Profilage des corticostéroïdes surrénaliens dans le sang et les tissus locaux de souris pendant un stress chronique

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7278 (2023) Citer cet article

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Le stress augmente les concentrations plasmatiques de corticostéroïdes, cependant, leurs niveaux tissulaires ne sont pas clairs. En utilisant un paradigme de défaite sociale répétée, nous avons examiné l'impact du stress chronique sur les niveaux tissulaires de corticostérone (CORT), de progestérone (PROG), de 11-désoxycorticostérone (11DOC) et de 11-déhydrocorticostérone (11DHC) et sur le microbiote intestinal, qui peut remodeler le réponse au stress. Des souris BALB/c mâles, une chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem et le séquençage du gène de l'ARN 16S ont été utilisés pour dépister les niveaux de stéroïdes et le microbiome fécal, respectivement. Le stress a induit une plus grande augmentation de CORT dans le cerveau, le foie et les reins que dans le côlon et les organes lymphoïdes, alors que le 11DHC était le plus élevé dans le côlon, le foie et les reins et beaucoup plus faible dans le cerveau et les organes lymphoïdes. Le rapport CORT/11DHC dans le plasma était similaire à celui du cerveau mais beaucoup plus faible dans les autres organes. Le stress a également modifié les niveaux tissulaires de PROG et de 11DOC et le rapport PROG/11DOC était beaucoup plus élevé dans les organes lymphoïdes que dans le plasma et les autres organes. Le stress a eu un impact sur la diversité β mais pas sur la diversité α du microbiote intestinal et l'analyse LEfSe a révélé plusieurs biomarqueurs associés au traitement du stress. Nos données indiquent que le stress de la défaite sociale module la diversité du microbiote intestinal et induit des changements dépendants des tissus dans les niveaux locaux de corticostéroïdes, qui souvent ne reflètent pas leurs niveaux systémiques.

La réponse aux défis physiques et psychologiques stressants représente des processus adaptatifs pour protéger la survie des individus et maintenir leurs systèmes corporels dans les conditions actuelles1. Les stimuli stressants induisent une cascade d'événements dans l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénal (HPA), ce qui conduit à l'activation du cortex surrénalien et à la libération de glucocorticoïdes, de cortisol chez l'homme et de corticostérone (CORT) chez le rat et la souris. Bien que les voies neuronales des réponses au stress dans le cerveau diffèrent selon le type de facteur de stress, l'activation de l'axe HPA est considérée comme une voie commune finale, qui se traduit par une augmentation nette des glucocorticoïdes circulants2. Les glucocorticoïdes agissent sur de nombreux tissus pour induire des effets génomiques et non génomiques qui régulent les systèmes métabolique, immunitaire, cognitif et reproducteur3. En plus des glucocorticoïdes, le stress entraîne également une augmentation rapide de la sécrétion de progestérone (PROG) et de 11-désoxycorticostérone (11DOC) par le cortex surrénalien4,5.

L'effet local des glucocorticoïdes ne dépend pas uniquement de leurs concentrations plasmatiques car certains tissus peuvent réguler activement les taux locaux de stéroïdes. Les enzymes de la synthèse de novo des glucocorticoïdes sont exprimées non seulement dans le cortex surrénalien mais également dans d'autres tissus tels que l'intestin6,7,8, les organes lymphoïdes9,10,11 et les cellules immunitaires12,13, bien que seules les premières étapes de la synthèse des stéroïdes aient été trouvées dans ce dernier. De plus, certaines cellules expriment l'enzyme 11-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 1 (11HSD1), qui convertit les dérivés 11-oxo inactifs des glucocorticoïdes, de la cortisone et de la 11-déhydrocorticostérone (11DHC), en glucocorticoïdes actifs cortisol et CORT et amplifie ainsi efficacement le niveau local de glucocorticoïdes actifs. Cette enzyme est exprimée dans de nombreux tissus, dont le foie, les reins, l'intestin14, les organes lymphoïdes15,16 et les cellules immunitaires17. Dans certains tissus tels que les reins et l'intestin, le CORT et le cortisol peuvent également être convertis localement en leurs dérivés 11-oxo inactifs, le 11DHC et la cortisone, par l'enzyme 11-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 2 (11HSD2)14. En plus des tissus périphériques, le cerveau montre également une production locale de stéroïdes via une synthèse de novo ou via une conversion locale de stéroïdes provenant des organes endocriniens périphériques, y compris la glande surrénale18,19. Fait intéressant, le stress augmente non seulement le niveau systémique de glucocorticoïdes, mais régule également les enzymes stéroïdogènes, y compris 11HSD1, d'une manière dépendante du temps et des tissus20,21,22 suggérant que la production et le métabolisme locaux des corticostéroïdes et leurs changements en réponse au stress peuvent moduler les effets de la réponse de l'axe HPA dans des tissus particuliers.

Bien que les enzymes de la stéroïdogenèse extrasurrénalienne et des 11HSD soient supposées façonner les corticostéroïdes locaux, le profilage des corticostéroïdes tissulaires n'a jamais été directement quantifié en réponse au stress chronique, à l'exception de la concentration de CORT dans le cerveau, le thymus et l'intestin de rats et de souris stressés de manière chronique23,24. Par conséquent, la présente étude visait à comparer les niveaux systémiques et locaux de prégnénolone (PREG), PROG, 11DOC, CORT et 11DHC dans le sang, le cerveau et les tissus périphériques de souris exposées à un stress chronique en utilisant le modèle de défaite sociale répétée. Étant donné qu'un certain nombre d'études ont indiqué que l'exposition chronique au stress modifie la structure de la communauté microbienne intestinale25 et que le microbiote intestinal peut modifier le comportement et les réponses au stress de l'hôte26 et moduler les niveaux tissulaires de certains stéroïdes27, nous avons également déterminé si l'exposition au stress psychosocial chronique a modifié la structure communautaire du microbiote chez les animaux de laboratoire.

