-25 (milieu) (GE Healthcare , USA) colonne équilibrée et éluée dans HEPES 100 mM pH 7,5. Les fractions ont été analysées par SDS-PAGE et les fractions contenant l'enzyme ont été combinées.

L'activité estérase a été confirmée en mesurant la libération de pNP à partir de pNP-acétate à 410 nm dans un essai discontinu ou continu. Pour confirmer le pH optimal de Phchr2|126075, 1,08 µg de protéine ont été incubés dans un tampon phosphate citrate 50 mM à un pH compris entre 5,5 et 8 avec 25 mM de pNP-acétate dans un volume total de 500 µL pendant 10 min à 35 °C . Ensuite, les réactions ont été stoppées par l'ajout de 500 µL de carbonate de sodium 0,5 M et l'absorption des échantillons a été déterminée à 410 nm. La production de pNP a ensuite été calculée en utilisant le coefficient d'extinction établi de 16,1 mM-1 cm-1 pour pNP87. Pour la détermination de la température optimale, Phchr2|126075 a été incubé dans 50 mM TRIS pH 8, 20 mM KCl et la libération de pNP à partir de pNP-acétate a été déterminée en continu dans une plage de température de 30 à 70 °C dans un volume total de 500 µL . Pour la détermination des constantes cinétiques, Phchr2 | 126075 a été incubé avec différentes concentrations de pNP-acétate à 40 ° C dans une solution aqueuse contenant 50 mM de TRIS pH 8 et 20 mM de KCl. Les vitesses initiales de chaque réaction ont été prises et utilisées pour le calcul des activités. Tous les dosages enzymatiques ont été effectués en triple.

L'activité de Phchr2|2915237 et WP_074995790 a été établie contre différents polysaccharides et conjugués pNP artificiels. Le pH et la température optimum de Phchr2|2915237 ont été déterminés en incubant 0,5 µg d'une enzyme avec 200 µM de pNP-Glc ou pNP-Gal pendant 10 min dans 500 µL de tampon phosphate citrate88 à un pH compris entre 3 et 8 à 30 °C ou une plage de température de 30 à 70 ° C à pH 5, respectivement. Après incubation, les réactions ont été arrêtées par addition de 500 ul de carbonate de sodium 0,5 M et le clivage de pNP-Glc a été suivi en déterminant la libération de pNP à 410 nm comme décrit ci-dessus. Pour mesurer la spécificité de substrat de Phchr2|2915237 et WP_074995790 contre les conjugués pNP, 200 µM de pNP-Ara, pNP-GlcNAc, pNP-Gal et pNP-Man ont été incubés avec 10 µg de Phchr2|2915237 ou 11,2 µg de WP_074995790 ou 200 µM de pNP-Xyl et pNP-Glc ont été incubés avec 0,4 µg de Phchr2|2915237 ou 11,2 µg de WP_074995790 comme décrit ci-dessus. Des mesures cinétiques contre des substrats de nitrophényle ont été effectuées dans un essai discontinu en incubant différentes concentrations de pNP-Glc et pNP-Xyl avec 0, 5 µg de Phchr2 | 2915237 tout en arrêtant la réaction après 1, 2, 5 et 10 min, respectivement. Ensuite, les vitesses initiales de la réaction ont été utilisées pour calculer l'activité spécifique de Phchr2|2915237 vis-à-vis des substrats de nitrophénol.

