Variations des teneurs en monomères de lignine et des rapports isotopiques stables de l'hydrogène dans les groupes méthoxy au cours de la biodégradation de la biomasse du jardin

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 8734 (2022) Citer cet article

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La lignine, un composant organique hautement polymérisé des cellules végétales, est l'une des substances aromatiques les plus difficiles à dégrader. La biodégradation sélective dans des conditions douces est une méthode prometteuse, mais les variations dynamiques des monomères de lignine au cours de la biodégradation de la lignocellulose ne sont pas entièrement comprises. Dans cette étude, nous avons évalué les différences de dégradation de la lignine sous différentes inoculations microbiennes en fonction de la teneur en monomère de lignine, du rapport de monomère et du rapport isotopique stable de l'hydrogène des groupes méthoxy de la lignine (δ2HLM). La perte de poids pendant la dégradation et la perte nette de composants lignocellulosiques se sont considérablement améliorées avec l'inoculation fongique. Le monolignol de syringyle (S-lignine), qui contient deux groupes méthoxy, était plus difficile à dégrader que le guaiacyl (G-lignine), qui ne contient qu'un seul groupe méthoxy. La co-culture de Pseudomonas mandelii et d'Aspergillus fumigatus a produit la plus grande diminution du rapport G/S, mais les valeurs de δ2HLM ne différaient pas significativement entre les trois expériences de biodégradation, bien que l'enrichissement ait été effectué dans le cadre de l'inoculation fongique. La fluctuation des valeurs de δ2HLM au cours de la phase initiale de biodégradation peut être liée à la perte de polysaccharides pectiques (un autre donneur de méthoxy), qui proviennent principalement des feuilles mortes. Dans l'ensemble, les signaux δ2HLM relatifs ont été préservés malgré la diminution des rapports G/S dans les trois systèmes de dégradation. Néanmoins, certains détails de la lignine δ2HLM en tant que biomarqueur des cycles biogéochimiques doivent être explorés plus avant.

Avec l'expansion mondiale rapide de l'urbanisation, la biomasse des jardins devient une composante majeure des déchets solides organiques1. Cependant, son élimination sans restriction gaspillerait une ressource potentiellement importante (c'est-à-dire la matière organique) et pourrait même devenir une source de pollution de l'environnement2. La biodégradation, y compris le compostage, a suscité une attention particulière en tant que moyen d'éliminer cette biomasse tout en récupérant efficacement les produits chimiques et les nutriments qui ont des applications commerciales ou une valeur écologique3,4. Les chercheurs ont montré que la biodégradation de cette biomasse dans des conditions contrôlées ou naturelles peut décomposer avec succès la matière lignocellulosique et permettre la production de produits organiques alternatifs potentiellement utiles par de multiples enzymes microbiennes agissant par différentes voies métaboliques5,6. Néanmoins, la dépolymérisation de la lignine est un défi particulier lors de la bioconversion en raison de l'hydrophobicité relative des polymères macromoléculaires et des propriétés antibactériennes des structures aromatiques7,8.

La lignine, la deuxième biomacromolécule la plus abondante, est principalement composée de trois unités 4-hydroxyphénylpropanoïdes : les monolignols de guaiacyle (G-lignine), les monolignols de syringyle (S-lignine) et des quantités mineures de monolignols de p-hydroxyphényle (H-lignine), avec les proportions correspondantes variant selon le type de plante et de tissu. Chez les plantes, ces monomères aromatiques sont fortement interconnectés par des liaisons aryl éther, biphényl éther, résinol, phényl-coumaran et diphényl, améliorant ainsi la résistance et la rigidité de ces molécules, ce qui les rend plus difficiles à dégrader pour les enzymes microbiennes et l'hydrolyse chimique9. De plus, étant donné que les composants de la lignine ont de multiples sites de clivage pour l'hydrolyse enzymatique et un potentiel d'oxydation élevé pour les radicaux libres non spécifiques, la biodégradation reste une approche efficace, rentable et écologique pour la dépolymérisation de la lignine10,11. Le processus biochimique complexe d'hydrolyse enzymatique de la lignine commence par la déconstruction pour former des hydrocarbures aromatiques hétérogènes, qui sont ensuite consommés par le métabolisme central du carbone12. En général, ces enzymes ligninolytiques (oxydases extracellulaires), qui comprennent la laccase, la peroxydase de manganèse et la peroxydase de lignine, sont principalement sécrétées par des champignons et certaines bactéries13,14. La plupart des recherches se sont concentrées sur le criblage pour identifier les micro-organismes dégradant la lignine et pour caractériser l'expression des activités multienzymatiques ; cependant, les études sur l'efficacité de la dégradation de la lignine par différents micro-organismes ont été négligées15.

Des études antérieures sur les transformations chimiques qui se produisent lors de la dépolymérisation de la lignine ont indiqué que le monolignol S-lignine, avec deux groupes méthoxy (OCH3) aux positions méta (positions 3 et 5) de la structure phénylpropanoïde, est plus difficile à dépolymériser que G- lignine (avec un seul groupe OCH3) et H-lignine (sans groupe OCH3)16,17,18. Ceci est principalement dû à la méthylation irréversible des alcools coniféryliques et sinapyliques (3/5-O-méthylation) via les acide caféique O-méthyltransférases, les caféoyl-CoA O-méthyltransférases, ou les deux, ce qui est différent de l'isomérisation des hydrocarbures aromatiques et de la liaison des chaînes latérales du propane lors de la biosynthèse des monolignols9. Par conséquent, ces groupes OCH3 stables ne sont pas seulement des marqueurs chimiques de différences structurelles dans les monomères de lignine mais également des précurseurs notables de nombreux composés organiques19. À ce jour, les groupes méthoxy de la lignine ont été largement utilisés dans la recherche sur la biogéochimie isotopique, l'écoclimatologie et l'authentification de l'origine de la matière organique en raison de la stabilité des liaisons CH, et parce que les isotopes stables de l'hydrogène et du carbone de la lignine (δ2HLM et δ13CLM) n'a pas échangé avec l'hydrogène et les atomes de carbone de l'eau de source ou des métabolites organiques20,21,22,23,24.