Les expériences ont été réalisées sur des souris mâles BALB/c âgées de 9 semaines (Institut de physiologie, Académie tchèque des sciences, Prague), qui ont été logées dans une pièce à température contrôlée (22 ± 1 °C) sur une 12/12- h cycle lumière/obscurité (lumières allumées à 7h) avec accès gratuit à l'alimentation en granulés Altromin 1314 (Altromin, Lage, Allemagne) et à l'eau du robinet. Après deux semaines de période d'acclimatation, les souris ont été réparties au hasard en deux groupes (groupe stressé et groupe témoin ; n = 5 animaux par groupe) et logées individuellement dans les cages. Le protocole de stress de défaite sociale utilisé dans cette étude était similaire au paradigme résident-intrus utilisé dans nos travaux précédents22. En bref, le protocole était basé sur le fait qu'une souris mâle défend son territoire contre un intrus mâle inconnu et que l'exposition d'un intrus plus jeune au résident représente une charge allostatique imprévisible associée à l'activation de l'axe HPA. Des hommes plus âgés sexuellement expérimentés (n = 9) ont été utilisés comme résidents qui ont été logés individuellement pendant 7 jours avant l'expérience sans changement de literie. Après la période d'isolement de sept jours, chaque intrus a été exposé trois fois par semaine (tous les deux jours) à un résident différent. Chaque intrus a été exposé au total 16 fois au résident. Premièrement, le résident et l'intrus ont été autorisés à rester en contact physique direct l'un avec l'autre dans la cage du résident pendant 10 minutes, après quoi les intrus ont été séparés par un treillis en acier pour préserver le contact sensoriel entre le résident et l'intrus pendant les 50 minutes suivantes. Cette configuration réduisait le risque de blessures, tandis que l'intrus était soumis à un stress psychologique continu en raison de l'interaction sensorielle avec le résident. Après la séance d'interaction sociale, l'intrus a été retiré de la cage du résident et ramené dans sa cage d'accueil située dans la même pièce. Les souris témoins (non stressées) sont restées tranquilles dans leurs cages domestiques dans une pièce calme séparée et ont été sacrifiées un jour avant le groupe de stress. Pour minimiser l'effet du rythme circadien, toutes les séances de stress ont été réalisées entre 9h et 10h30 sauf la dernière qui a commencé à 8h55 avec des intervalles de 15 min entre les souris respectives. Chaque souris a été sacrifiée exactement 80 min après le début du stress (20 min après la dernière session de stress). Les deux groupes de souris (stressées ainsi que le groupe témoin) ont été sacrifiés entre 10 h 15 et 11 h 40. Les expériences ont été approuvées par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Institut de physiologie vvi, Académie tchèque des sciences.

Après la dernière session d'interaction sociale, les souris ont été immédiatement anesthésiées avec de la vapeur d'isoflurane. Ce type d'anesthésie a été choisi car l'anesthésie à l'isoflurane n'a pas eu d'impact significatif sur les niveaux de CORT pendant le sacrifice28. Les souris témoins ont été soigneusement retirées de leur cage d'origine et profondément anesthésiées dans la minute suivant la perturbation de leur cage d'origine. Le sang a été prélevé par ponction cardiaque, centrifugé à 2000 g pendant 10 min à 4 °C et conservé à - 80 °C. Les souris anesthésiées ont ensuite été décapitées et des échantillons de cerveau (cortex cérébral, hippocampe), de foie, de rein, de côlon, de thymus et de ganglions lymphatiques mésentériques (MLN) ont été récoltés, congelés dans de l'azote liquide et stockés à - 80 ° C jusqu'à une analyse plus approfondie. Des échantillons de boulettes fécales ont été prélevés avant le début de la période de stress et immédiatement après sa fin, placés dans des tubes stériles et conservés à - 80 °C jusqu'à l'extraction du matériel génétique pour le séquençage.

Les stéroïdes ont été extraits deux fois à partir d'homogénats de sang et de tissu préparés dans 1 ml d'eau glacée avec un homogénéisateur Polytron (Kinematica AG, Luzern, Suisse). Du sang (100 μl) plus 900 μl d'échantillons d'eau ou d'homogénat (1000 μl) ont été extraits en ajoutant 2 ml de tert-butyl méthyl éther. Le mélange a été vortexé (1500 rpm) 3 fois pendant 30 s et centrifugé à 1500 g pendant 15 min pour séparer les phases aqueuse et organique. Les échantillons centrifugés ont été laissés à congeler et la phase organique supérieure a été transférée dans un tube propre. La phase aqueuse a été réextraite à nouveau avec 2 ml d'éther tert-butylméthylique, et les phases organiques ont été combinées, évaporées dans un courant d'azote à 40 ° C et stockées à - 80 ° C avant un traitement ultérieur pour LC-MS / MS analyse. La concentration en protéines des homogénats tissulaires a été mesurée dans 10 µl d'homogénat tissulaire en utilisant la méthode à l'acide bicinchoninique.

Les étalons de référence de chaque composé stéroïdien (PREG PROG, 11DOC, CORT et 11DHC) et les étalons internes (PROG-d9, CORT-d4) ont été dissous dans du méthanol pour obtenir des solutions mères de 0,5 mg/ml et conservés jusqu'à une semaine à − 18 °C. Des étalons internes ont ensuite été ajoutés aux échantillons de test individuels ou de contrôle de qualité à une concentration finale de 0,1 µg/ml. Les courbes d'étalonnage pour la quantification du composé stéroïdien ont été construites en traçant la surface du pic (ajustée par un étalon interne) en fonction de la concentration des étalons de référence pertinents. Les courbes ont été réalisées en utilisant six points d'étalonnage dans la plage de concentration de 0,0001 à 1,000 µg/ml (y compris l'échantillon de contrôle). Dans cette plage, la réponse du détecteur de masse par rapport à la concentration de stéroïdes était linéaire. Avant l'analyse LC-MS/MS, les surnageants séchés de chaque échantillon ont été redissous dans 150 µl de méthanol contenant des étalons internes à l'aide d'un bain à ultrasons, centrifugés (15 min ; 13 500 tr/min, température ambiante) et filtrés à travers des filtres rotatifs en PVDF de 0,2 µm (Thermo Fisher Scientific, Rockwood, TN, États-Unis). Les extraits ont été transférés dans des flacons et stockés à - 18 ° C avant l'analyse LC-MS/MS.