Pour mesurer la spécificité de substrat de Phchr2|2915237 contre le xyloglucane, le galactomannane, le curdlan, le CMC, le xylane et le lichénane, 1 µg d'enzyme a été incubé avec 0,5 % (p/v) des polysaccharides respectifs dans 500 µL de tampon phosphate d'acide citrique pH 5 pendant 1, 2, 5 et 10 min. Ensuite, 500 µL de la solution de DNSA (10 g L-1 DNSA, 2 mL L-1 de 0,05 g L-1 de sulfite de sodium, 200 g L-1 de tartrate de potassium et de sodium et 10 g L-1 de NaOH) ont été ajoutés et puis incubé à 100°C pendant 15 min. Les échantillons ont ensuite été refroidis sur de la glace pendant 15 min et centrifugés (10 000 × g, 4 ° C pendant 30 min) avant que 250 µL de surnageant ne soient transférés dans une plaque à 96 puits (BRANDplates®, BRAND, Allemagne). La libération des sucres réducteurs a été suivie à 575 nm à l'aide d'un lecteur de plaques Tecan Infinity M200 (Tecan Trading AG, Suisse) et déterminée à l'aide d'une courbe d'étalonnage basée sur le d-glucose. L'absorption de fond due à la dégradation du substrat abiotique et à l'ajout de solutions protéiques a été déterminée et soustraite de l'absorption des échantillons. L'activité de la glutaminase a été testée en utilisant le l-gamma-glutamyl-pNP comme décrit précédemment89 ou en surveillant la formation de glutamate à partir de la glutamine par la glutamate déshydrogénase (Merck, Allemagne) via la réduction du NAD+. Pour vérifier la formation de glucose ou de xylose lors de la dégradation des polysaccharides, les échantillons ont été incubés comme décrit ci-dessus pendant 4 h. Ensuite, les échantillons ont été centrifugés à 10 000 × g, 4 ° C pendant 30 min, et 200 µl de surnageant ont été incubés avec 2 U de glucose déshydrogénase (Sigma Aldrich, États-Unis) ou de xylose déshydrogénase (Megazyme, Irlande) et 5 mM de NAD + dans du TRIS 50 mM pH 8 et la formation de glucose et de xylose a ensuite été mesurée en déterminant la réduction de NAD+ en NADH. Tous les dosages enzymatiques ont été effectués en triple.

Des réactions enzymatiques avec 0,5 % (p/v) de lichenane ou de xylane de bois de hêtre ont été réalisées dans les mêmes conditions que celles utilisées pour le test DNSA avec 10 µg de Phchr2|2915237. Le lichenan et le xylane ont été incubés avec Phchr2 | 2915237 comme décrit ci-dessus, et les échantillons ont été retirés après 1, 2 et 4 h. Ensuite, 2,5 µl des produits d'hydrolyse et des solutions de contrôle ont été appliqués sur des plaques de gel de silice en feuille d'aluminium 60/kieselguhr F254 ((20 cm × 20 cm, Merck, Allemagne) et séparés à température ambiante avec de l'acétate d'éthyle, du méthanol et H2O (68 : 23:9, v/v/v) comme solvant. Les plaques ont été séchées et les produits ont été visualisés en traitant les plaques avec une solution de coloration KMnO4 (1,5 g KMnO4, 10 g K2CO3 et 1,25 mL 10 % aq. NaOH dans 200 mL H2O ) et incubation à température ambiante pendant 30 min.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données de protéomique de spectrométrie de masse pour les digestions ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE90 (https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/) avec l'identifiant de jeu de données PXD030618. Toutes les données générées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié (et ses fichiers d'informations supplémentaires). Toutes les données sources sous-jacentes aux graphiques et aux diagrammes se trouvent dans les données supplémentaires 5. Les ensembles de données brutes générés au cours de l'étude en cours sont disponibles sur demande.

Une correction à cet article a été publiée : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04290-z

Cravatt, BF, Wright, AT & Kozarich, JW Profilage des protéines basé sur l'activité : de la chimie enzymatique à la chimie protéomique. Annu. Rév. Biochem. 77, 383–414 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sanman, LE & Bogyo, M. Profilage des protéases basé sur l'activité. Annu. Rév. Biochem. 83, 249-273 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Benns, HJ, Wincott, CJ, Tate, EW & Child, MA Protéomique basée sur l'activité et la réactivité : avancées technologiques récentes et applications dans la découverte de médicaments. Courant. Avis. Chim. Biol. 60, 20–29 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Fang, H. et al. Progrès récents dans les sondes basées sur l'activité (ABP) et les sondes basées sur l'affinité (AfBP) pour le profilage des enzymes. Chim. Sci. 12, 8288–8310 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, N., Overkleeft, HS & Florea, BI Profilage des protéines basé sur l'activité : une technologie habilitante dans la recherche en biologie chimique. Courant. Avis. Chim. Biol. 16, 227-233 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Verhelst, SHL, Bonger, KM & Willems, LI Réactions bioorthogonales dans le profilage des protéines basé sur l'activité. Molécules 25, 5994 (2020).

