Le recâblage du métabolisme du glucose améliore 5

Communications Biology volume 5, Article number: 1159 (2022) Citer cet article

2667 accès

1 Citations

15 Altmétrique

Détails des métriques

Malgré le fait que le 5-fluorouracile (5-FU) est l'épine dorsale de la chimiothérapie dans le cancer colorectal (CCR), le taux de réponse chez les patients est limité à 50 %. Les mécanismes sous-jacents à la toxicité du 5-FU sont débattus, limitant le développement de stratégies pour améliorer son efficacité. La relation entre les aspects fondamentaux du cancer, tels que les mutations du conducteur et l'hétérogénéité phénotypique, et la réponse du 5-FU reste obscure. Cela repose en grande partie sur le nombre limité d'études réalisées dans des modèles précliniques capables de récapituler les principales caractéristiques du CCR. Ici, nous avons analysé la réponse 5-FU dans des organoïdes dérivés de patients qui reproduisent les différentes étapes du CRC. Nous constatons que le 5-FU induit un déséquilibre de la pyrimidine, ce qui entraîne des dommages à l'ADN et la mort cellulaire dans les cellules cancéreuses en prolifération active déficientes en p53. Il est important de noter que le déficit en p53 entraîne la mort cellulaire en raison d'un arrêt du cycle cellulaire avec facultés affaiblies. De plus, nous constatons que le ciblage de l'effet Warburg dans les organoïdes tumoraux glycolytiques KRASG12D améliore la toxicité du 5-FU en modifiant davantage le pool de nucléotides et, surtout, sans affecter les cellules WT non transformées. Ainsi, p53 apparaît comme un facteur important dans la détermination de la réponse 5-FU, et le ciblage du métabolisme du cancer en combinaison avec des chimiothérapies induisant un stress de réplication apparaît comme une stratégie prometteuse pour le traitement du CCR.

Dans le monde, le cancer colorectal (CCR) est le troisième type de cancer le plus fréquemment diagnostiqué et la deuxième cause de mortalité liée au cancer1. La chirurgie reste actuellement le seul traitement curatif chez les patients atteints d'un CCR à un stade précoce ou avec des métastases résécables. Les patients atteints de CCR reçoivent en outre une chimiothérapie adjuvante et les patients atteints de CCR métastatique non résécable dépendent entièrement de la chimiothérapie2. Bien que les chimiothérapies à base de 5-FU aient une faible réponse tumorale (taux allant jusqu'à 50 %)3,4,5 et ne prolongent pas efficacement la survie sans maladie2,3,4,6,7, elles restent le traitement le plus courant du CCR (revu en 8). De plus, on ne sait toujours pas pour quels patients la thérapie au 5-FU est bénéfique.

Malgré l'importance du 5-FU, le mécanisme sous-jacent de sa toxicité est encore débattu. Lors de l'absorption cellulaire, le 5-FU est converti en métabolites fluorés actifs. Le 5-FUTP et le 5-FdUTP peuvent être incorporés respectivement dans l'ARN et l'ADN, et le F-dUMP peut inhiber la thymidylate synthase (TS), altérant le pool de désoxynucléotides et par conséquent la réplication et la réparation de l'ADN (examiné dans la réf. 8,9). La façon dont cela se récapitule chez les patients reste incertaine, bien qu'un certain nombre d'études montrent que le 5-FU peut induire une cytotoxicité via l'incorporation de F-UTP dans l'ARN10,11,12,13,14. L'expression de TS dans la tumeur semble, d'autre part, corrélée à la réponse du 5-FU, ce qui suggère que la toxicité du 5-FU pourrait reposer sur une réplication et/ou une réparation altérées de l'ADN, mais la corrélation n'implique pas de causalité8,15,16,17 ,18.

Bien que la médecine de précision et l'application de thérapies ciblées aient été facilitées par les études génomiques, pour les chimiothérapies conventionnelles, cela a été relativement infructueux2,19. La pertinence des différentes mutations génétiques dans la détermination de la réponse 5-FU, en fait, reste encore insaisissable. De plus, l'hétérogénéité intra-tumorale génétique et phénotypique contribue également à la réponse thérapeutique différentielle et à la résistance2,20,21,22. Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont un tel sous-ensemble de cellules tumorales dans la tumeur qui prolifèrent activement et présentent un potentiel de différenciation23,24,25. Il reste également à déterminer si différents types de cellules CRC répondent différemment au 5-FU. Dans l'ensemble, il existe encore un manque de connaissances qui limite l'amélioration des stratégies de traitement du CCR à base de 5-FU.

Des études visant à accroître nos connaissances sur les mécanismes d'action des chimiothérapies conventionnelles devraient être réalisées dans des modèles précliniques permettant la manipulation, mais récapitulant en même temps les caractéristiques morphologiques et moléculaires des tumeurs CCR. Les lignées cellulaires 2D dérivées de tumeurs ont grandement contribué à la compréhension actuelle de la biologie du cancer, mais dans la plupart des cas, elles présentent une faible stabilité (génétique) et manquent de l'hétérogénéité cellulaire des tumeurs in vivo26. En revanche, les biopsies tumorales qui présentent toutes les caractéristiques de la tumeur sont souvent à court d'investigation en raison du matériel limité et du manque d'options de manipulation. Les organoïdes dérivés de patients (PDO) comblent le fossé entre les biopsies de patients et les lignées cellulaires 2D. Les PDO récapitulent les variations du nombre de copies somatiques et les spectres de mutation trouvés dans les tumeurs CRC et l'hétérogénéité génétique et non génétique des tumeurs CRC27,28. De plus, plusieurs études ont montré que les organoïdes dérivés de tumeurs de plusieurs types de cancer prédisent la réponse à la chimiothérapie chez les patients29,30,31,32,33 et que la réponse est stable dans le temps32,34. De plus, les organoïdes permettent la manipulation pour évaluer la causalité et les mécanismes en aval de la toxicité des médicaments.