L'analyse des stéroïdes par LC-MS/MS a été effectuée comme décrit précédemment7. En bref, la séparation chromatographique a été réalisée sur un système de chromatographie liquide à ultra haute performance Dionex UltiMate 3000 (Dionex Softron GmbH, Germering, Allemagne) en utilisant une colonne Kinetex XB-C18 en phase inverse (2,1 × 100 mm, 2,6 µm ; Phenomenex, Torrance, CA, USA) et gradient d'élution. L'analyse par spectrométrie de masse a été traitée à l'aide d'un spectromètre de masse quadripolaire/orbital Q Exactive (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) équipé d'une source d'ionisation par électrospray chauffée (HESI-II) et du logiciel Xcalibur, version 4.0. Le spectromètre de masse fonctionnait en mode ions positifs avec les conditions de source : tension de pulvérisation 2,5 kV ; débit de gaz gaine 49 UA ; débit de gaz auxiliaire 12 UA et débit de gaz de balayage 2 UA ; température capillaire 260 °C ; température de chauffe 419 °C. Les données ont été acquises à l'aide du logiciel Xcalibur. Des échantillons de contrôle qualité ont été saisis toutes les dix analyses pour garantir la bonne exécution des analyses LC-MS/MS. Les mesures des échantillons ont été faites en trois répétitions. Les concentrations de stéroïdes dans les échantillons ont été extrapolées à partir des courbes d'étalonnage et converties en ng par ml (pour le plasma) ou normalisées en mg de protéine du tissu. Une concentration de stéroïdes était considérée comme indéterminable si elle était inférieure à la valeur la plus basse de la courbe d'étalonnage (BC).

La récupération relative des stéroïdes à partir des tissus a été estimée en comparant la surface maximale des analytes dans les échantillons de tissus dopés avec des solutions standard de CORT, 11DHC, 11DOC, PROG et prégnénolone (PREG) à des concentrations de 300, 30, 3 et 0,3 ng /ml avant et après extraction. La récupération relative moyenne des stéroïdes dans les échantillons de tissus étudiés variait de 75 à plus de 90 % selon les stéroïdes et les matrices (PREG, 81,3 ± 5,0 % ; PROG, 86,2 ± 2,5 % ; 11DOC, 93,5 ± 3,2 % ; CORT, 93,2 ± 4,9 % ; 11DHC 77,6 ± 2,9 %).

Pour déterminer les profils de microbiome des animaux stressés et non stressés, des échantillons fécaux ont été prélevés de manière aseptique dans des tubes stériles de souris individuelles immédiatement après la défécation volontaire et stockés à - 80 ° C. Des échantillons témoins ont été prélevés avant la période de stress (groupe STAEX ; n = 10) puis 1 mois plus tard chez des souris non stressées (groupe CTRL ; n = 5) et des animaux stressés après la dernière séance le jour du sacrifice (groupe STRESS ; n = 5). L'ADN total a été extrait de chaque échantillon de selles à l'aide d'un kit d'ADN QIAmp PowerFecal (Qiagen, Hilden, Allemagne) conformément au protocole du fabricant. L'ADN extrait a été exploité pour le séquençage et l'analyse du microbiome comme mentionné précédemment29. En bref, les amplicons de la région V4V5 du gène de l'ARNr 16S ont été préparés à partir de l'ADN extrait. Les bibliothèques ont été préparées à l'aide du NEBNext Fast DNA Library Prep Set (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), purifiées et quantifiées. Le séquençage de nouvelle génération a été réalisé via la plateforme Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) et les données de séquençage sont déposées dans la GenBank (n° d'accès PRJNA896122). Le séquençage n'a pas réussi pour 3 échantillons du groupe STAEX, par conséquent, l'analyse ultérieure des données n'a été effectuée qu'à partir de 7 échantillons de ce groupe (n = 7).

Les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel Statistica (StatSoft Inc. Tulsa, OK, USA), et les données sont exprimées en moyenne ± SEM. Les ensembles de données ont été analysés par une analyse de variance unidirectionnelle ou bidirectionnelle (ANOVA) suivie d'un test de Tukey post hoc. Une ANOVA à une voie a été utilisée pour comparer les profils tissulaires des niveaux de stéroïdes et des ratios CORT/11DHC, PROG/11DOC, CORT/PROG et CORT/11DOC, tandis que l'effet du stress répété de la défaite sociale sur les niveaux de stéroïdes dans les tissus individuels a été analysé par Test t de Student. Une ANOVA à deux voies a été utilisée pour révéler si les niveaux de stéroïdes dans la glande surrénale et le plasma diffèrent selon le stress et le type de stéroïde et s'il existe une interaction stress x type de stéroïde. Une valeur AP ≤ 0,05 était considérée comme significative.