Niphakis, MJ & Cravatt, BF Découverte d'inhibiteurs d'enzymes par profilage de protéines basé sur l'activité. Annu. Rév. Biochem. 83, 341–377 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Deng, H., Lei, Q., Wu, YP, He, Y. & Li, WM Profilage des protéines basé sur l'activité : avancées récentes en chimie médicinale. EUR. J. Med. Chim. 191, 112151 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Nomura, DK, Dix, MM & Cravatt, BF Profilage des protéines basé sur l'activité pour la découverte de voies biochimiques dans le cancer. Nat. Rev. Cancer 10, 630–638 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kok, BP et al. Découverte d'activateurs enzymatiques à petites molécules par profilage protéique basé sur l'activité. Nat. Chim. Biol. 16, 997-1005 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parker, CG et al. Découverte de ligands et de cibles par criblage basé sur des fragments dans des cellules humaines. Cellule 168, 527–541 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wright, MH & Sieber, SA Approches protéomiques chimiques pour identifier les cibles cellulaires des produits naturels. Nat. Prod. Rep. 33, 731–733 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Morimoto, K. & van der Hoorn, RA L'impact croissant du profilage des protéines basé sur l'activité en phytologie. Cellule végétale Physiol. 57, 446–461 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Keller, LJ, Babin, BM, Lakemeyer, M. & Bogyo, M. Profilage des protéines basé sur l'activité chez les bactéries : applications pour l'identification de cibles thérapeutiques et la caractérisation des communautés microbiennes. Courant. Avis. Chim. Biol. 54, 45–53 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lentz, CS Ce que vous voyez est ce que vous obtenez : des sondes basées sur l'activité dans l'analyse unicellulaire des activités enzymatiques. Biol. Chim. 401, 233–248 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Krysiak, J. & Sieber, SA Profilage protéique basé sur l'activité chez les bactéries. Méthodes Mol. Biol. 1491, 57–74 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Heal, WP & Tate, EW Application du profilage des protéines basé sur l'activité à l'étude de la pathogenèse microbienne. Haut. Courant. Chim. 324, 115-135 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Steuten, K. et al. Défis pour cibler les protéases SARS-CoV-2 comme stratégie thérapeutique pour COVID-19. ACS Infect. Dis. 7, 1457-1468 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Zweerink, S. et al. Profilage protéique basé sur l'activité en tant que méthode robuste pour l'identification et le dépistage d'enzymes chez les archées extrêmophiles. Nat. Commun. 8, 15352 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pagar, AD et al. Progrès récents en biocatalyse avec modification chimique et alphabet d'acides aminés élargi. Chim. Rév.121, 6173–6245 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Fuerst, R. & Breinbauer, R. Profilage protéique basé sur l'activité (ABPP) des oxydoréductases. Chembiochem 22, 630–638 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Rosnow, JJ, Anderson, LN, Nair, RN, Baker, ES et Wright, AT Profilage de la dégradation et de l'utilisation de la lignocellulose microbienne par les technologies omiques émergentes. Crit. Rév. Biotechnol. 37, 626–640 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Liu, Y. et al. Faire progresser la compréhension des processus de conversion de la bioénergie microbienne par le profilage des protéines basé sur l'activité. Biotechnol. Biocarburants 8, 156 (2015).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Schroder, SP et al. Profilage dynamique et fonctionnel des enzymes dégradant le xylane dans les sécrétomes d'aspergillus à l'aide de sondes basées sur l'activité. ACS Cent. Sci. 5, 1067-1078 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Rodriguez Benitez, A. & Narayan, ARH Frontières en biocatalyse : fonction de profilage dans l'espace des séquences. ACS Cent. Sci. 5, 1747-1749 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Barglow, KT & Cravatt, BF Profilage protéique basé sur l'activité pour l'annotation fonctionnelle des enzymes. Nat. Méthodes 4, 822–827 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hunerdosse, D. & Nomura, DK Approches protéomiques et métabolomiques basées sur l'activité pour comprendre le métabolisme. Courant. Avis. Biotechnol. 28, 116-126 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Zhang, T., Liu, H., Lv, B. & Li, C. Stratégies de régulation pour la production d'enzymes actives glucidiques par des usines de cellules fongiques filamenteuses. Devant. Bioeng. Biotechnol. 8, 691 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, L. et al. Spécificité de la O-glycosylation pour améliorer la stabilité et l'affinité de liaison à la cellulose des modules de liaison aux glucides de la famille 1. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 111, 7612–7617 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chauvigne-Hines, LM et al. Suite de sondes basées sur l'activité pour les enzymes dégradant la cellulose. Confiture. Chim. Soc. 134, 20521–20532 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jain, N., Tamura, K., Dejean, G., Van Petegem, F. & Brumer, H. Marqueurs de sites actifs orthogonaux pour les endo-bêta-glucanases à liaison mixte. ACS Chem. Biol. 16, 1968-1984 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Chen, Y. et al. Profilage protéique basé sur l'activité des alpha-amylases de rétention dans des échantillons biologiques complexes. Confiture. Chim. Soc. 143, 2423–2432 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