Il a été démontré que les valeurs δ2HLM des matières végétales enregistrent les signatures primaires de la biosynthèse de la lignine et la composition δ2H (δ2HPre) des précipitations locales21. Cela est dû au fractionnement isotopique robuste (εapp = − 216 ± 19 mUr) entre la plante δ2HLM et les précipitations δ2HPre, qui est contrôlée par la température de l'air dans les régions de latitude moyenne25,26. La plupart des études sur les valeurs de δ2HLM les ont appliquées pour reconstruire le paléoclimat27,28,29,30, pour différencier les processus biogéochimiques20,22 et pour retracer l'origine géographique de la matière organique31,32. Cependant, l'application analytique du δ2HLM pour étudier la dégradation des matières végétales a été rarement rapportée. Une étude récente a combiné l'analyse de la teneur en groupes méthoxy de la matière organique avec ses valeurs δ2HLM et δ13CLM pour étudier l'effet de la dégradation de la litière végétale sur l'authenticité isotopique33. Bien que la perte totale de masse totale de la litière et la modification de la composition des groupes méthoxy dans la litière n'aient pas eu d'impact essentiel sur les signatures δ2HLM au cours de la biodégradation naturelle, nous manquons encore de connaissances détaillées sur la variabilité du δ2HLM au cours de la dégradation biotique et abiotique, en particulier en termes de rôles et de caractéristiques différents de la dégradation bactérienne par rapport à la dégradation fongique. De plus, des recherches antérieures se sont davantage concentrées sur les capacités d'adsorption et les efficacités de conversion des enzymes pour la lignine34, et nous n'avons trouvé aucune étude décrivant les variations dynamiques des monomères de lignine et leurs caractéristiques δ2HLM lors de la dégradation de la lignine par différents micro-organismes. Fournir les informations manquantes serait d'une valeur considérable pour élargir notre capacité à effectuer la caractérisation structurelle de la lignine et à appliquer cette substance comme biomarqueur pour les traceurs environnementaux dans les cycles biogéochimiques et la décomposition de la matière organique.

Pour répondre à ces limites de nos connaissances, nous avons conçu la présente enquête pour comparer les variations de la lignine au cours de la biodégradation de la biomasse de jardin. Nous avons choisi des souches fongiques et bactériennes qui s'étaient précédemment révélées actives dans la biodégradation de la lignine et testé leur efficacité de biodégradation à la fois séparément et en combinaison dans des conditions thermophiles contrôlées in vitro. Les analyses par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS) et chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse à rapport isotopique (GC-IRMS) des résidus de dégradation à des intervalles de 2 jours au cours d'une culture de 15 jours ont été effectuées. Nous avons émis l'hypothèse que la teneur en monomères de lignine et les valeurs de δ2HLM changeraient indépendamment et révéleraient les différents rôles relatifs des bactéries par rapport aux champignons dans la biodégradation. Nos objectifs spécifiques étaient (1) d'étudier la variabilité de la dégradation de la lignine par Pseudomonas mandelii, Aspergillus fumigatus et leur co-culture, et (2) d'évaluer les caractéristiques dynamiques de la dégradation de la lignine en fonction du rapport des deux principaux monomères et de leur δ2HLM valeurs dans les résidus de dégradation. Nous avons constaté que la spécialisation de la structure méthoxy de la lignine et l'hydrolyse sélective au cours de l'action microbienne produisaient un rapport déséquilibré des deux monomères, mais que les valeurs de δ2HLM, avec un fractionnement robuste, restaient essentiellement constantes.

Nous avons utilisé une biomasse de jardin multisource composée de litière de feuilles, de bois mort et de résidus d'élagage horticole collectés au Jardin botanique de Xi'an (Shaanxi, Chine). Chaque composant a été coupé avec un sécateur en fragments d'environ 1 cm de long et soigneusement mélangés pour créer des échantillons regroupés avec des proportions pondérales égales de chaque matériau. Les mélanges homogènes ont ensuite été versés dans des flacons coniques en verre. La principale composition chimique des matériaux en vrac est la cellulose (32 %), l'hémicellulose (17 %) et la lignine totale (27 %), qui contient des monomères de lignine dans les proportions suivantes : G-lignine (10,0 %), S-lignine ( 13,6 %) et les groupes méthoxy totaux (5,7 %).

Les inoculats microbiens utilisés dans cette étude étaient la bactérie Pseudomonas mandelii (souche QL-1, ci-après « PM »), le champignon Aspergillus fumigatus (souche QL-4, ci-après « AF »), et la combinaison des deux souches (combinaison de QL-1 et QL-4, ci-après "PM + AF"). Ces souches dégradant la lignine ont été isolées de l'humus du sol dans le sous-étage d'une forêt naturelle dans les montagnes Qinling dans le centre de la Chine en septembre 2019 et ont été identifiées au moyen de l'ADN ribosomal 16S et du séquençage d'espaceur transcrit en interne à Beijing Liuhe BGI Technology Co., Ltd. (Pékin, Chine) (Fig. S1 supplémentaire). Nous avons utilisé un étalon interne de qualité chromatographique (tétracosane, 99,5 %) et le réactif de réaction (acide iodhydrique, 55–58 %) acheté chez Macklin (Shanghai, Chine). Tous les autres produits chimiques étaient de qualité analytique et achetés auprès de Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. (Tianjin, Chine).