L'analyse du microbiome a été effectuée comme décrit précédemment24. En bref, les séquences de gènes d'ADNr 16S bactérien obtenues au format FASTQ ont été analysées par le pipeline QIIME 2 version 2020.2. Le contrôle qualité a été effectué sur des séquences démultiplexées à l'aide de DADA2 en filtrant les séquences chimériques. Par la suite, le regroupement et la classification taxonomique ont été évalués à l'aide de la base de données SILVA avec des séquences de référence à 99 % d'OTU. La diversité α (décrivant la diversité / richesse des espèces dans un écosystème / groupe de souris témoins ou stressées) a été déterminée à l'aide de l'indice de diversité de Shannon basé sur le test de Kruskal – Wallis. L'analyse des coordonnées principales (PCoA) basée sur la distance Bray-Curtis (diversité β ; décrivant la diversité des espèces entre deux groupes / souris témoins et stressées) a été générée après raréfaction. Les diagrammes en boîte pour l'indice de diversité de Shannon et les diagrammes PCoA bidimensionnels ont été générés dans R-Studio (version 3.6.3) (http://www.rstudio.com/) à l'aide de ggplot2 (https://ggplot2.tidyverse. org). Les ellipses marquent 95 % de confiance pour chaque groupe et la valeur P ≤ 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. L'analyse multivariée par permutation d'Adonis (Adonis/PERMANOVA) et la matrice de distance de Bray-Curtis ont été utilisées pour évaluer la dissemblance entre les échantillons avec une permutation fixée à 999. L'algorithme d'analyse discriminante linéaire (LDA) avec taille d'effet (LEfSe) a été réalisé dans le module Galaxy (http ://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy) basé sur le test factoriel de Kruskal-Wallis et le test de Wilcoxon par paires pour identifier les genres avec des abondances relatives différentielles significatives entre les groupes stressés et témoins avec une valeur α de 0,05 et une valeur seuil de 2,0 sur le logarithmique Scores LDA pour les caractéristiques discriminantes.

L'étude a été menée conformément aux directives de la Déclaration d'Helsinki et approuvée par le Comité pour la protection et l'utilisation des animaux d'expérimentation de l'Institut de physiologie vvi, Académie tchèque des sciences. Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur. L'étude est rapportée conformément aux directives ARRIVE.

Le profilage des stéroïdes dans les glandes surrénales de souris socialement vaincues et non stressées est résumé à la Fig. 1A et à la Fig. S1 supplémentaire en ligne. Une ANOVA à deux facteurs a révélé un effet principal significatif du stress (F1,48 = 19,12, P < 0,001), du type de stéroïde (F5,48 = 78,62, P < 0,001) et de l'interaction stress x type de stéroïde (F5,48 = 3,99, P < 0,01). Le test post hoc de Tukey a indiqué une régulation à la hausse significative de la PREG et de la CORT surrénaliennes sans aucun changement significatif des niveaux de PROG et de 11DOC. De même, les niveaux locaux de 11DHC, qui est généré à partir de CORT par 11HSD2, ne différaient pas entre les glandes surrénales des souris stressées et non stressées.

Effet de la défaite sociale sur les taux surrénalien (A) et plasmatique (B) de la prégnénolone (PREG), de la progestérone (PROG), de la 11-désoxycorticostérone (11DOC), de la corticostérone (CORT) et de la 11-déhydrocorticostérone (11DHC). Colonnes rouges, contrôlez les souris non stressées (CTRL); colonnes vertes, souris exposées à une défaite sociale chronique (STRESS); BC, en dessous de la valeur la plus basse de la courbe d'étalonnage. Les quantités de stéroïdes ont été converties en ng par ml de plasma ou en ng par mg de protéine pour la glande surrénale. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM (n = 3–5). Valeurs significativement différentes entre les souris stressées et non stressées : ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05.

Comme prévu, les taux plasmatiques de corticostéroïdes ont augmenté de manière significative pendant la défaite sociale, quel que soit le type de stéroïde, à l'exception de la PREG (Fig. 1B ; Fig. S1 supplémentaire en ligne). L'ANOVA à deux facteurs a montré un effet significatif du stress (F1,30 = 76,03, P < 0,001), du type de stéroïde (F3,30 = 68,52, P < 0,001) et de l'interaction stress x type de stéroïde (F3,30 = 59,10, P < 0,01). Contrairement aux glandes surrénales, le stress a augmenté de manière significative non seulement le CORT plasmatique (× 26) mais aussi le PROG (× 45), le 11DOC (× 27) et le 11DHC (× 6).

Pour identifier les changements dans les niveaux tissulaires de corticostéroïdes dans les tissus périphériques pendant le stress, CORT, PROG, 11DOC et 11DHC ont été quantifiés dans le cerveau, le côlon, le foie, les reins et les organes lymphoïdes. Conformément au plasma, l'exposition à la défaite sociale a augmenté les niveaux locaux de corticostéroïdes, et cette augmentation dépendait du tissu particulier.

Chez les souris témoins non stressées, la CORT locale a été détectée dans tous les tissus à l'exception des organes lymphoïdes. Le stress a augmenté de manière significative les niveaux de CORT dans tous les tissus, y compris le MLN et le thymus (Fig. 2A; Fig. S1 supplémentaire en ligne). Cette augmentation était de près de 20 fois dans le côlon, de 40 fois dans le rein et de plus de 60 fois dans le foie et le cerveau. L'ANOVA unidirectionnelle a montré différents niveaux de CORT dans les tissus chez les animaux non stressés (F4, 18 = 3, 23, P <0, 05) et stressés (F6, 27 = 7, 73, P < 0, 001). Chez les animaux non stressés, la comparaison post hoc a révélé que les niveaux de CORT dans le rein étaient significativement plus élevés que les niveaux de CORT dans le côlon (P < 0,05) et le cortex (P < 0,01). Pour les animaux stressés, les taux de CORT étaient significativement plus élevés dans l'hippocampe, le foie et les reins que dans les autres tissus (P < 0,05 ou P < 0,01). Contrairement au CORT, le 11DHC chez les animaux non stressés n'a été détecté que dans le rein et le côlon (Fig. 2B, Fig. S1 supplémentaire en ligne) sans aucune différence significative entre les deux tissus. La défaite sociale a augmenté les niveaux de 11DHC dans tous les tissus étudiés ; cependant, il y avait des différences significatives entre les tissus (ANOVA unidirectionnelle, F6,25 = 11,41, P < 0,001) ; Les taux de 11DHC étaient plus élevés dans le côlon, les reins et le foie que dans les autres tissus (P < 0,001 ou P < 0,05).