de Boer, C. et al. Sondes et inhibiteurs basés sur l'activité dérivés du cyclophellitol glycosylé pour les cellulases. RSC Chem. Biol. 1, 148-155 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

McGregor, NGS et al. Conception rationnelle d'inhibiteurs basés sur le mécanisme et de sondes basées sur l'activité pour l'identification des alpha-l-arabinofuranosidases conservatrices. Confiture. Chim. Soc. 142, 4648–4662 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McGregor, NGS et al. Le profilage des protéines basé sur l'activité révèle la sécrétion dynamique de cellulase spécifique au substrat par les basidiomycètes saprotrophes. Biotechnol. Biocarburants Bioprod. 15, 6 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Isikgor, FH & Becer, CR Biomasse lignocellulosique : une plateforme durable pour la production de produits chimiques et de polymères biosourcés. Polym. Chim. 6, 4497–4559 (2015).

Article CAS Google Scholar

Himmel, ME et al. Récalcitrance de la biomasse : ingénierie des plantes et des enzymes pour la production de biocarburants. Sciences 315, 804–807 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Himmel, ME & Bayer, EA Conversion de la lignocellulose en biocarburants : défis actuels, perspectives mondiales. Courant. Avis. Biotechnol. 20, 316-317 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Houfani, AA, Anders, N., Spiess, AC, Baldrian, P. & Benallaoua, S. Aperçus de la dégradation enzymatique de la cellulose et de l'hémicellulose en sucres fermentescibles - une revue. Biomasse. Bioénergétique. 134, 105481 (2020).

Article CAS Google Scholar

van den Brink, J. & de Vries, RP Ensembles d'enzymes fongiques pour la dégradation des polysaccharides végétaux. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91, 1477–1492 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Andlar, M. et al. Dégradation de la lignocellulose : un aperçu des champignons et des enzymes fongiques impliqués dans la dégradation de la lignocellulose. Ing. Vie. Sci. 18, 768–778 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ohm, RA et al. Génomique des champignons dégradant le bois. Genet fongique. Biol. 72, 82–90 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

da Silva, RR, Pedezzi, R. & Souto, TB Exploration du potentiel bioprospectif et biotechnologique de la pourriture blanche et des champignons anaérobies Neocallimastigomycota : peptidases, estérases et enzymes lignocellulolytiques. Appl. Microbiol. Biotechnol. 101, 3089–3101 (2017).