Avant l'expérience de biodégradation, tous les matériaux de biomasse ont été soigneusement homogénéisés à l'aide d'un oscillateur vortex (5 min), stérilisés à haute température (121 ° C) et sous pression (103 kPa) pendant 20 min, puis séchés dans un four à 85 ° C pendant 8h. Pour capturer la variation des monomères de lignine et des valeurs δ2HLM des résidus de dégradation, nous avons effectué des expériences de biodégradation à la fois séparément pour chaque microbe (PM et AF) et en utilisant leur combinaison en tant que co-culture (PM + AF). Pour les souches microbiennes séparées, nous avons utilisé des suspensions liquides avec des concentrations cellulaires similaires (107 à 108 UFC/mL), qui ont été cultivées dans un milieu Luria-Bertani pour PM et un milieu gélosé au dextrose de pomme de terre pour AF, tous deux à 30 ° C avec agitation 150 tr/min. . La suspension de co-culture a été produite en mélangeant le même volume total (30 ml) utilisé dans les suspensions à souche unique.

La configuration expérimentale et le fonctionnement ont suivi la méthode de Yoon et Ji35 avec de légères modifications. En résumé, nous avons ajouté 30 mL de tampon d'acide phosphorique à 5 mmol/L (pH 7,0) dans une fiole conique de 250 mL contenant 5 g de la biomasse de jardin homogénéisée. Par la suite, nous avons inoculé 0,5 mL de la suspension cultivée (un rapport volume/masse de substrat de 10 %) dans le flacon, puis nous avons scellé l'ouverture avec un film respirant (Mlbio, Shanghai, Chine). Nous avons utilisé le même volume (0,5 ml) d'eau stérile comme traitement témoin, qui comprenait 30 ml de la solution tampon. Les expériences de biodégradation ont ensuite été réalisées dans l'obscurité à l'aide d'un incubateur à agitation à 45 °C et 150 tr/min pendant 15 jours. Nous avons créé 84 lots (trois répétitions dans une période de mesure donnée pour les trois inoculations et le contrôle) à utiliser dans sept périodes d'échantillonnage.

Nous avons observé l'état de dégradation quotidiennement et ajouté de l'eau stérile, si nécessaire, pour maintenir un volume de solution constant. Nous avons collecté trois lots répétés de résidus de dégradation par expérience sous forme d'échantillons analytiques les jours 3, 5, 7, 9, 11, 13 et 15. Les échantillons initiaux du jour 1 ont été obtenus avant de commencer l'expérience de dégradation. Les échantillons ont été lavés trois fois avec 15 ml d'eau stérile, filtrés et les solides ont ensuite été séchés (85 ° C) jusqu'à poids constant. La perte de poids par dégradation (DWL, %) de la biomasse du jardin a été calculée comme suit :

où Mb est la quantité initiale de matières (5 g) avant biodégradation, et Ma représente la valeur après biodégradation pour le traitement expérimental ou témoin au jour n de biodégradation. La perte nette de dégradation (NDL, %) de la biomasse du jardin était la différence de DWL entre l'expérience d'inoculation et le témoin non inoculé. Les échantillons analytiques ont été broyés (à un diamètre < 0,1 mm) avant la mesure de la teneur en lignine monomère et lignine méthoxy δ2HLM.

Des analyses qualitatives et quantitatives des monomères de lignine ont été effectuées à l'aide de la réaction de thioacidolyse, qui peut cliver efficacement les liaisons éther des monolignols de lignine et donner des dérivés de thioester36. La composition des monomères de lignine dans les résidus de dégradation a été mesurée à l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse (GC) 7890B équipé d'un auto-injecteur G4513A, couplé à un spectromètre de masse 7000D (GC-MS; Agilent, USA). Le GC a été équipé d'une colonne HP-5MS (30 m × 0,32 mm × 0,25 µm ; Agilent) et les conditions suivantes ont été utilisées : température d'entrée 250 °C, volume d'injection 1 μL, injection fractionnée (10:1), four initial température à 150 °C pendant 2 min, rampe à 20 °C/min jusqu'à 250 °C et maintien pendant 5 min. L'hélium a été utilisé comme gaz porteur à un débit constant de 1,0 mL/min. Les conditions MS suivantes ont été utilisées : mode d'ionisation d'électrons (EI), température de la source d'ions 230 °C, température d'interface 250 °C, énergie des électrons 70 eV, délai de solvant 3,5 min, plage de balayage de 40 à 650 amu. La GC-MS a été exécutée en mode de surveillance sélective des ions pour les ions moléculaires et les temps de rétention suivants : m/z 269 pour le dérivé de lignine G à 17,5 min, m/z 299 pour le dérivé de lignine S à 20,8 min et m/ z 338 pour l'étalon interne tétracosane à 12,7 min.

La détermination finale de la teneur en monomère de lignine a suivi la méthode de Lapierre37, où le facteur de réponse (k) était égal au rapport de la concentration relative à l'aire relative entre l'étalon interne et l'échantillon cible :

où k était égal à 1,5, Cs et Ci représentent les concentrations des dérivés monomères de lignine et du tétracosane, respectivement, et As et Ai représentent les aires des pics correspondants. De plus, nous avons supposé que la réaction de thioacidolyse était suffisante et complète dans cette étude, et avons défini la conversion du substrat et la récupération de l'étalon interne à 100 %38,39. Nous avons ensuite converti la teneur en monomère de lignine de l'échantillon en quantités de lignine G et S en utilisant le rapport du poids moléculaire entre les monolignols et leurs dérivés (0,67 pour la lignine G et 0,70 pour la lignine S)36. La perte nette de dégradation (NDL, %) de la G-lignine et de la S-lignine était la différence de teneur en monomère de lignine entre les expériences d'inoculation et le témoin non inoculé, et le taux de perte nette de dégradation (NDR, %·jour−1) était défini comme la perte nette de dégradation des monomères de lignine à chaque étape de dégradation. Pour plus de détails sur la réaction de thioacidolyse, les conditions GC – MS et le tableau chromatographique, veuillez vous reporter aux informations supplémentaires (Figs. Supplémentaires S2, S3a; Texte supplémentaire S1.1).