Effet de la défaite sociale sur le profilage de (A) corticostérone (CORT), (B) 11-déshydrocorticostérone (11DHC), (C) progestérone (PROG) et (D) 11-désoxycorticostérone (11DOC) dans le cerveau et les tissus périphériques. Les données sont des moyennes ± SEM (n = 4–5). Colonnes rouges, contrôlez les souris non stressées (CTRL); colonnes vertes, souris exposées à une défaite sociale chronique (STRESS); BC, en dessous de la valeur la plus basse de la courbe d'étalonnage ; Hipp hippocampe, ganglion lymphatique mésentérique MLN. Les quantités de stéroïdes ont été converties en ng par mg de protéine. Valeurs significativement différentes entre les souris stressées et non stressées : ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05.

Semblable à CORT, le stress a augmenté de manière significative les niveaux tissulaires de ses précurseurs PROG et 11DOC (Fig. 2C, D; Fig. S1 supplémentaire en ligne). Pour les souris non stressées, l'ANOVA à une voie a montré des niveaux tissulaires significativement différents de PROG (ANOVA à une voie, F4,19 = 28,72, P <0,001), avec des niveaux inférieurs dans le cortex et la MLN que dans le côlon, l'hippocampe et le foie (P < 0,05 ou P < 0,001). L'effet du stress était évident dans tous les tissus sauf le foie et les différences entre les niveaux tissulaires de PROG persistaient chez les animaux stressés (ANOVA unidirectionnelle, F6, 27 = 12, 73, P <0, 001). Les niveaux de PROG dans l'hippocampe étaient significativement plus élevés que les niveaux de PROG dans tous les autres tissus (hipp. contre côlon ou cortex : P < 0,05 ; hipp. contre foie, rein ou MLN : P < 0,001 ; hipp. contre thymus P < 0,01). En ce qui concerne le 11DOC, le stress a augmenté de manière significative les niveaux locaux de ce stéroïde dans tous les tissus, à l'exception du foie (Fig. 2D). Le profilage du niveau tissulaire de 11DOC était très similaire à PROG (ANOVA unidirectionnelle ; souris non stressées : F6,27 = 33,26, P < 0,001, souris stressées : ANOVA unidirectionnelle, F6,28 = 10,17, P <0,001) et au niveau de 11DOC dans l'hippocampe des souris stressées était significativement plus élevée que dans tous les autres tissus (hippocampe vs côlon ou cortex : P < 0,05 ; hipp vs foie, rein, MLN ou thymus P < 0,001).

Pour explorer la pertinence fonctionnelle de 11HSD1 et 11HSD2 dans le cerveau et les tissus périphériques, le rapport CORT / 11DHC a été analysé (Fig. 3A; Fig. Supplémentaire S2 en ligne). Chez les animaux non stressés, ce rapport était similaire dans le plasma et les reins mais était 10 fois plus faible dans le côlon (ANOVA unidirectionnelle, F2,11 = 4,83, P < 0,05). En ce qui concerne les animaux stressés, le rapport CORT/11DHC différait significativement entre les tissus (ANOVA unidirectionnelle, F7,29 = 9,76, P < 0,001). Le rapport était significativement plus faible dans le côlon, le foie, les reins et le MLN que dans le plasma et le cerveau (P < 0,05 ou P < 0,01). De plus, le stress a significativement augmenté le rapport CORT/11DHC dans le plasma (P < 0,01) et l'a diminué dans le rein (P < 0,05).

Effet de la défaite sociale sur le profilage du rapport (A) CORT/11DHC, (B) PROG/11DOC, (C) CORT/PROG et (D) CORT/11DOC dans le cerveau, les tissus périphériques et le plasma. Les données sont des moyennes ± SEM (n = 3–5). Colonnes rouges, contrôlez les souris non stressées (CTRL); colonnes vertes, souris exposées à une défaite sociale chronique (STRESS); ND, non déterminé ; Hipp, hippocampe ; MLN, ganglion lymphatique mésentérique ; CORT, corticostérone ; 11DHC, 11-déhydrocorticostérone ; PROG, progestérone ; 11DOC, 11-désoxycorticostérone. Valeurs significativement différentes entre les souris stressées et non stressées : ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05.

Il est bien connu qu'en plus de la glande surrénale, il existe des tissus qui n'expriment que certaines enzymes de l'ensemble de la cascade de synthèse de novo des corticostéroïdes18,19. Par conséquent, nous avons décidé de calculer également d'autres ratios de stéroïdes dans des tissus individuels (Fig. 3; Fig. Supplémentaire S2 en ligne). Le stress a significativement diminué le rapport PROG/11DOC dans le côlon, l'hippocampe et le cortex, mais a augmenté le rapport dans la MLN et le plasma ; le stress n'a pas modifié le rapport dans le foie (Fig. 3B). Le profilage du rapport PROG / 11DOC a montré des différences tissulaires significatives à la fois chez les animaux non stressés (ANOVA à un facteur, F6, 22 = 51, 67, P <0, 001) et stressés (ANOVA à un facteur, F7, 31 = 18, 93, P < 0, 001). Chez les animaux stressés, le rapport PROG/11DOC était significativement plus élevé dans les organes lymphoïdes que dans les autres tissus (P < 0,001), alors que chez les souris non stressées, ce rapport était significativement plus faible dans le MLN et le plasma que dans les autres tissus (P < 0,001).

Par rapport aux ratios CORT/11DHC et PROG/11DOC, le stress a significativement augmenté les ratios CORT/PROG et CORT/11DOC dans le côlon, le cerveau et le foie (P < 0,01 ou P < 0,001) sans effet dans le plasma ou dans le plasma et rein, respectivement. (Fig. 3C, D ; Fig. S2 supplémentaire en ligne). Chez les souris non stressées, les deux ratios étaient plus de 13 fois plus élevés dans le plasma (plasma et rein pour CORT/11DOC) que dans le foie, le cerveau et le côlon (CORT/PROG : ANOVA unidirectionnelle, F4,16 = 15,42, P < 0,001 ; CORT/11DOC : ANOVA unidirectionnelle, F5,22 = 11,64, P < 0,001). En revanche, le rapport CORT/PROG chez les souris stressées atteignait la valeur la plus élevée dans le rein (P < 0,001), tandis que le rapport CORT/11DOC était le plus élevé dans le foie (foie contre rein P < 0,05 ; foie contre autre tissus P < 0,001) (CORT/PROG : ANOVA à un facteur, F7,31 = 23,49, P < 0,001 ; CORT/DOC : ANOVA à un facteur, F7,31 = 12,14, P < 0,001).