Les tumeurs ont un arrière-plan génétique complexe et toutes les lésions génétiques ne sont pas des moteurs de la progression tumorale et elles ne déterminent pas non plus la réponse thérapeutique2,35,36. Pour identifier les mutations spécifiques qui déterminent la réponse à la chimiothérapie, nous avons choisi un système bien défini, le modèle organoïde de progression tumorale CRC (TPO)37 et les PDO. Le modèle TPO se compose d'organoïdes dérivés de tissus sains du côlon qui ont été génétiquement modifiés pour héberger les quatre mutations conductrices les plus fréquentes du CRC (APCKO, KRASG12D, P53KO, SMAD4KO). Les PDO sont directement dérivés des tumeurs des patients et ont été préalablement caractérisés27. Ici, nous montrons que le déficit en p53 provoque systématiquement des dommages à l'ADN et la mort cellulaire lors du traitement au 5-FU, à la fois dans les TPO et les PDO. Cela se produit en raison de l'incapacité des cellules déficientes en p53 à arrêter la prolifération cellulaire. La p53 active protège contre les dommages à l'ADN induits par le 5-FU en induisant l'arrêt de G1 dans les organoïdes WT et AK non transformés (APCKO, KRASG12D) conduisant à la survie. Dans les AOP, on observe une réponse plus variable ; bien que p53 induise un arrêt du cycle cellulaire et protège contre les dommages à l'ADN induits par le 5-FU, il peut en outre évoquer une réponse apoptotique rapide. Cette réponse différentielle envers p53 est probablement due à une interaction complexe de p53 avec les nombreuses lésions génétiques supplémentaires présentes dans les PDO. Comme nous avons constaté que le mode d'action du 5-FU repose sur un déséquilibre de la pyrimidine, nous avons ciblé le métabolisme des cellules cancéreuses pour améliorer l'efficacité de l'antimétabolite 5-FU. Il convient de noter que nous avons constaté que le recâblage de l'effet Warburg abaisse les niveaux de nucléotides et améliore la toxicité du 5-FU de manière sélective dans les cellules CRC glycolytiques déficientes en p53 et KRASG12D, mais pas dans les cellules intestinales non transformées.

Pour lier des mutations spécifiques à la sensibilité au 5-FU dans le CCR, nous avons analysé la réponse du 5-FU dans les TPO, qui sont génétiquement modifiés pour héberger différentes combinaisons des principaux moteurs du CCR. Nous avons utilisé dans cette étude des TPO non transformées (WT), APCKOKRASG12D (AK), APCKOP53KO (AP), APCKOKRASG12DP53KO (APK) et APCKOKRASG12DP53KOSMAD4KO (APKS). Ce modèle a été étudié in vitro et in vivo et les organoïdes APK et APKS récapitulent les caractéristiques morphologiques respectivement des adénocarcinomes et des adénocarcinomes peu différenciés à potentiel métastatique37,38. Tout d'abord, nous avons analysé la sensibilité au traitement au 5-FU et constaté que la réponse était différente selon les différentes lignées d'organoïdes. Le 5-FU a considérablement réduit la viabilité cellulaire des organoïdes AP, APK et APKS, qui ont également montré des taux de croissance plus élevés que les organoïdes WT et AK. En revanche, les organoïdes WT et AK n'ont montré aucune diminution significative de la viabilité cellulaire, bien que des différences de tailles d'organoïdes aient été observées, suggérant un effet cytostatique du 5-FU (Fig. 1a, b et Supplémentaire Fig. 1a – d). P53 est un facteur bien établi et un composant de la réponse aux dommages de l'ADN et le 5-FU peut interférer avec la synthèse de l'ADN8,9,39. Ainsi, nous avons évalué le marqueur de dommages à l'ADN γH2AX sur 5-FU. L'analyse par Western blot et par cytométrie en flux a montré que le traitement au 5-FU induisait des dommages à l'ADN dans les organoïdes déficients en p53, alors que ce phénotype était plus doux et / ou non significatif dans les organoïdes WT et AK (Fig. 1c, d et Supplémentaire Fig. 1d , e). Afin de mieux comprendre les dommages à l'ADN induits par le 5-FU, nous avons analysé l'activation des différentes voies de réponse aux dommages à l'ADN. Les fourches de réplication bloquées et les cassures d'ADN simple brin sont des conséquences courantes des chimiothérapies conventionnelles40,41. Par conséquent, nous avons d'abord évalué la voie ATR-Chk1, qui est activée lors d'un stress de réplication et de cassures simple brin42. Des expériences dans le temps ont révélé que le 5-FU induit l'activation de Chk1 dans les organoïdes déficients en WT et en p53 dès 24 h (Fig. 1e supplémentaire). À 24 h, les organoïdes WT ont montré une légère induction du marqueur de dommages à l'ADN γH2AX. Les organoïdes P53WT ont éliminé les dommages dans les 24 heures suivantes, tandis que les organoïdes déficients en p53 ont montré une accumulation de γH2AX à ce moment ultérieur (Fig. 1e supplémentaire). Cela suggère que si les cellules P53WT résolvent les dommages à l'ADN induits par le 5-FU, les organoïdes déficients en p53 ne le font pas. Fait intéressant, l'inhibition de l'ATR empêche l'activation de Chk1 dans les organoïdes transformés et WT, indiquant que l'activation de Chk1 est le résultat d'un stress de réplication (Fig. 1e)43. Conformément à cela, l'inhibition de la voie ATR-Chk1 améliore les niveaux de γH2AX dans les organoïdes WT et AKPS (Fig. 1f). Pendant le stress de réplication, les fourches de réplication bloquées non réparées peuvent entraîner des cassures d'ADN double brin et l'activation de la voie ATM-Chk2. Nous avons constaté que le 5-FU entraînait une activation dépendante de l'ATM de Chk2 dans APK et APKS, mais pas dans les organoïdes WT, AK et AP (Fig. 1e et Fig. 1e supplémentaire)45. Pris ensemble, ces résultats montrent que la voie ATR-Chk1 est nécessaire pour résoudre le stress de réplication induit par le 5-FU et, surtout, que le traitement au 5-FU entraîne une augmentation des niveaux de dommages à l'ADN non résolus et de mort cellulaire dans les organoïdes tumoraux déficients en p53.