Les valeurs δ2HLM des échantillons analytiques en poudre ont été mesurées en tant qu'iodométhane de l'espace de tête (CH3I), libéré par la réaction de substitution sélective entre les groupes méthoxy des résidus de dégradation et l'acide iodhydrique (HI). Nous avons suivi les méthodes établies de Keppler et al.21 et Greule et al.40 avec des modifications mineures29. Plus précisément, 0,5 ml de HI a été ajouté aux résidus de dégradation (10 ± 0,5 mg) dans un flacon en verre à sertir brun (1,5 ml; Agilent) contenant un petit aimant. Le flacon a été scellé avec des bouchons en aluminium contenant des septa en caoutchouc butyle doublés de PTFE (sertissage de 11 mm et épaisseur de 0,9 mm) et agité dans un bain d'huile à 120 ° C pendant 30 min. Cette température de conversion était une valeur pondérée basée sur la validation par Keppler et al.21 à 110 °C et Greule et al.40 à 130 °C. Après incubation, les sous-échantillons ont pu s'équilibrer à 22 ± 0,5 °C (dans une salle climatisée) pendant au moins 40 min. Enfin, une aliquote (80 à 100 μL) de CH3I a été directement injectée dans le système analytique à l'aide d'une seringue manuelle étanche aux gaz (100 μL ; Hamilton, USA).

Les valeurs δ2HLM de CH3I ont été mesurées à l'aide d'un GC TRACE 1310 couplé à un spectromètre de masse à rapport isotopique ISOLINK II Delta V Advantage (IRMS) via un réacteur de conversion thermique (tube en céramique [Al2O3], longueur 320 mm, 0,5 mm id, température du réacteur 1400 °C) (Thermo Fisher, Allemagne). Les mesures ont été effectuées au laboratoire de biogéochimie de l'Université normale du Shaanxi. Le GC a été équipé d'une colonne TG-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm ; Thermo Fisher), et basé sur les paramètres suivants : température d'entrée 200 °C, injection fractionnée (12:1), température initiale du four à 40 °C pendant 3,8 min, rampe à 20 °C/min à 80 °C et maintien pendant 1 min, puis rampe à 40 °C/min jusqu'à une température finale de 100 °C et maintien pendant 3 min. L'hélium a été utilisé comme gaz porteur à un débit constant de 0,8 mL/min. De l'hydrogène gazeux de haute pureté (99,999 % ; Beijing AP Baif Gases Industry Co., Chine) a été utilisé comme gaz de surveillance. Le facteur H3+ variait de 4,7 à 5,0 ppm/nA pendant la période de mesure.

Pour améliorer la précision, la mesure doit suivre le principe de traitement identique pour les échantillons analytiques et les matériaux de référence, et les valeurs de δ2HLM doivent être normalisées par un étalonnage en deux points37. Cependant, en raison du manque d'échantillons commerciaux disponibles avec de vraies valeurs δ2HLM comme matériaux de référence, nous n'avons pu utiliser que deux échantillons de bois homogénéisés provenant de différents emplacements géographiques et espèces d'arbres pour examiner la stabilité et le parallélisme des résultats GC-IRMS. Ces deux échantillons de bois ont été récemment mesurés par le laboratoire de Frank Keppler à l'Université de Heidelberg par rapport aux normes de ce laboratoire41. Par conséquent, les données δ2HLM rapportées dans cette étude ont été exprimées par rapport à l'hydrogène gazeux de surveillance et calibrées par rapport à nos normes internes. De plus, les milli-Ureys (mUr) ont été utilisés comme unité des valeurs isotopiques δ au lieu de l'échelle V-SMOW (Vienna Standard Mean Ocean Water) en pour mille (‰)42. Les écarts-types (n = 3 ou 7, 1σ) variaient de 0,6 à 2,4 mUr. Pour plus de détails sur la réaction de substitution, les conditions de mesure, la méthode de correction et les cartes chromatographiques, veuillez vous reporter aux informations supplémentaires (Fig. S2, S3b et texte supplémentaire S1.2).

Les données rapportées sont la moyenne ± écart type des trois expériences répétées. La signification statistique des mesures a été évaluée par une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA, avec une signification à P < 0,05), et lorsque les résultats de l'ANOVA étaient significatifs, nous avons utilisé le test HSD de Tukey pour identifier les paires de valeurs qui différaient significativement entre la dégradation expériences.

La figure 1 et le tableau supplémentaire S1 montrent la perte de poids par dégradation (DWL, %) et la perte nette par dégradation (NDL, %) de la biomasse du jardin à des intervalles de 2 jours pendant la période d'étude. À un stade de dégradation donné, les deux microbes étaient capables de dégrader la biomasse lignocellulosique, mais la co-culture des micro-organismes a fréquemment atteint une dégradation significativement (P < 0,05) plus importante. Dans les expériences de dégradation de 15 jours, la valeur DWL de la bactérie (expérience PM) est passée de 4,3 % (jour 3) à 18,9 % (jour 15), et la valeur NDL correspondante est passée de 3,1 à 11,9 % avec un ajustement linéaire et une pente de 1,16 (P < 0,001). La valeur DWL finale pour le champignon (expérience AF) a augmenté à 23,9 % et la valeur NDL est passée de 3,9 à 17,0 % au cours de la période d'étude avec une pente de 1,68 (P < 0,001). Cela a montré que le champignon pouvait rapidement dégrader ou fermenter les composants de la lignocellulose en divers bioproduits au moyen d'une hydrolyse enzymatique. Comme prévu, l'efficacité de la biodégradation dans la co-culture (expérience PM + AF) était généralement supérieure à celle des souches individuelles, avec une valeur DWL finale aussi élevée que 26,7 % et une pente ajustée de 1,75 (P < 0,001) pour NDL . Habituellement, un mélange symbiotique multi-espèces est la meilleure approche pour favoriser la production d'enzymes diverses et les effets synergiques43. Cela pourrait expliquer pourquoi la co-culture de différentes espèces peut déclencher plus de réponses aux signaux chimiques qu'il ne serait possible avec un seul champignon ou bactérie44.