Pour la diversité α, le test de Kruskal – Wallis n'a révélé aucune différence statistiquement significative dans l'indice de Shannon (P = 0, 51) entre les trois groupes (Fig. 4A). La PCoA basée sur la distance de Bray Curtis (diversité α) a montré un effet de stress significatif sur la diversité du microbiome (R2 = 0,160, P = 0,038). Comme le montre la figure 4B, le groupe de souris stressées était centroïde, tandis que les groupes des deux groupes restants étaient largement dispersés. La composition relative du microbiote fécal au niveau du phylum et de la famille était similaire dans tous les groupes de souris, et il n'y avait pas de différence marquée entre les groupes de contrôle et de stress (P > 0,05). Les principaux phylums abondants étaient les Bacillota (anciennement connus sous le nom de Firmicutes) et les Bacteroidota (anciennement connus sous le nom de Bacteroidetes), tandis que les Lachnospiraceae et les Muribaculaceae étaient les familles les plus abondantes (Fig. 5A, B). Au niveau du genre, Muribaculaceae (anciennement connu sous le nom de S24-7) et Lachnospiraceae_NK4A136_group étaient les genres les plus abondants dans tous les groupes de souris (Fig. 5C). Pour élucider les taxons spécifiques du microbiome fécal dans les groupes stressés et non stressés, la méthode LEfSe (score LDA> 2) a été utilisée. Selon cette analyse (Fig. 5D,E), cinq genres bactériens étaient liés au stress dans le microbiote fécal : Alistipes, Rikenella, Ruminiclostridium 5, Roseburia et Helicobacter, alors que Ruminoclostridium 9 était le seul genre lié aux souris non stressées (groupe CTRL ). Les genres du groupe Prevotellaceae NK3B31 et Parasutterella ont été associés au microbiome fécal de souris avant traitement de stress (groupe STAEX).

Effet de la défaite sociale sur la diversité de la composition du microbiote intestinal. ( A ) Boîtes à moustaches illustrant la diversité α par l'indice de Shannon dans les microbiomes bactériens parmi différents groupes (test de Kruskal – Wallis, P = 0, 51). (B) La parcelle d'analyse des coordonnées principales (PCoA) basée sur la distance Bray-Curtis a montré des grappes distinctes parmi différents groupes. Le niveau de confiance de l'ellipse était de 95 %. STAEX, échantillons témoins prélevés avant la période de stress (n = 7) ; CTRL, échantillons de souris non stressées prélevés 1 mois plus tard puis échantillons du groupe STAEX (n = 5) ; STRESS, prélèvements d'animaux stressés pendant 1 mois.

Effet de la défaite sociale sur l'abondance relative des populations microbiennes intestinales aux niveaux du phylum (A), de la famille (B) et du genre (C). La taille de l'effet de l'analyse discriminante linéaire (LEfSe) au niveau des genres dans le microbiome intestinal entre les animaux stressés (groupe STRESS ; n = 5) et les animaux témoins (groupe CTRL ; n = 5) (D) et entre les animaux stressés (groupe STRESS) et les animaux avant le traitement du stress (groupe STAEX ; n = 7) (E).

Nous avons montré que : (i) les taux de CORT, 11DHC, PROG et DOC varient selon les tissus, (ii) les taux tissulaires locaux n'évoluent pas toujours parallèlement au taux plasmatique systémique, et (iii) le profil stéroïdien diffère entre les souris stressées et non stressées. Chez les animaux stressés, les niveaux de CORT ont été augmentés de 19 à 75 fois dans les tissus locaux par rapport à une augmentation de 26 fois dans le plasma. Les niveaux de PROG et de 11DOC étaient 1 à 30 fois plus élevés lors d'un stress dans les tissus locaux, tandis que le niveau plasmatique de PROG était augmenté de 45 fois et de 11DOC de 27 fois. Une régulation à la hausse similaire de CORT, PROG et 11DOC a été observée récemment dans le cerveau et le thymus de souris prépubères exposées à un stress aigu, bien que l'effet stimulant du stress soit moins prononcé que chez les animaux adultes30,31. Le 11DHC, un métabolite bien connu du 11HSD2, n'a pas été détecté dans la plupart des tissus des animaux non stressés, à l'exception des reins, du côlon et du plasma, dans lesquels le stress a augmenté les niveaux de 11DHC de 65, 40 et six fois, respectivement. Les niveaux non détectables de 11DHC dans les zones cérébrales et les organes lymphoïdes de souris non stressées sont incompatibles avec les données de Hamden et al.18 et Salehzadeh et al.32 qui ont rapporté des niveaux détectables de ce stéroïde dans le cerveau et le thymus. Les raisons de cet écart sont inconnues, mais la différence de sensibilité et de linéarité des méthodes utilisées pourrait en être une. De plus, des quantités mesurables de 11DHC ont été détectées dans le côlon et les reins de témoins non stressés, c'est-à-dire dans les tissus qui expriment une forte activité 11HSD2 déshydrogénase14 et où des concentrations locales plus élevées de 11DHC peuvent être attendues. Bien que 11HSD2 soit exprimé principalement dans les tissus cibles minéralocorticoïdes tels que le rein et le côlon14, l'expression de cette enzyme au niveau de l'ARNm ou de la protéine a également été démontrée dans certains autres organes, notamment le thymus, le MLN et la rate, souvent sans importance fonctionnelle claire32,33 ,34. Ainsi, la 11HSD2 pourrait être inactive dans des conditions basales dans l'hippocampe, le cortex et les organes lymphoïdes, ou la 11DHC d'origine sanguine pourrait être rapidement métabolisée par la 11HSD1 dans ces tissus. Une activité élevée de 11HSD1, qui régénère CORT à partir de 11DHC, a été montrée dans le foie, mais 11HSD1 a également été trouvée dans le cerveau, le thymus, la rate et MLN14,16,33.