a Images représentatives en fond clair d'organoïdes WT et CRC traités avec du 5-FU pendant 7 jours (barre d'échelle = 500 µm). b Analyse de la viabilité cellulaire des organoïdes tumoraux WT et CRC par cytométrie en flux pour distinguer les cellules vivantes (DAPI−) des cellules mortes (DAPI+) après 7 jours de traitement au 5-FU (moyenne ± SEM, n = 3–5, ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak). c Détection par Western blot de γH2AX et de β-actine dans des lysats d'organoïdes tumoraux WT et CRC traités avec du 5-FU pendant 48 h (représentatif pour n = 5). WT, AK, AP, APK, APKS ont été exécutés ensemble sur le même gel. d Quantification des cellules présentant des dommages à l'ADN par cytométrie en flux d'organoïdes WT et CRC traités avec du 5-FU pendant 48 h et colorés avec de l'anti-γH2AX (moyenne ± SEM, n = 5 (WT), 3 (AK), 6 (AP) , 8 (APK et APKS), ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak). e, f Détection par transfert Western de (p)Chk1, (p)Chk2, γH2AX et vinculine de lysats d'organoïdes WT et APKS traités avec du 5-FU pendant 24 h et co-traités avec l'inhibiteur ATR VE-821 ou l'inhibiteur ATM KU55933 ou les deux pendant 26 h (représentant pour n = 3, WT : Chk2 : Santa Cruz, #SC-9064, APKS : Chk2 : Cell Signaling, #3440). WT et APKS ont été exécutés sur des gels séparés. ns : non significatif, *p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001.

Nos résultats susmentionnés montrent que toutes les cellules ne répondent pas au traitement de manière uniforme, car une fraction de cellules ne présente pas de dommages à l'ADN et survit au traitement (Fig. 1b, d). Pour analyser la réponse du 5-FU au niveau d'une seule cellule, nous avons approfondi cette question sur les organoïdes réactifs au 5-FU (AP, APK et APKS). Nous avons d'abord analysé les dommages à l'ADN induits par le 5-FU par immunofluorescence et examiné la réponse au niveau de la cellule unique. En effet, au sein d'organoïdes uniques, les dommages à l'ADN induits par le 5-FU sont hétérogènes entre les cellules (Fig. 2a et Fig. 2a supplémentaire). Outre l'hétérogénéité génétique, les tumeurs CCR présentent une hétérogénéité phénotypique. Comme pour l'intestin sain, les cellules souches cancéreuses (CSC) sont marquées par une signalisation Wnt élevée, sont prolifératives et alimentent la croissance tumorale23,24,25,46,47. Pour examiner la réponse au 5-FU dans les CSC, nous avons introduit génétiquement dans nos lignées d'organoïdes le journaliste de cellules souches à base de Wnt STAR48,49,50,51. Dans les organoïdes WT et CRC, les cellules ont montré une hétérogénéité dans la souche (Fig. 2b et Fig. 2b supplémentaire). De plus, l'incorporation d'EdU et les analyses du cycle cellulaire ont montré que les cellules STAR + dans les organoïdes WT et CRC constituent en effet la population proliférante de cellules (Fig. 2c – e supplémentaire) 23,24. Fait intéressant, les analyses de cytométrie en flux et d'immunocoloration ont révélé que les CSC acquièrent plus de dommages à l'ADN que les cellules différenciées lors du traitement au 5-FU (Fig. 2c, d et Fig. 2c, f supplémentaires), ce qui est lié à leur taux de prolifération élevé. Conformément à cela, l'immunomarquage du marqueur prolifératif Ki67 en combinaison avec γH2AX a révélé que, sur 5-FU, les cellules proliférantes Ki67 + ont plus de dommages à l'ADN que les cellules Ki67 non proliférantes (Fig. 2e et Fig. Supplémentaire 2g). De plus, l'analyse de γH2AX dans chacune des phases du cycle cellulaire a montré que la proportion de cellules endommagées par l'ADN est plus élevée en phase S et G2 / M par rapport aux cellules en G1 (Fig. 2f). Fait intéressant, ce schéma observé dans les CSC à cycle se retrouve également dans la (petite proportion) de cellules différenciées par STAR à cycle (Fig. 2h supplémentaire). Ces résultats indiquent qu'un état de prolifération active dans les cellules est critique pour la sensibilité au 5-FU.