Les changements dans la perte de poids de dégradation (DWL) et la perte de dégradation nette (NDL, la différence de la valeur DWL entre l'expérience d'inoculation et le contrôle non inoculé) pour la biomasse du jardin au cours des expériences de 15 jours, avec des mesures à intervalles de 2 jours. Les équations et les lignes pointillées représentent l'ajustement linéaire de la NDL au cours des expériences de 15 jours. Expériences : Con., contrôle non inoculé ; PM, Pseudomonas mandelii; AF, Aspergillus fumigatus; PM + AF, co-culture des deux microbes. Les barres à une date donnée étiquetées avec des lettres différentes diffèrent significativement (P < 0,05) entre les quatre traitements.

L'efficacité de conversion des substances dégradées a montré une forte augmentation à partir du jour 7, en particulier dans les expériences d'inoculation fongique (AF et PM + AF). Les petites molécules telles que les acides aminés sont d'abord métabolisées par les micro-organismes, suivies par les précurseurs (c'est-à-dire le cellobiose, le xylose et les oligomères) de substances macromoléculaires réfractaires3,45. À l'exception de certains matériaux ayant une bonne thermosolubilité, ces substances dégradées sont principalement dérivées d'unités polysaccharidiques et peuvent être préférentiellement métabolisées par des microorganismes en tant que sources de carbone et d'énergie. Ainsi, une hydrolyse efficace de la cellulose et de l'hémicellulose était évidente aux premiers stades des trois expériences d'inoculation. Des études antérieures ont rapporté que les champignons filamenteux dégradant la lignocellulose, y compris les espèces Aspergillus, Trichoderma, Penicillium et Chaetomium, peuvent sécréter efficacement une gamme d'enzymes lignocellulosiques, avec une activité enzymatique extracellulaire élevée2,46. Bien que A. fumigatus et P. mandelii dans cette étude appartiennent au groupe des micro-organismes décomposant la litière de feuilles, l'efficacité de dégradation la plus élevée a été obtenue dans la co-culture. Selon Miao et al.47, les activités des principales cellulases et xylanase sécrétées par A. fumigatus sont restées relativement faibles pendant les 3 premiers jours, et leurs valeurs maximales avec la croissance du mycélium étaient généralement obtenues vers le 6ème jour. En revanche, les enzymes de P. mandelii, une bactérie adaptée au froid, peuvent avoir affiché une faible activité catalytique en raison de la température modérée à élevée (avec culture à 45 °C pendant 15 jours)48. Parmi ces enzymes dépendantes de la température, les glucosidases extracellulaires et les cellobiohydrolases avaient une préférence de substrat pour l'hydrolyse des polysaccharides. Par conséquent, le consortium fongique-bactérien combiné présente un avantage unique en matière de biodégradation en raison des synergies entre les espèces et les enzymes49.

Les changements dans la teneur en monomères de lignine (lignine G et S) ont montré des schémas similaires dans les expériences PM, AF et PM + AF (Figs. 2, 3). Au cours des 5 premiers jours, les teneurs en G-lignine et S-lignine ont légèrement diminué, passant de 10,0 % et 13,6 % à 9,6 % et 13,0 %, respectivement, pour les PM, à 9,5 % et 13,1 % pour la FA, et à 8,9 % et 12,8 % pour PM + AF (tableau supplémentaire S2). Les jours suivants, la diminution de la lignine G était particulièrement significative par rapport à la lignine S (Fig. 2a, b). À la fin de la période de dégradation (jour 15), la teneur en G-lignine dans les expériences fongiques AF et PM + AF avait diminué de 5,1 et 6,7 points de pourcentage, respectivement, alors que la S-lignine n'avait diminué que de 3,4 et 3,8 points de pourcentage, respectivement (tableau 1). Dans l'ensemble, la somme des teneurs en G et S-lignine a diminué de 4, 5, 8, 5 et 10, 5 points de pourcentage dans les trois inoculations, respectivement (Fig. 2c, Tableau 1). De plus, les valeurs NDL de la G-lignine étaient beaucoup plus élevées que celles de la S-lignine après le jour 7 (tableau supplémentaire S3). Bien que les ajustements linéaires correspondants pour les deux monomères de lignine aient été significatifs sur toute la période de dégradation, la pente et la signification des équations pour les trois expériences différaient, la pente étant la plus élevée pour PM + AF, suivi de AF et PM (Fig. 3a). Ce résultat est cohérent avec la perte de poids de dégradation totale de la biomasse lignocellulosique et démontre qu'une dégradation rapide s'est produite dans le système de co-culture. De plus, le taux net de perte par dégradation (NDR) de la teneur en G-lignine a montré des augmentations différentes mais significatives tout au long des expériences de dégradation, alors que pour la S-lignine, le NDR a augmenté de manière significative entre les traitements PM et PM + AF (Fig. 3b, Fig. S4 supplémentaire). ). Ces résultats suggèrent que le champignon avait une forte capacité de dégradation et une certaine sélectivité pour la G-lignine, en particulier dans le mode de co-culture avec la bactérie et le champignon.

Variations temporelles de la teneur en (a) guaiacyl monolignol (G-lignine), (b) syringyl monolignol (S-lignine), et (c) la somme des deux monolignols (G&S-lignine) dans les résidus de dégradation au cours des 15 expériences d'une journée, avec des mesures à intervalles de 2 jours. Expériences : Con., contrôle non inoculé ; PM, Pseudomonas mandelii; AF, Aspergillus fumigatus; PM + AF, co-culture des deux microbes. Les barres à une date donnée étiquetées avec des lettres différentes diffèrent significativement (P < 0,05) entre les quatre traitements.