Le stress a non seulement augmenté les niveaux plasmatiques et tissulaires de CORT au-dessus des valeurs des témoins non stressés, mais les niveaux dans l'hippocampe, le foie et les reins étaient également plus élevés que dans les autres tissus. Ces résultats suggèrent des différences de taux de CORT spécifiques aux tissus, qui peuvent être dues à la séquestration de CORT dans les tissus en se liant aux récepteurs MR et GR35 ou à la stéroïdogenèse locale et/ou au métabolisme de CORT et de 11DHC via les 11HSD. Il a été montré par d'autres que l'hippocampe des rats exposés à une défaite sociale chronique a un niveau de CORT plus élevé que le cortex24 et que la densité des récepteurs de corticostéroïdes hippocampiques est plus élevée que dans le cortex 36. Cependant, une augmentation significative des rapports CORT/PROG et CORT/11DOC du cerveau chez les souris stressées sans aucune modification des ratios plasmatiques correspondants (Fig. 3, Fig. S2 supplémentaire en ligne) et la capacité de l'hippocampe à convertir PROG en CORT37 donnent des preuves de la production locale de corticostérone. De plus, une expression élevée de 11HSD1 a été rapportée dans l'hippocampe38,39. Ainsi, l'augmentation du 11DHC due au métabolisme 11HSD2 du CORT périphérique pourrait contribuer davantage à l'augmentation du CORT cérébral. Le rapport CORT/11DHC, qui reflète la régénération et l'inactivation de la corticostérone via les 11HSD, était significativement plus élevé dans le plasma et le cerveau des souris stressées que dans leur côlon, rein, foie et MLN. Le faible rapport CORT/11DHC et les taux tissulaires relativement élevés de 11DHC dans le côlon et les reins d'animaux stressés sont cohérents avec l'activité élevée de 11HSD2 même si les deux tissus expriment 11HSD1 et 11HSD2. Considérant que 11HSD2 se lie à son substrat avec environ 100 fois plus d'affinité que 11HSD114, 11HSD2 peut jouer un rôle plus dominant dans le métabolisme des corticostéroïdes dans les tissus qui coexpriment les deux enzymes. Les valeurs plus élevées du rapport CORT/11DHC dans les zones cérébrales et partiellement dans le thymus que dans d'autres tissus associés à de faibles niveaux tissulaires de 11DHC suggèrent une régénération ou une accumulation locale différente de corticostérone. Le cerveau et les organes lymphoïdes sont des tissus où la 11HSD2 est absente ou son activité est limitée dans l'espace et très faible par rapport à la 11HSD1. Ces tissus montrent une activité significative de 11HSD1, régénérant CORT à partir de 11DHC16,33,39, et une défaite sociale chronique régulant à la hausse la régénération de CORT à partir de 11DHC à la fois dans les organes lymphoïdes33 et l'hippocampe40. Bien que la contribution des stéroïdes sanguins aux niveaux tissulaires ne puisse être exclue, Schliamser et al.41 ont montré que le contenu sanguin du tissu cérébral varie entre 0,26 et 0,7 % et Little et al.42 ont démontré que le niveau de CORT dans l'hippocampe et le cortex cérébral n'est pas significativement influencé par la perfusion saline avant l'ablation du cerveau.

Le stress induit non seulement une hypercorticostéronémie, mais régule également à la hausse les taux plasmatiques de PROG et de 11DOC, les précurseurs directs de CORT via la sécrétion des glandes surrénales4,43,44. Nous avons montré que le stress augmentait les niveaux de PROG et de 11DOC non seulement dans le plasma mais aussi dans d'autres tissus. Des niveaux élevés de PROG et de 11DOC dans le cerveau de souris stressées, en particulier dans l'hippocampe, peuvent indiquer non seulement l'accumulation de stéroïdes dans le sang, mais également la synthèse de novo de neurostéroïdes dans le cerveau45,46. Suite à un stress aigu lié à la nage, les niveaux de PROG et de 11DOC dans l'hippocampe et d'autres régions du cerveau ont augmenté d'une manière similaire à nos résultats5. Comme dans le cerveau, nous avons observé une augmentation des niveaux de PROG et de 11DOC dans les organes lymphoïdes de souris exposées au stress de la défaite sociale. Cependant, un point à noter est que, contrairement au tissu cérébral, le rapport PROG/11DOC dans les organes lymphoïdes a été significativement augmenté et non diminué. Il a été démontré précédemment que le thymus et certaines cellules immunitaires expriment des enzymes en amont nécessaires à la stéroïdogenèse de novo sans l'enzyme finale de synthèse des glucocorticoïdes Cyp11b1 et présentent des activités enzymatiques associées à la production de PREG, PROG et 11DOC9,10,12,13,48. De plus, le rapport PROG/11DOC était significativement plus élevé dans les organes lymphoïdes que ce rapport dans le plasma. Ainsi, l'augmentation du rapport dans le thymus et la MLN peut refléter un plus grand apport de stéroïdes circulants et leur séquestration dans les tissus lymphoïdes, y compris la liaison aux récepteurs appropriés, ou la régulation à la hausse de la synthèse locale de PROG soit de novo à partir du cholestérol, soit à partir d'un précurseur circulant. Les ratios CORT/PROG et CORT/11DOC élevés chez les animaux stressés reflètent probablement à la fois des différences dans la séquestration de CORT, PROG et 11DOC synthétisés de novo dans la glande surrénale et transportés par le sang vers les organes lymphoïdes mais aussi la régénération de CORT à partir de 11DHC16, 47.