a Images représentatives d'organoïdes APKS traités avec du 5-FU pendant 48 h et colorés avec de l'anti-γH2AX et du DAPI (barre d'échelle = 50 µm). b Images représentatives d'organoïdes APKS transduits avec le journaliste de cellules souches STAR et colorés au DAPI (barre d'échelle = 50 µm, panneau supérieur : pile Z unique, panneau inférieur : projection maximale des piles Z). c Quantification de l'intensité de γH2AX dans les cellules STAR− et STAR+ d'images immunofluorescentes d'organoïdes AP, APK et APKS traités avec du 5-FU pendant 48 h (Fig. 2f supplémentaire) (70-153 cellules par condition à partir de 12 organoïdes de trois expériences indépendantes , test de Mann–Whitney). d Détection des cellules γH2AX+ par cytométrie en flux dans les cellules STAR- vs STAR+ des organoïdes AP, APK et APKS traités au 5-FU pendant 48 h (moyenne ± SEM, n = 6 (AP, APKS), 7(APKS), un- façon ANOVA, le test de comparaisons multiples de Sidak). e Quantification de l'intensité de γH2AX dans les cellules KI67 + vs KI67- d'images immunofluorescentes d'organoïdes AP, APK et APKS traités avec du 5-FU pendant 48 h (Fig. 2G supplémentaire) 128-331 cellules par condition à partir de 12 organoïdes de trois expériences indépendantes, Test de Mann–Whitney). f Détection des cellules γH2AX+ par cytométrie en flux Cellules G1, S et G2/M des organoïdes AP, APK et APKS traités au 5-FU pendant 48 h (moyenne ± SEM, n = 5 (AP), 7 (APK, APKS), AP, APK : ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak, APKS : test de Kruskal-Wallis, test de comparaisons multiples de Dunn). ns : non significatif, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Bien que l'importance de p53 dans la réponse 5-FU ait été étudiée, une image claire n'a pas encore émergé17,52,53,54,55. Alors que des études in vitro montrent que p53 est nécessaire pour l'apoptose induite par le 5-FU56,57,58,59,60, des études épidémiologiques montrent que l'expression de P53 est corrélée à la résistance au 5-FU chez les patients de stade III et IV52,54,61. Ici, nous constatons que la perte de fonction de p53 conduit à une sensibilité au 5-FU et nous avons donc étudié le mécanisme derrière ce phénotype. L'analyse par Western blot a montré que p53 et sa cible transcriptionnelle p21 augmentent respectivement à 4 et 16 h de traitement au 5-FU dans les organoïdes WT et AK (Fig. 3a). P53 régule la prolifération cellulaire via p21 qui se lie et inhibe les complexes cycline/CDK qui phosphorylent Rb, empêchant ainsi sa phosphorylation et l'inhibition conséquente de la transition G1/S (revu dans 62). Nous avons constaté que le traitement au 5-FU entraînait une perte complète de la phosphorylation de Rb dans les organoïdes P53WT, alors que les organoïdes déficients en p53 manquaient d'induction de p21 et présentaient la phosphorylation Rb restante (Fig. 3b). En accord, l'analyse du profil du cycle cellulaire a montré que le 5-FU induit un arrêt G1 dans les organoïdes P53WT, alors qu'il provoque une accumulation de phase S/G2 dans les organoïdes déficients en p53 (Fig. 3c, Fig. 1d supplémentaire et Tableau 1). Ces points à l'arrêt de G1 induit par p53 sont le mécanisme empêchant les dommages à l'ADN induits par le 5-FU, ce qui est conforme à la taille réduite observée dans WT et AK (Fig. 1a et Fig. 1b, c supplémentaires). Pour tester cela, nous avons remplacé la fonction p53 en arrêtant les cellules en G1 par l'inhibiteur CDK4/6 palbociclib63. Après 24 h de traitement, la plupart des cellules ont été arrêtées en G1 (Fig. 3a, b supplémentaires) et nous avons procédé à l'administration de 5-FU. L'arrêt de G1 dans les organoïdes déficients en p53 a complètement empêché les dommages à l'ADN lors du 5-FU et a sauvé la mort cellulaire induite par le 5-FU (Fig. 3d – f), ce qui suggère que les dommages à l'ADN pendant la réplication sont le principal contributeur à la toxicité du 5-FU dans p53- organoïdes déficients. Afin de valider davantage la fonction de p53 dans la réponse 5-FU, nous avons effectué des expériences d'ajout conditionnel de P53 à l'aide d'un système de surexpression de P53 inductible par la doxycycline (OE) (Fig. 3g – j et Supplémentaire Fig. 3c – f). L'induction de P53 a rétabli la réponse 5-FU dans APK et APKS, car l'induction de p21 a été restaurée et l'accumulation du cycle cellulaire S / G2 a été empêchée (Fig. 3g, h). Conformément à cela, les dommages à l'ADN et la mort cellulaire ont été significativement sauvés lors de P53 OE (Fig. 3g, i, j). Un sauvetage incomplet de la viabilité cellulaire pourrait résulter du système d'ajout, car il ne récapitule pas la stabilisation transitoire de p53 sur 5-FU (Fig. 3a) et l'activation soutenue de p53 peut conduire à l'apoptose62,64,65. Ces résultats confirment que p53 agit comme un facteur discriminant dans la réponse du 5-FU, où la perte de p53 provoque des dommages à l'ADN induits par le 5-FU et la mort cellulaire.