Perte nette de monomères de guaiacyl monolignol (G-lignine) et de syringyl monolignol (S-lignine) dans les trois expériences d'inoculation : (a) perte nette de dégradation (NDL, la différence de teneur en monomère de lignine entre les expériences d'inoculation et le témoin non inoculé) et (b) taux net de perte par dégradation (NDR, le NDL à la fin de l'incubation divisé par la durée de l'incubation, en jours). Les équations et les lignes pointillées représentent l'ajustement linéaire du NDL en fonction du temps au cours des expériences de 15 jours. Dans les boîtes à moustaches, les carrés blancs représentent les valeurs moyennes, les lignes horizontales représentent les valeurs médianes, les cases représentent les 25e au 75e centiles et les moustaches représentent l'intervalle de confiance à 95 %. Expériences : PM, Pseudomonas mandelii ; AF, Aspergillus fumigatus; PM + AF, co-culture des deux microbes. Les barres à travers toutes les dates étiquetées avec des lettres différentes diffèrent significativement (P < 0,05) entre les quatre traitements.

Des rapports antérieurs sur l'utilisation microbienne des matériaux lignocellulosiques et la dépolymérisation de la lignine ont démontré que la lignine était décomposée en petits composés aromatiques par des oxydases extracellulaires sécrétées par plusieurs micro-organismes, y compris des champignons et des bactéries14,15,50,51. Ces enzymes ligninolytiques sont constituées d'au moins deux types : les peroxydases contenant de l'hème (comme la lignine peroxydase, la manganèse peroxydase et certaines peroxydases polyvalentes) et la phénol oxydase (laccase). Ils peuvent tous générer des radicaux libres instables pour attaquer et cliver les liaisons chimiques. Généralement, les champignons dégradant la lignine peuvent sécréter une variété d'enzymes oxydantes, qui ont une sélectivité d'hydrolyse enzymatique et une efficacité catalytique plus fortes et sont donc mieux à même de rompre les liaisons intra- et inter-monomères et les anneaux aromatiques par des voies oxydatives spécifiques et non spécifiques52,53 . En revanche, les bactéries décomposent la lignine plus lentement que les champignons, car elles ont moins d'oxydases et les champignons sont moins sensibles aux caractéristiques antibactériennes et hydrophobes des aromatiques résultants54,55. Comme le montrent les Fig. 2 et 3, les résultats d'incubation ont démontré que l'inoculum fongique a une plus grande capacité à décomposer la lignine, ainsi que d'autres substrats lignocellulosiques. Les efficacités de dégradation les plus élevées pour la G-lignine et la S-lignine étaient dans l'expérience de co-culture, qui peut avoir résulté de l'action combinée de différentes enzymes et d'effets synergiques parmi les enzymes extracellulaires46,49.

Dans les voies de dégradation biochimique de la lignine, les polymères de lignine sont d'abord dépolymérisés en monomères par catalyse microbienne, suivis d'un catabolisme aromatique, puis sont ensuite dégradés par clivage des cycles aromatiques et incorporation dans le cycle de l'acide citrique15. La différence structurelle causée par la spécificité méthoxy des différentes enzymes (Fig. 4a, b) est la principale raison pour laquelle la G- et la S-lignine suivent des voies métaboliques aromatiques différentes, l'acide férulique et l'acide syringique agissant comme les produits de dégradation initiaux de la dégradation de la G-lignine et de la S-lignine, respectivement (Fig. 4c). En général, l'acide férulique (issu de la G-lignine) peut être transformé en acide vanillique intermédiaire via une décarboxylation non oxydative, une β-oxydation/non-β-oxydation dépendante de CoA et des voies de réduction des chaînes latérales56. Sous la catalyse de la vanillate-O-déméthylase, l'acide vanillique est finalement déméthylé en acide protocatéchuique57. En revanche, l'acide syringique (S-lignine) est d'abord déméthylé pour former le 3-O-méthylgallate intermédiaire par la O-déméthylase dépendante de la tétrahydrofolate, puis catalysé en 4-oxalomésaconate par une série de voies de clivage, de déméthylation et de carboxylation via plusieurs voies. enzymes métaboliques58. Enfin, ces substances aromatiques de faible poids moléculaire dérivées de la lignine deviennent des sources de carbone et d'autres matériaux pour la croissance et le métabolisme des cellules microbiennes54.

Les (a) structures chimiques, (b) les structures polymères et (c) les voies de biodégradation des composés aromatiques à base de lignine15. Lip, lignine peroxydase; Mnp, peroxydase de manganèse; Vp, peroxydase polyvalente.

De plus, combiné à l'irréversibilité de la méthylation dans la biosynthèse de la lignine9, nous avons observé que la S-lignine est plus difficile à dégrader que la G-lignine, peut-être en raison de la stabilité chimique des groupements méthoxy ou encore de l'inhibition biologique des activités enzymatiques59. Par exemple, l'analyse GC-MS a montré que certains dérivés monomères contenant des groupes méthoxy, tels que l'acide 3-méthylbutanoïque, le 5-méthyl-5-propylnonane, le 3-méthyl-2-butanol, le 2-méthoxyphénol et le 4-méthyltridécane, pouvaient être facilement détecté pendant le processus de dégradation de la lignine8,60. La présence de ces métabolites intermédiaires suggère que la libération de groupes méthoxy à partir de substrats aromatiques est la principale voie métabolique pour la dépolymérisation de la lignine, bien que les groupes méthoxy puissent être utilisés comme source C1 pour la biosynthèse de la méthionine61. Par conséquent, nos résultats pourraient indiquer que la sélectivité enzymatique du métabolisme microbien et la spécificité structurelle des groupes méthoxy contribuent ensemble aux différences observées dans les monomères de lignine au cours de la biodégradation.