Article PubMed Google Scholar

Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, PM & Henrissat, B. La base de données des enzymes actives sur les glucides (CAZy) en 2013. Nucleic Acids Res. 42, D490–D495 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Martinez, D. et al. Séquence du génome de la souche RP78 du champignon dégradant la lignocellulose Phanerochaete chrysosporium. Nat. Biotechnol. 22, 695–700 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Xie, C. et al. Le sécrétome comparatif des champignons de la pourriture blanche révèle des enzymes glucidiques actives co-régulées associées à la ligninolyse sélective des tiges de ramie. Microb. Biotechnol. 14, 911–922 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Simon, GM & Cravatt, BF Protéomique basée sur l'activité des superfamilles d'enzymes : hydrolases à sérine comme étude de cas. J. Biol. Chim. 285, 11051–11055 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, YS, Patricelli, MP & Cravatt, BF Profilage des protéines basé sur l'activité : les hydrolases à sérine. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 96, 14694–14699 (1999).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kallemeijn, WW et al. Nouvelles sondes basées sur l'activité pour le profilage à large spectre de la rétention des bêta-exoglucosidases in situ et in vivo. Angew. Chim. Int. Éd. angl. 51, 12529–12533 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wu, L. et al. Un aperçu des sondes basées sur l'activité pour les glycosidases. Courant. Avis. Chim. Biol. 53, 25–36 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bachovchin, DA et al. Portrait à l'échelle de la superfamille de l'inhibition de la sérine hydrolase obtenue par criblage bibliothèque contre bibliothèque. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 107, 20941–20946 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chandrasekar, B. et al. Profilage de l'activité glycosidase à large spectre. Mol. Protéine cellulaire. 13, 2787–2800 (2014).

Article CAS Google Scholar

Husaini, AM et al. Le profilage protéique multiplex fluorescent basé sur l'activité identifie les alpha-glycosidases actives et d'autres hydrolases dans les plantes. Physique Végétale. 177, 24–37 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sista Kameshwar, AK & Qin, W. Comprendre les propriétés structurelles et fonctionnelles des estérases glucidiques avec un accent particulier sur les estérases d'acétyl xylane désacétylant l'hémicellulose. Mycologie 9, 273–295 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Machado, AS et al. Sécrétome de Phanerochaete chrysosporium et trametes versicolor cultivés dans de la cellulose microcristalline et utilisation des enzymes pour l'hydrolyse des matières lignocellulosiques. Devant. Bioeng. Biotechnol. 8, 826 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Huy, ND, Thiyagarajan, S., Kim, DH & Park, SM Clonage et caractérisation d'une nouvelle acétyl xylane estérase bifonctionnelle avec module de liaison aux glucides de Phanerochaete chrysosporium. J. Biosci. Bioeng. 115, 507-513 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Mistry, J. et al. Pfam : la base de données des familles de protéines en 2021. Nucleic Acids Res. 49, D412–D419 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Jones, P. et al. InterProScan 5 : classification de la fonction des protéines à l'échelle du génome. Bioinformatique 30, 1236-1240 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gabler, F. et al. Analyse de séquence de protéines à l'aide de la boîte à outils bioinformatique MPI. Courant. Protocole Bioinforma. 72, e108 (2020).

Article CAS Google Scholar

Artola, M. et al. Cyclosulfates de 1,6-Cyclophellitol : une nouvelle classe d'inhibiteurs irréversibles de glycosidases. ACS Cent. Sci. 3, 784–793 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Espina, G. et al. Une nouvelle structure de bêta-xylosidase de Geobacillus thermoglucosidasius : la première structure cristalline d'une enzyme GH52 de la famille des glycosides hydrolases révèle une similitude imprévue avec d'autres plis des glycosides hydrolases. Acta Crystallogr. D. Biol. Cristallologue. 70, 1366-1374 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Jumper, J. et al. Prédiction très précise de la structure des protéines avec AlphaFold. Nature 596, 583–589 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nimlos, MR et al. Préférences de liaison, attachement de surface, diffusivité et orientation d'un module de liaison aux glucides de la famille 1 sur la cellulose. J. Biol. Chim. 287, 20603–20612 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eriksson, K.-E. & Petterson, B. Purification et caractérisation partielle de deux protéases acides du champignon de la pourriture blanche Sporotrichum pulverulentum. EUR. J. Biochem 124, 635-642 (1982).

Article CAS PubMed Google Scholar

Taylor, SC, Ferguson, AD, Bergeron, JJ & Thomas, DY Le capteur de repliement des protéines ER UDP-glucose glycoprotéine-glucosyltransférase modifie les substrats éloignés des changements locaux de la conformation des glycoprotéines. Nat. Structure. Mol. Biol. 11, 128-134 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gloster, TM et al. Caractérisation et structures tridimensionnelles de deux xyloglucanases bactériennes distinctes des familles GH5 et GH12. J. Biol. Chim. 282, 19177–19189 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ Outil de recherche d'alignement local de base. J. Mol. Biol. 215, 403–410 (1990).