une détection Western blot de p53, p21 et vinculine dans des organoïdes WT et AK traités avec du 5-FU pendant 4, 8, 16, 24 et 48 h (blot représentatif pour n = 4). WT et AK ont été exécutés sur le même gel. b Détection par Western blot de p53, p21, (p)Rb et vinculine dans des organoïdes WT et CRC traités avec du 5-FU pendant 48 h (représentatif pour n = 4). WT, AK, AP, APK, APKS ont été exécutés ensemble sur les mêmes gels. c Profil du cycle cellulaire déterminé par cytométrie en flux dans des organoïdes WT et CRC traités avec du 5-FU pendant 48 h (moyenne ± SEM, n = 4 (WT), 3 (AK), 5 (AP), 7 (APK), 6 ( APKS), test de Kruskal-Wallis, test t non apparié et test de Mann-Whitney). d Analyse Western blot de γH2AX et de la tubuline des organoïdes AP, APK et APKS traités au 5-FU pendant 48 h. Le traitement au palbociclib a commencé 24 h avant le traitement au 5-FU pour arrêter les cellules en G1 (représentatif pour n = 3). AP, APK et APKS ont été exécutés ensemble sur les mêmes gels. e, f Imagerie en fond clair représentative (e) et analyse de la viabilité cellulaire (f) des organoïdes AP, APK et APKS traités avec du 5-FU pendant 6 jours. Le traitement au palbociclib a commencé 24 h avant le traitement au 5-FU pour arrêter les cellules en G1 (barre d'échelle = 500 µm, moyenne ± SEM, n = 3, ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak). g Détection par Western blot de p53, p21, γH2AX et β-actine dans des organoïdes APK-P53OE et APKS -P53OE inductibles par la doxycycline traités avec du 5-FU pendant 48 h (doxycycline (40 ng/ml pour APK et 200 ng/ml pour APKS) le traitement a été commencé 16 h avant l'administration de 5-FU) (représentatif pour n = 3). APK et APKS ont été exécutés sur des gels séparés. h Profils du cycle cellulaire des organoïdes APK-P53OE et APKS-P53OE inductibles par la doxycycline traités avec du 5-FU pendant 48 h (le traitement à la doxycycline (40 ng/ml pour l'APK et 200 ng/ml pour l'APKS) a commencé 16 h avant le 5-FU administration) (moyenne ± SEM, n = 3, ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak). i, j Images en fond clair (i) et analyse de la viabilité cellulaire (j) des organoïdes APK-P53OE et APKS-P53OE inductibles par la doxycycline par cytométrie en flux pour distinguer les cellules vivantes (DAPI−) des cellules mortes (DAPI+) après 4 jours de 5-FU traitement. APK : le traitement à la doxycycline (40 ng/ml) a commencé 16 h avant et a été éliminé 24 h après l'administration de 5-FU. APKS : le traitement à la doxycycline (200 ng/ml) a commencé 16 h avant l'administration de 5-FU et n'a pas été lavé (barre d'échelle = 500 μm, moyenne ± SEM, n = 6 (APK-P53 OE), 4 (APKS-P53 OE), ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak). ns : non significatif, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Ensuite, nous nous sommes demandé si ce mécanisme était conservé dans un modèle plus proche des patients CRC. Ainsi, nous avons évalué la réponse du 5-FU dans les organoïdes dérivés de tumeurs de patients atteints de CCR (AOP)27. Nous avons sélectionné des lignées avec ou sans mutations dans P53 et validé la fonction de p53 sur la base de la sensibilité à l'inhibition de MDM2 (Nutlin-3)27 (Fig. 4a supplémentaire). Nutlin-3 a induit la mort cellulaire dans les organoïdes P7t et P14t, tandis que P9t, P16t, P19bt étaient résistants, indiquant respectivement p53 fonctionnel et non fonctionnel (Fig. 4a supplémentaire). Lors du traitement au 5-FU, les lignées déficientes en p53 P9t, P16t, P19bt ont répondu de la même manière que le modèle TPO, car elles étaient incapables d'induire l'arrêt de p21 et G1 et ont subi des dommages à l'ADN et la mort cellulaire (Fig. 4a – e et Fig. 1d). Dans les lignées PDO avec p53 fonctionnel (P7t et P14t), nous avons observé que le 5-FU induit effectivement la stabilisation de p53, l'induction de p21 et l'arrêt de G1 (Fig. 4b, c supplémentaires). Cependant, ces PDO ont rapidement subi une mort cellulaire apoptotique sans signes clairs de dommages à l'ADN (Fig. 4b, d, e supplémentaires). Contrairement aux TPO, les PDO abritent un nombre considérable de lésions génétiques supplémentaires par rapport aux TPO. Cela indique qu'en présence de ces conditions spécifiques supplémentaires spécifiques à la tumeur, telles que des niveaux basaux élevés de p53 dans P14t (Fig. 4b supplémentaire) ou l'état hypermuté de P7t27, la fonction de p53 peut détourner de la médiation de la résistance à l'induction de l'apoptose. Pour étudier plus avant la fonction de p53 dans les AOP, nous avons introduit le système d'ajout de p53 aux lignées déficientes en p53 (Fig. 4f supplémentaire). La réintroduction de P53 dans p19bt et p16t a restauré l'induction de p21, empêché l'accumulation du cycle cellulaire S / G2 et empêché efficacement les dommages à l'ADN lors du traitement au 5-FU (Fig. 4f, g et Supplémentaire Fig. 4f). P53 OE a clairement sauvé la viabilité dans P19bt et légèrement dans les organoïdes p16t (Fig. 4h, i). Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que la perte de fonction de p53 dans les tumeurs a un résultat cohérent caractérisé par la mort cellulaire induite par des dommages à l'ADN. Dans les tumeurs P53WT, le 5-FU induit l'activation de p53, l'induction de p21 et l'arrêt de G1, et en fonction des conditions intrinsèques supplémentaires de la tumeur, p53 peut soit protéger, soit induire l'apoptose de manière indépendante des dommages à l'ADN.