Nous avons en outre caractérisé les caractéristiques changeantes de la dégradation de la lignine en utilisant les rapports de monomère de lignine (G/S) et les valeurs de méthoxy δ2HLM. Les rapports G / S des résidus de dégradation dans les trois expériences d'inoculation ont montré différents taux de diminution à partir de la valeur initiale du rapport de 0, 74 (Fig. 5a, Tableaux 1 et Tableau supplémentaire S4). La plus forte diminution du rapport G/S s'est produite dans l'expérience PM + AF, avec une valeur finale de 0,33, suivie de l'expérience AF (0,47) et de l'expérience PM (0,58). En revanche, le rapport G / S dans l'expérience témoin non inoculée est resté essentiellement constant (0, 73 ± 0, 01) tout au long de la période de dégradation (Fig. 5a). De plus, sur la base du rapport théorique de masse moléculaire relative des groupes méthoxy aux monomères de lignine (17,2 % pour la G-lignine et 29,5 % pour la S-lignine), nous avons calculé que la teneur en groupes méthoxy des résidus de dégradation a diminué des 5,7 % initiaux à une valeur finale de 3,2 % (PM + AF), contre 3,9 % (AF) et 4,8 % (PM) (Tableau 1). Ces résultats confirment davantage nos observations selon lesquelles la lignine G est plus susceptible de se dégrader que la lignine S et que les deux formes de dégradation se produisent plus rapidement dans les expériences d'inoculation fongique.

Variations temporelles dans (a) le rapport des monomères de lignine (G-lignine/S-lignine, G/S) et (b) les valeurs des isotopes stables de l'hydrogène (δ2HLM) des groupes méthoxy de la lignine dans les résidus de dégradation. Les équations et les lignes représentent l'ajustement linéaire du rapport G/S sur les expériences de 15 jours. Dans les boîtes à moustaches, les carrés blancs représentent les valeurs moyennes, les lignes horizontales représentent les valeurs médianes, les cases représentent les 25e au 75e centiles, les moustaches représentent l'intervalle de confiance à 95 % et le losange vert représente les valeurs aberrantes. Les barres étiquetées avec des lettres différentes diffèrent significativement (P < 0,05). Ini., valeur initiale δ2HLM du matériau en vrac ; Con., contrôle non inoculé ; PM, Pseudomonas mandelii; AF, Aspergillus fumigatus; PM + AF (P + A), co-culture des deux microbes.

La valeur moyenne initiale δ2HLM du matériau en vrac avant les expériences de dégradation était de − 230,4 ± 1,5 mUr, ce qui est proche de la valeur (− 233,6 ± 9,4 mUr, n = 119) dans les mesures pluriannuelles de bois de cernes de notre groupe de recherche. (manuscrit en cours de révision). Parce que ces échantillons de bois d'arbres ont été collectés dans les montagnes Qinling, à seulement 30 km de l'endroit où nous avons collecté des échantillons de biomasse de jardin dans la présente étude, la cohérence des deux ensembles de valeurs δ2HLM suggère une cohérence avec l'eau de source de la plante (c'est-à-dire les précipitations locales). De plus, bien que les valeurs de δ2HLM dans les différentes expériences de culture aient fluctué après environ 5 jours de dégradation, les valeurs de δ2HLM mesurées n'ont pas changé de manière significative (ANOVA, P <0, 05) pendant toute la période de dégradation (tableau supplémentaire S5). Bien que le matériel expérimental utilisé dans cette étude soit un mélange de biomasse de jardin multi-sources, la litière végétale contient généralement des proportions à peu près égales de lignine et de pectine62. Les polysaccharides pectiques, un autre donneur de méthoxy aromatique, sont abondants dans les parois cellulaires des feuilles des plantes et sont facilement hydrolysés avec la cellulose et l'hémicellulose63. Selon Anhäuser et al.33, le décalage des valeurs de δ2HLM au début de la dégradation pourrait résulter de la contribution de la pectine, dont les groupements méthoxy n'ont pas été analysés séparément de la lignine. De plus, la S-adénosylméthionine est le donneur de groupe méthoxyle commun pour la biosynthèse de la G-lignine et de la S-lignine, mais le cycle aromatique est méthylé en position 3, en position 5 ou les deux via différentes O-méthyltransférases9. Par conséquent, la présence de ces variations dans les valeurs de δ2HLM suggère que la production de groupes méthoxy à partir des monomères de lignine et de la pectine n'est pas négligeable33.

De manière significative, l'expérience de co-culture a montré la plus grande diminution du rapport G / S et la perte de groupes méthoxy, n'a pas montré l'enrichissement ou l'épuisement le plus fort en δ2HLM, qui présentait une variation similaire et des valeurs moyennes similaires (la moyenne pendant la période de dégradation de 15 jours) aux valeurs de l'inoculation fongique. En revanche, la diminution observée de 3,0 mUr des valeurs de δ2HLM dans l'expérience bactérienne était évidente. Outre le fait que la pectine riche en méthoxy est plus facile à dégrader, entraînant probablement une signature isotopique plus positive, un fractionnement isotopique lors de l'hydrolyse enzymatique microbienne doit être envisagé64. La biodégradation peut conduire à un enrichissement des substrats résiduels, car les isotopes plus légers peuvent être plus facilement utilisés par les microbes65. Selon Fischer et al.66, le fractionnement isotopique de l'hydrogène était évident lors de l'hydroxylation aérobie des cycles benzéniques au cours de la biodégradation, et certains facteurs d'enrichissement isotopique pour une voie de biodégradation spécifique peuvent être causés par un mélange de matériaux de dégradation, de conditions de culture et de réactions enzymatiques complexes. . Ce résultat était cohérent avec la déméthylation des composés aromatiques de la lignine que nous avons observée, avec un enrichissement plus important des valeurs de δ2HLM dans les expériences d'inoculation fongique.