Article CAS PubMed Google Scholar

Nakatani, Y., Larsen, DS, Cutfield, SM & Cutfield, JF Changement majeur de régiospécificité pour l'exo-1,3-bêta-glucanase de Candida albicans suite à sa conversion en glycosynthase. Biochimie 53, 3318–3326 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Arntzen, MO et al. Comparaison quantitative des répertoires d'enzymes dégradant la biomasse de cinq champignons filamenteux. Sci. Rep. 10, 20267 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, C.-C., Dai, L., Ma, L. & Guo, R.-T. Dégradation enzymatique de la biomasse végétale et des polymères synthétiques. Nat. Rév. Chem. 4, 114–126 (2020).

Article Google Scholar

Kirk, TK, Schultz, E., Connors, W., Lorenz, L. et Zeikus, J. Influence des paramètres de culture sur le métabolisme de la lignine par Phanerochaete chrysosporium. Cambre. Microbiol. 117, 277-285 (1978).

Article CAS Google Scholar

Ding, C., Wang, X. & Li, M. Évaluation de six prétraitements fongiques contre la pourriture blanche sur tige de maïs pour la production d'enzymes cellulolytiques et ligninolytiques, de sucres réducteurs et d'éthanol. Appl. Microbiol. Biotechnol. 103, 5641–5652 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Komiya, D. et al. Modification de la structure cristalline et de la spécificité du substrat de l'acétyl xylane estérase d'Aspergillus luchuensis. Appl. Environ. Microbiol. 83, e01251–17 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chambers, RS et al. Une exo-beta-(1,3)-glucanase de Candida albicans : purification de l'enzyme et clonage moléculaire du gène. J. Gen. Microbiol. 139, 325–334 (1993).

Article CAS PubMed Google Scholar

Nebreda, AR, Vazquez, CR, Villa, TG, Villanueva, JR & del Rey, F. La glycosylation hétérogène du produit du gène EXG1 représente les deux exo-bêta-glucanases extracellulaires de Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 220, 27–30 (1987).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tamano, K. et al. Le gène de la bêta-1,3-exoglucanase exgA (exg1) d' Aspergillus oryzae est nécessaire pour cataboliser le glucane extracellulaire et est induit dans la croissance sur une surface solide. Biosci. Biotechnol. Biochimie. 71, 926–934 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bauer, S., Vasu, P., Persson, S., Mort, AJ & Somerville, CR Développement et application d'une suite d'enzymes dégradant les polysaccharides pour l'analyse des parois cellulaires végétales. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 103, 11417–11422 (2006).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wymelenberg, AV et al. Le sécrétome de Phanerochaete chrysosporium : prédictions de base de données et identifications initiales de peptides par spectrométrie de masse dans un milieu cultivé sur cellulose. J. Biotechnol. 118, 17-34 (2005).

Article PubMed Google Scholar

Franco-Cirigliano, MN et al. Streptomyces misionensis PESB-25 produit une endoglucanase thermoacidophile en utilisant la bagasse de canne à sucre et la liqueur de maïs comme seuls substrats organiques. Biomédical. Rés. Int. 2013, 584207 (2013).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Wessel, D. & Flüggel, UI Une méthode pour la récupération quantitative de protéines en solution diluée en présence de détergents et de lipides. Anal. Biochimie. 138, 141-143 (1983).

Article Google Scholar

Rappsilber, J., Mann, M. & Ishihama, Y. Protocole de micro-purification, d'enrichissement, de pré-fractionnement et de stockage de peptides pour la protéomique à l'aide de StageTips. Nat. Protocole 2, 1896-1906 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Olsen, JV et al. Précision de masse en parties par million sur un spectromètre de masse orbitrap via une injection de masse verrouillée dans un piège en C. Mol. Cellule. Protéome. 4, 2010-2021 (2005).

Article CAS Google Scholar

Cox, J. & Mann, M. MaxQuant permet des taux d'identification de peptides élevés, des précisions de masse individualisées en ppb et une quantification des protéines à l'échelle du protéome. Nat. Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Cox, J. et al. Quantification précise sans étiquette à l'échelle du protéome par normalisation retardée et extraction maximale du rapport peptidique, appelée MaxLFQ. Mol. Cellule. Protéome. 13, 2513-2526 (2014).