une détection Western blot de p53, p21 et tubuline dans les organoïdes WT et P9t, P16t et P19bt traités au 5-FU pendant 48 h (représentatif pour n = 3). WT, P9t, P16t et P19bt ont été exécutés ensemble sur les mêmes gels. b Quantification des cellules présentant des dommages à l'ADN par cytométrie en flux des organoïdes P9t, P16t et P19bt traités au 5-FU pendant 48 h et colorés à l'anti-γH2AX (moyenne ± SEM, n = 6 (P9t), 3 (P16t), 4 ( P19bt), ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak). c Analyse du profil du cycle cellulaire par cytométrie en flux des organoïdes P9t, P16t et P19bt traités au 5-FU pendant 48 h et colorés au DAPI (moyenne ± SEM, n = 6 (P9t), 3 (P16t), 4 (P19bt) 4 , P9t et P16t : test t non apparié, P19bt : test de Mann–Whitney). d, e Images en fond clair (d) et analyse de la viabilité cellulaire (e) des organoïdes P9t, P16t et P19bt traités avec du 5-FU pendant 6 jours (barre d'échelle = 500 µm, moyenne ± SEM, n = 5 (P9t), 8 (P16t), 4 (P19bt) 4, ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak). f, g Détection par Western blot de p53, p21, γH2AX et β-actine (f) et analyse du profil du cycle cellulaire (g) dans des organoïdes P16t-P53OE et P19bt-P53OE inductibles par la doxycycline traités avec du 5-FU pendant 48 h. Le traitement à la doxycycline (200 ng/ml) a commencé 16 h avant et a été lavé 24 h après l'administration de 5-FU (représentatif pour n = 3, moyenne ± SEM, n = 4 (P16t-P53OE), 3 (P19bt-P53OE), ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak). P16t-P53OE et P19bt-P53OE ont été exécutés ensemble sur les mêmes gels. h, i Images en champ clair (h) et analyse de la viabilité cellulaire (i) des organoïdes P16t-P53OE et P19bt-P53OE inductibles par la doxycycline traités avec du 5-FU pendant 6 jours. Le traitement à la doxycycline (200 ng/ml) a commencé 16 h avant et a été lavé 24 h après l'administration de 5-FU (barre d'échelle = 500 µm, moyenne ± SEM, n = 5, ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Le mécanisme de la cytotoxicité induite par le 5-FU est encore débattu (examiné dans les références 8, 9). Ici, nous avons constaté que la mort cellulaire induite par le 5-FU repose sur le déclenchement de dommages à l'ADN dans les cellules en cycle dans des organoïdes dépourvus de p53 fonctionnel, ce qui indique un stress de réplication. Sur la base de l'effet rapporté du 5-FU sur l'activité TS, nous avons analysé si les changements induits par le 5-FU dans le pool de pyrimidine pouvaient expliquer ce phénotype. Tout d'abord, nous avons effectué une analyse métabolomique des organoïdes APKS, qui ont montré la réponse la plus forte au 5-FU. Nous avons observé que les niveaux de 5-FU, de dUDP et de dUMP augmentaient, tandis que les pools de TDP et de TTP étaient épuisés (Fig. 5a), indiquant que le 5-FU inhibe l'activité de la TS dans les organoïdes du CRC. Les cellules cancéreuses ont récemment été décrites comme présentant un mécanisme de débordement de nucléotides qui peut équilibrer la synthèse perturbée de la pyrimidine66. Ce mécanisme de débordement de nucléotides implique l'excrétion de désoxyuridine pour empêcher l'accumulation de dUMP et le taux d'excrétion de désoxyuridine dépend de l'étendue de l'inhibition de la TS66. Fait intéressant, nous avons observé une augmentation des niveaux de désoxyuridine extracellulaire lors du traitement au 5-FU (Fig. 5a), soutenant davantage l'inhibition de la TS induite par le 5-FU. Pour examiner l'importance du déséquilibre des pyrimidines sur les dommages à l'ADN et la mort cellulaire lors du 5-FU, nous avons effectué des expériences d'ajout de nucléosides. L'administration d'un mélange de nucléosides (adénosine, guanosine, cytidine et thymidine) a empêché les dommages à l'ADN induits par le 5-FU, l'accumulation de phase S et la mort cellulaire dans les organoïdes APKS (Fig. 5b, c, e, f). Fait intéressant, une seule addition de thymidine, mais pas des autres nucléosides, était suffisante pour sauver l'effet du 5-FU sur le cycle cellulaire, les dommages à l'ADN et la mort cellulaire (Fig. 5b – f). L'administration de thymidine en elle-même n'a pas affecté la progression du cycle cellulaire, ce qui montre que ce sauvetage ne dépend pas des effets du cycle cellulaire (Fig. 5d). Ensemble, ces résultats indiquent que, de manière mécaniste, le 5-FU induit des dommages à l'ADN et la mort cellulaire en modifiant le pool de pyrimidine dans les organoïdes déficients en p53.

a Détection des pyrimidines par métabolomique dans les organoïdes APKS traités au 5-FU pendant 30 h (moyenne ± SEM, n = 3 réplicats techniques, ANOVA à un facteur, test de comparaisons multiples de Sidak). b Détection par transfert Western de γH2AX et de la tubuline d'organoïdes APKS traités avec du 5-FU, un mélange de nucléosides (A, G, C et T (25 μM chacun)) ou T (25 μM) pendant 48 heures (transfert représentatif pour n = 3). Tous les échantillons ont été analysés sur le même gel. c Quantification des cellules présentant des dommages à l'ADN par cytométrie en flux d'organoïdes APKS traités avec du 5-FU, un mélange de nucléosides (A, G, C et T (25 μM chacun)) ou les nucléosides séparés (25 μM) pendant 48 h (moyenne ± SEM, n = 5, 6 (5-FU), 4 (mélange), 3 (G), ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak). d Analyse du profil du cycle cellulaire par cytométrie en flux d'organoïdes APKS, traités avec du 5-FU, un mélange de nucléosides (A, G, C et T (25 µM chacun)), ou T (25 µM) pendant 48 h (moyenne ± SEM, n = 5 (ctrl, 5-FU), 4 (+AGCT), 3 (+T), ANOVA unidirectionnelle, test de comparaison multiple de Sidak). e, f Images représentatives en fond clair (e) et analyse de la viabilité cellulaire (f) d'organoïdes APKS traités avec du 5-FU, un mélange de nucléosides (adénosine, guanosine, cytosine et thymidine (25 μM chacun)) ou thymidine (25 μM) pour 6 jours (barre d'échelle = 500 µm, moyenne ± SEM, n = 3, ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak). A adénosine, AU unité arbitraire, C cytidine, dUDP désoxyuridine diphosphate, dUMP désoxyuridine monophosphate, G guanosine, ND non détecté, ns mélange mélange de nucléosides, ns non significatif, T thymidine, TMP thymidine monophosphate, TDP thymidine diphosphate, TTP thymidine triphosphate, TS thymidylate synthétase. ns : non significatif, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Les cellules cancéreuses subissent l'effet Warburg en absorbant avidement le glucose et en le métabolisant par glycolyse en lactate indépendamment de la disponibilité en oxygène. Cette glycolyse accrue permet une production rapide d'ATP et soutient l'activité des voies anaboliques qui reposent sur des intermédiaires glycolytiques, tels que la synthèse des nucléotides. Sur la base de l'importance des nucléotides dans la toxicité du 5-FU, nous avons rationalisé le fait que le ciblage de l'effet Warburg pourrait améliorer l'efficacité du 5-FU. L'analyse bioénergétique des hippocampes a montré que les organoïdes AK, APK et APKS ont des taux de glycolyse plus élevés que les organoïdes WT et AP67 (Fig. 6b), alors que les paramètres respiratoires ne sont pas significativement différents (Fig. 5a, b supplémentaires). Ces résultats montrent que l'effet Warburg est récapitulé dans les organoïdes in vitro. Il convient de noter que ces résultats indiquent que la signalisation Ras active constitutive (KRASG12D), plutôt que la perte de fonction de p53, est le principal moteur de l'effet Warburg dans le CRC.