De nombreuses études ont montré que le stress est associé à un microbiome hôte altéré ; des niveaux plus élevés de cortisol/corticostérone peuvent remodeler la composition microbienne de l'intestin, et le microbiote intestinal peut modifier les réponses au stress de l'hôte26,49,50. Nos résultats n'ont montré aucune différence significative dans la diversité α du microbiome fécal des souris stressées et non stressées, mais nous avons observé une différence significative dans la diversité β du microbiome fécal. De même, l'exposition des souris C57BL/6 et CD-1 à un facteur de stress social n'a pas affecté la diversité α du microbiote intestinal de l'hôte, mais elle a modifié la diversité β de manière significative49,50. Contrairement aux souris, une étude sur des nourrissons humains n'a prouvé aucune association entre la réponse au stress du cortisol et la diversité β, même si la diversité α était faiblement associée à la réponse au stress du cortisol51. Les abondances relatives des principaux phylums et familles étaient relativement similaires entre tous les groupes, révélant l'absence d'un changement direct dans la structure de la communauté, une découverte observée précédemment chez les souris C57BL/6 socialement vaincues52. Cependant, l'analyse LEfSe a identifié plusieurs genres bactériens associés au stress, tels que Alistipes, Rikenella, Ruminiclostridium, Roseburia et Helicobacter. Ces résultats sont cohérents avec des études antérieures, qui ont démontré une colonisation accrue de l'estomac par Helicobacter pylori chez des souris BALB/c exposées à un stress psychologique53, une régulation positive de Ruminoclostridium dans le microbiome fécal de lapins stressés par la chaleur54 et Alistipes chez des souris BALB/c exposées à un sol grillagé un stress chronique55 ou un stress répété lié à une immersion dans l'eau56. De même, Roseburia et Rikenella étaient positivement associées au stress dans le microbiome intestinal25,57,58. De plus, une corrélation positive a été observée entre les faibles niveaux de corticostérone et la faible abondance de Rikenella chez les rats stressés59. Cependant, dans d'autres études, le stress de contention chronique a entraîné des changements spectaculaires dans le microbiote du côlon au niveau du phylum et du genre, qui s'est accompagné d'une diminution des niveaux de Rikenella, Roseburia et Lachnospiraceae et d'une augmentation des niveaux de Prevotella50,60. Alors que le stress social réduisait l'abondance relative de Lactobacillus dans le microbiote intestinal des souris CD-149, il augmentait l'abondance relative de Lactobacillus chez les souris BALB/c (Fig. 5C). Ce résultat est en corrélation avec les données de Xu et al.61, qui ont montré des niveaux accrus de métabolites microbiens, dont le lactate, chez des rats exposés à un stress chronique. Ces observations indiquent que le stress affecte la diversité du microbiome et que certains taxons bactériens peuvent être considérés comme des biomarqueurs liés à l'exposition au stress.

En conclusion, nous avons exploré les niveaux locaux de corticostéroïdes dans plusieurs types de tissus chez des souris mâles non stressées et chroniquement stressées en utilisant un modèle animal de défaite sociale. L'étude a démontré une régulation à la hausse dépendante du stress des niveaux de CORT, 11DHC, PROG et 11DOC non seulement dans le plasma mais aussi dans le cerveau et d'autres tissus ; cependant, la réponse au stress dépendait des tissus et modulait la communauté microbienne fécale. Les résultats indiquent que le taux plasmatique de corticostéroïdes peut ne pas toujours représenter les niveaux locaux dans les tissus individuels et que l'exposition aux corticostéroïdes pendant le stress peut être affectée de manière dépendante des tissus. Cependant, cela laisse ouverte la question de savoir dans quelle mesure ces différences sont dues à l'étendue des activités enzymatiques stéroïdiennes et à l'accumulation de stéroïdes dans les tissus (degré de liaison aux récepteurs, flux sanguin dans les tissus, absorption tissulaire).

Les données produites au cours de l'étude en cours peuvent être mises à disposition auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable ou sont déposées dans la GenBank (données de séquençage ; numéro d'accession PRJNA896122).

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Les auteurs tiennent à remercier Ivana Muricová de l'Institut de physiologie, CAS, Prague, pour son soutien dans les activités quotidiennes associées à la période de stress et à la préparation des échantillons.

Cette étude a été soutenue par la Czech Science Foundation Grant 21-10845S (JP); l'Académie tchèque des sciences L200112201 (projet PPLZ ; MV) et le ministère de l'Agriculture de la République tchèque, soutien institutionnel MZE-RO0423 (VD).

Institut de physiologie, Académie tchèque des sciences, Vídeňská 1083, 142 00, Prague 4—Krč, République tchèque

Karla Vagnerová, Peter Ergang, Martin Vodička & Jiří Pácha

Quality and Plant Products, Crop Research Institute, Prague, République tchèque

Michal Jagr & Vaclav Dvořáček

Institut de physiologie et de génétique animales, Académie tchèque des sciences, Prague, République tchèque

Chahrazed Mekadim, Hana Sechovcová, Kateřina Olša Fliegerová & Jakub Mrázek

Faculté d'agrobiologie, alimentation et ressources naturelles, Département de microbiologie, nutrition et diététique, Université tchèque des sciences de la vie, Prague, République tchèque

Hana Sechovcova

Département de physiologie, Faculté des sciences, Université Charles, Prague, République tchèque

Jiří Pacha

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Conceptualisation et plan d'expériences : KV, MV et JP ; acquisition et analyse de données : MJ, CM, PE, HS, KOF, VD ; analyse et interprétation des données : KV, CM, JM, JP ; rédaction du manuscrit : KV, CM, JP ; financement acquisition : JP, MV et VD Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Karla Vagnerová.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Vagnerová, K., Jágr, M., Mekadim, C. et al. Profilage des corticostéroïdes surrénaliens dans le sang et les tissus locaux de souris au cours d'un stress chronique. Sci Rep 13, 7278 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34395-2

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Reçu : 05 janvier 2023

Accepté : 28 avril 2023

Publié: 04 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34395-2

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