Même si les valeurs finales (jour 15) de δ2HLM (qui variaient de − 227,5 à − 230,4 mUr) dans les quatre expériences n'étaient pas significativement différentes (ANOVA, P < 0,05) de la valeur initiale (− 230,3 mUr), nous avons observé un léger enrichissement des valeurs de lignine δ2HLM lors de la dégradation (Fig. 5b, Tableau 1 et Tableau supplémentaire S5). Cependant, certaines incertitudes analytiques41,67, telles que l'homogénéité du substrat, la norme de référence utilisée, le volume d'injection, la dérive de la ligne de base, la variation naturelle (c.-à-d. un écart-type élevé) et la compression de l'échelle, étaient éloignées de la moyenne réelle. Dans cette étude, certains écarts-types (n = 3, avec une plage de 0,9 à 2,6 mUr) étaient supérieurs ou égaux à 1,5 mUr, ce qui est nettement supérieur à ce qui serait attendu pour des mesures isotopiques idéales22,25. Globalement, bien que la perte de pectine de la litière de feuilles et le fractionnement isotopique métabolique microbien puissent être responsables de la fluctuation observée des valeurs de δ2HLM lors de la dégradation de la lignine, il semble que ces processus ne dépendent pas de la diminution du G/ rapport S ou la perte de groupes méthoxy. Cependant, avant de pouvoir appliquer des valeurs δ2HLM spécifiques à la lignine pour évaluer la dynamique de dégradation des matériaux lignocellulosiques ou comme indicateur indirect du dépôt de lignine de la litière végétale dans l'humus du sol, nous avons besoin d'informations plus détaillées sur les différences de valeurs δ2HLM entre G- et S- lignine.

Nos analyses ont confirmé notre hypothèse selon laquelle les monomères de lignine et leurs valeurs δ2HLM changeraient indépendamment et révéleraient différents rôles relatifs des bactéries et des champignons dans la biodégradation. La capacité de dépolymérisation de la lignine d'Aspergillus fumigatus, seul ou en co-culture, était plus forte que celle de Pseudomonas mandelii seul. La lignine G était plus facilement dégradée que la lignine S dans toutes les expériences. Les valeurs mesurées de δ2HLM des groupes méthoxy de la lignine dans les résidus de dégradation n'ont montré aucune dépendance significative de la teneur en monomère de lignine, du rapport G/S ou de la perte de groupes méthoxy. Cela indique que le signal δ2HLM dans la biodégradation de la matière lignocellulosique ou la minéralisation de la lignine peut être utilisé comme biomarqueur pour l'apport de lignine de la litière végétale au sol organique. Cependant, il n'est pas clair si les valeurs de δ2HLM varient en fonction des proportions de monomères de lignine végétale. Les différences dans les valeurs de δ2HLM entre la lignine G et la S-lignine devraient être étudiées plus avant en séparant les deux monomères ou en déterminant leurs valeurs isotopiques séparément, fournissant ainsi des informations supplémentaires sur la biodégradation de la lignine.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Oxyde d'aluminium

Aspergillus fumigatus Souche

Coenzyme A

Unité formant colonie

Iodométhane

Expérience témoin non inoculée

Rapport isotopique stable de l'hydrogène dans les groupes méthoxy de la lignine

Rapport isotopique stable de l'hydrogène dans les précipitations

Dégradation perte de poids

Gaïacyl monolignol

Chromatographe en phase gazeuse

Acide iodhydrique

p-Hydroxyphényl monolignol

Spectromètre de masse à rapport isotopique

Spectromètre de masse

Perte de dégradation nette

Taux net de perte de dégradation

Groupe méthoxy

Souche de Pseudomonas mandelii

La co-culture de Pseudomonas mandelii et Aspergillus fumigatus

Polytétrafluoroéthylène

Monolignol de syringyle

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Nous remercions le professeur Xiaohong Liu (Université normale du Shaanxi) pour son soutien technique avec les mesures δ2HLM. Nous sommes également très reconnaissants au professeur Frank Keppler et à son équipe de recherche de l'Université de Heidelberg pour leurs conseils constructifs et leur aide concernant la mesure des rapports d'isotopes stables dans les groupes méthoxy de la lignine. Cette recherche a été soutenue par le programme de recherche fondamentale en sciences naturelles de la province du Shaanxi (subventions 2021JQ-968, 2020JM-708, 2020JQ-971) et le programme local de science et technologie de la province du Shaanxi (subventions 2021ZDYF-GY-0020, 20193058YF046NS046).

Laboratoire clé des ressources du sol et des applications biotechnologiques, Académie des sciences du Shaanxi, Centre de recherche en ingénierie du Shaanxi pour la conservation et l'utilisation des ressources botaniques, Jardin botanique de Xi'an de la province du Shaanxi (Institut de botanique de la province du Shaanxi), No.17, Cuihua South Road , Xi'an, 710061, Chine

Qiangqiang Lu, Guanghua Jing, Liyan He, Ning Zhao, Zhikun Chen, Zhao Zhang et Xinwei Shi

École de géographie et de tourisme, Université normale du Shaanxi, Xi'an, 710119, Chine

Qiangqiang Lu et Yabo Wang

Collège de foresterie, Université Northwest A&F, Yangling, 712100, Chine

Lili Jia

Collège des ressources naturelles et de l'environnement, Université Northwest A&F, Yangling, 712100, Chine

Mukesh Kumar Awasthi

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Tous les auteurs ont contribué à la conception et à la conception de l'étude. La méthodologie, l'investigation, la visualisation et la visualisation ont été réalisées par QL, GJ, YW, LH, NZ et ZZ La première ébauche du manuscrit a été rédigée par QL et révisée et éditée par LJ et MKA L'administration du projet et l'acquisition de financement ont été réalisées par XS et ZC Tous les auteurs ont examiné et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Xinwei Shi.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Lu, Q., Jia, L., Awasthi, MK et al. Variations des teneurs en monomères de lignine et des rapports isotopiques stables de l'hydrogène dans les groupes méthoxy au cours de la biodégradation de la biomasse du jardin. Sci Rep 12, 8734 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-12689-1

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Reçu : 18 février 2022

Accepté : 05 mai 2022

Publié: 24 mai 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-12689-1

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