a Représentation schématique de la glycolyse et de différents médicaments ciblant la glycolyse. b Taux d'acidification extracellulaire (ECAR) des organoïdes WT et CRC déterminé par un test de stress de glycolyse par analyse Seahorse XF (moyenne ± SEM, n = 4 (WT, AK), 5 (AP, APK, APKS), ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak). c Quantification des cellules présentant des dommages à l'ADN par cytométrie en flux d'organoïdes APKS traités au 5-FU pendant 48 h. Le traitement au 2-DG a commencé 20 h avant le traitement au 5-FU (moyenne ± SEM, n = 4, ANOVA à un facteur, test de comparaisons multiples de Sidak). d Analyse de l'incorporation d'EdU par cytométrie en flux d'organoïdes APKS traités au 2-DG pendant 24 h (moyenne ± SEM, n = 5, test t non apparié). e Quantification des cellules présentant des dommages à l'ADN par cytométrie en flux d'organoïdes APKS traités au 5-FU pendant 48 h. La privation de glucose a commencé 20 h avant le traitement au 5-FU (moyenne ± SEM, n = 6, 5 (glucose 2 mM), ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak). f Analyse d'incorporation d'EdU par cytométrie en flux d'organoïdes APKS privés de glucose pendant 24 h (moyenne ± SEM, n = 4, ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak). g Analyse d'incorporation d'EdU par cytométrie en flux des organoïdes WT, APK et APKS traités avec du DCA pendant 24 h (moyenne ± SEM, n = 4, 5 (APKS), ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak). h Quantification des cellules présentant des dommages à l'ADN par cytométrie en flux des organoïdes WT, APK, APKS et P19bt traités au 5-FU pendant 48 h. Le traitement au DCA (20 mM pour les TPO et 10 mM pour le P19bt) a commencé 20 h avant le traitement au 5-FU (moyenne ± SEM, n = 5, 4 (WT), 6 (AK), 7 (APKS -/- et 5-FU ), ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak). i Détermination du taux d'acidification extracellulaire (ECAR) lors d'un test de stress de glycolyse Seahorse XF d'organoïdes APKS traités avec DCA et TEPP-46 pendant 24 h (moyenne ± SEM, cinq répétitions techniques, représentatives de n = 3). j Détection de TTP, dATP et ATP par métabolomique d'organoïdes APKS traités avec DCA et TEPP-46 pendant 24 h (moyenne ± SEM, trois répétitions techniques (à partir de mesures répétées), ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Sidak). k Quantification des cellules présentant des dommages à l'ADN par cytométrie en flux d'organoïdes APKS traités au 5-FU pendant 48 h. Les traitements au DCA et au TEPP-46 ont commencé 20 h avant le traitement au 5-FU (moyenne ± SEM, n = 4, 3 (DCA), ANOVA à une voie, test de comparaisons multiples de Sidak). 2-DG 2-désoxyglucose, ATP adénosine triphosphate, dATP désoxyadénosine triphosphate, DCA dichloroacétate, G6P glucose 6-phosphate, HK Hexokinase, PDH pyruvate déshydrogénase, PDK pyruvate déshydrogénase kinase, PEP phosphoénol pyruvate, PKM2 pyruvate kinase M2, TTP thymidine triphosphate. ns : non significatif, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Afin de réduire les taux glycolytiques élevés dans les organoïdes tumoraux, nous avons d'abord administré du 2-désoxyglucose (2-DG), un analogue du glucose qui ne peut pas être métabolisé et s'accumule dans la cellule, entraînant une glycolyse réduite par l'inhibition de l'hexokinase-2 (HK2 ; figure 6a ; examinée dans la référence 68). Bien que le 2-DG ait efficacement diminué la glycolyse (Fig. 5c supplémentaire), en combinaison avec le 5-FU, il n'a pas augmenté les dommages à l'ADN induits par le 5-FU et a même réduit l'efficacité par rapport au traitement au 5-FU seul (Fig. 6c). L'analyse de l'incorporation d'EdU a révélé que le 2-DG provoque une baisse importante de la prolifération (Fig. 6d), ce qui suggère que le ciblage de la glycolyse tout en réduisant la prolifération n'améliore pas l'effet du 5-FU. Ensuite, nous avons réduit la disponibilité du glucose. En effet, une réduction limitée de la disponibilité du glucose avant le traitement au 5-FU a augmenté les dommages à l'ADN (Fig. 6e). Cependant, une diminution supplémentaire de la concentration de glucose a réduit la prolifération cellulaire et, par conséquent, l'efficacité du 5-FU (Fig. 6e, f). Ainsi, nous avons recherché des options pharmacologiques pour réduire la glycolyse dans les organoïdes tumoraux. Le DCA est un inhibiteur de la pyruvate déshydrogénase kinase (PDK), qui augmente l'activité de la pyruvate déshydrogénase (PDH) et par conséquent la conversion du pyruvate en acétyl-coA au détriment de la production de lactate (Fig. 6a). Le traitement au DCA a diminué la phosphorylation de la PDH dans toutes les lignées organoïdes (Fig. 5d supplémentaire), confirmant qu'il inhibe l'activité de la PDK. Le DCA a réduit les taux glycolytiques élevés des organoïdes qui affichent l'effet Warburg à des taux glycolytiques comparables à ceux des organoïdes WT, tout en augmentant les paramètres respiratoires (Fig. 5e – g supplémentaire). Fait important, nous n'avons pas trouvé de changements significatifs dans la prolifération après un traitement au DCA pendant 24 h (Fig. 6g). Ensuite, nous avons évalué si le DCA altérait le métabolisme des nucléotides par métabolomique et avons constaté que le traitement au DCA réduisait effectivement les niveaux de nucléotides (Fig. 6j et Supplémentaire Fig. 5h). Il est important de noter que l'administration de DCA en tant que prétraitement court au 5-FU a en effet augmenté le nombre de cellules qui subissent des dommages à l'ADN lors du traitement au 5-FU dans les organoïdes glycolytiques APK et APKS, alors que cela n'a pas pu être observé dans les organoïdes AP moins glycolytiques (Fig. 6h et Fig. 5i supplémentaire). Fait intéressant, des résultats similaires ont été obtenus dans nos modèles PDO. Le DCA a inhibé la glycolyse dans P19bt, montrant l'effet Warburg et les dommages à l'ADN induits par le 5-FU (Fig. 6h et Supplémentaire Fig. 5j – l). Conformément à l'AP, dans p16t, aucun effet supplémentaire n'a été observé par le traitement au DCA, car ces lignées ne présentent pas le phénotype de l'effet Warburg (Fig. 5j, k, m supplémentaires).