Article CAS Google Scholar

Tyanova, S. et al. La plate-forme informatique Perseus pour une analyse complète des données (proté)omiques. Nat. Méthodes 13, 731–740 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Borch, K. et al. Variants de cellobiohydrolase et polynucléotides les codant. Brevet américain 10 036 050 (2014).

Alhifthi, A. & Williams, SJ Mécanismes d'hydrolyse unimoléculaire, bimoléculaire et intramoléculaire du 4-nitrophényl β-d-glucopyranoside. Le tourillon de la chimie organique, 86, 9530–9539 (2021).

McIlvaine, TC Une solution tampon pour la comparaison colorimétrique. J. Biol. Chim. 49, 183-186 (1921).

Article CAS Google Scholar

Koibuchi, K., Nagasaki, H., Yuasa, A., Kataoka, J. & Kitamoto, K. Clonage moléculaire et caractérisation d'un gène codant pour la glutaminase d'Aspergillus oryzae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54, 59–68 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Vizcaíno, JA et al. Mise à jour 2016 de la base de données PRIDE et de ses outils associés. Nucleic Acids Res. 44, D447–D456 (2016).

Article PubMed Google Scholar

Télécharger les références

Le financement du Mercur Mercator Research Center Ruhr (Pr-2017-0020, à DB, BS et MK) ainsi que de la DFG (INST 20876/322-1, à MK et FK) est grandement apprécié.

Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL.

Géronimo Heilmann

Adresse actuelle : Centre allemand du diabète (DDZ), Centre Leibniz de recherche sur le diabète de l'Université Heinrich Heine de Düsseldorf, Düsseldorf, Allemagne

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Christian Schmerling, Leonard Sewald, Geronimo Heilmann.

Technologie et biochimie des enzymes moléculaires (MEB), Microbiologie environnementale et biotechnologie (EMB), Centre de recherche sur l'eau et l'environnement (CWE), Faculté de chimie, Université de Duisburg-Essen, Universitätsstraße 5, 45141, Essen, Allemagne

Christian Schmerling, Christopher Bräsen et Bettina Siebers

Département de biologie chimique, ZMB, Faculté de biologie, Université de Duisburg-Essen, Universitätsstraße 2, 45117, Essen, Allemagne

Leonard Sewald, Geronimo Heilmann, Farnusch Kaschani et Markus Kaiser

Evolution des plantes et des champignons, Ruhr-University Bochum, Universitätsstraße 150, 44780, Bochum, Allemagne

Frederick Witfeld et Dominik Begerow

Novozymes, Biologiens vej 2, 2800 Kgs, Lyngby, Danemark

Kenneth Jensen

Analytics Core Facility Essen, ZMB, Faculté de biologie, Université de Duisburg-Essen, Universitätsstraße 2, 45117, Essen, Allemagne

Farnusch Kaschani

Département de synthèse bio-organique, Institut de chimie de Leiden, Université de Leiden, Einsteinweg 55, 2333 CC, Leiden, Pays-Bas

Herman S. survit

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

CB, DB, BS et MK ont conçu et conçu l'étude ; CS, LS, GH, KJ et FW ont réalisé et analysé toutes les expériences de biologie chimique. CS et KJ ont mené des études de croissance et d'expression des protéines. CS a effectué des caractérisations enzymatiques. HSO a fourni les sondes basées sur l'activité. LS, CS, GH et FK ont effectué la spectrométrie de masse et l'analyse des données associées. CS, LS, BS et MK ont rédigé le manuscrit.

Correspondance avec Bettina Siebers ou Markus Kaiser.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Jean-Guy Berrin et les autres relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Calvin Henard et Christina Karlsson Rosenthal. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Schmerling, C., Sewald, L., Heilmann, G. et al. Identification de biocatalyseurs fongiques dégradant la lignocellulose sécrétés par Phanerochaete chrysosporium via le profilage des protéines basé sur l'activité. Commun Biol 5, 1254 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04141-x

Télécharger la citation

Reçu : 21 février 2022

Accepté : 20 octobre 2022

Publié: 16 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04141-x

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.