Ensuite, nous avons évalué si l'effet synergique du DCA sur le traitement au 5-FU repose effectivement sur l'inhibition de la glycolyse. Les cellules cancéreuses en prolifération présentant l'effet Warburg expriment souvent l'isoforme de la pyruvate kinase M2 (PKM2)69. Comme la PKM catalyse l'étape limitante de la glycolyse, nous avons évalué si le TEPP-46, un activateur spécifique de PKM2, pouvait sauver les effets du traitement au DCA (Fig. 6a)70. À cette fin, nous avons analysé les taux de glycolyse par Seahorse et les niveaux intracellulaires de glucose par imagerie en direct d'un capteur de glucose FRET71. Ces analyses ont montré que l'activation de PKM2 annule l'inhibition de la glycolyse et restaure les niveaux de glucose intracellulaire lors du traitement au DCA (Fig. 6i et Fig. 5n – p supplémentaires). Fait important, en accord avec ces résultats, le traitement au TEPP-46 a sauvé la diminution des nucléotides résultant du traitement au DCA et a en effet empêché l'effet additif du DCA sur les dommages à l'ADN induits par le 5-FU (Fig. 6j, k). Au total, cela montre que le DCA améliore les dommages à l'ADN induits par le 5-FU en abaissant les niveaux de nucléotides en conséquence de l'inhibition de l'effet Warburg.

Ensuite, nous avons évalué si le DCA en combinaison avec le 5-FU pouvait encore augmenter la mort cellulaire. À cette fin, nous avons traité les organoïdes sensibles au WT et au 5-FU (APK, APKS et P19bt) avec du 5-FU et du 5-FU/DCA. L'analyse qualitative a montré que, bien que lors du traitement au 5-FU, certains organoïdes survivent au traitement, ceux-ci étaient absents du traitement DCA / 5-FU (Fig. 7a et Fig. 6a supplémentaire). Nous avons analysé quantitativement ce phénotype en vrac par cytométrie en flux et au niveau organoïde unique, en calculant un score de viabilité basé sur l'analyse d'imagerie. Dans les deux cas, nous avons constaté que le DCA en combinaison avec le 5-FU entraînait une réduction de la viabilité cellulaire par rapport au traitement au 5-FU unique dans les organoïdes APK, APKS et P19bt et que cet effet additif du DCA était absent dans les organoïdes WT (Fig. 7a– c et Supplémentaire Fig. 6b, c). En tant qu'indicateur de la survie post-traitement et du potentiel de rechute, nous avons évalué la capacité de croissance postérieure au traitement. Nous avons traité les organoïdes avec du 5-FU ou du DCA/5-FU, supprimé le traitement pour permettre la récupération des organoïdes et les avons replaqués pour analyser la capacité de formation des organoïdes. Nous avons constaté que la combinaison DCA / 5-FU entraînait un nombre inférieur d'organoïdes formés par rapport au traitement au 5-FU dans les organoïdes APK et APKS (Fig. 7d, e et Fig. 6d supplémentaire). Ainsi, le ciblage de l'effet Warburg, en recâblant le métabolisme du glucose, en combinaison avec le 5-FU augmente les dommages à l'ADN et la mort cellulaire dans les tumeurs hautement glycolytiques déficientes en p53 sans affecter les cellules non transformées.

a Images représentatives en champ clair des organoïdes WT, APK et APKS traités avec du 5-FU pendant 7 jours. Le traitement au DCA a commencé 20 h avant l'administration de 5-FU (barre d'échelle = 500 µm, les têtes de flèche indiquent les organoïdes survivants, les astérisques indiquent les organoïdes compromis). b Images représentatives d'organoïdes APKS, colorés avec CYQUANT (vivant) et Hoechst (total), traités avec du 5-FU pendant 7 jours. Le traitement au DCA a commencé 20 h avant le traitement au 5-FU (barre d'échelle = 300 µm). c Quantification du score vivant des images de b et de la Fig. 6c supplémentaire (médiane, 237 à 720 organoïdes de trois expériences indépendantes, test de Kruskal – Wallis, test de comparaisons multiples de Dunn). d Images représentatives en champ clair des organoïdes WT, APK et APKS 4 jours après le replaquage, après un traitement de 48 h-5-FU (50 µM) (avec ou sans traitement DCA qui a commencé 20 h avant l'administration de 5-FU), suivi de 7 jours de temps de récupération (barre d'échelle = 200 µm). e Détermination de particules organoïdes vivantes basée sur la Fig. 6d supplémentaire (moyenne ± SEM, WT : 8 gouttelettes de Matrigel de deux expériences indépendantes, APK et APKS : 16 gouttelettes de Matrigel de 4 expériences indépendantes, WT et APK : test t non apparié, APKS : Test de Mann–Whitney). ns : non significatif, *p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001.

Ici, nous utilisons deux modèles d'organoïdes d'origine humaine pour disséquer le mode d'action du 5-FU et pour comprendre la pertinence des différentes mutations conductrices pour déterminer l'efficacité du 5-FU dans les tumeurs colorectales. Nous avons constaté que lorsque les tumeurs hébergent p53 non fonctionnel, elles deviennent sensibles au 5-FU par l'induction de dommages à l'ADN et la mort cellulaire qui en résulte. Fait intéressant, dans ce modèle, l'efficacité du 5-FU dépend de l'état de prolifération active des cellules et, mécaniquement, le 5-FU agit en inhibant la synthèse du TTP. Pour améliorer l'efficacité du 5-FU dans les tumeurs déficientes en p53 et glycolytiques, nous avons ciblé l'effet Warburg en redirigeant le métabolisme du glucose dans le but de modifier davantage le pool de nucléotides. Cette stratégie a en effet amélioré l'efficacité du 5-FU dans les tumeurs déficientes en p53 et glycolytiques déjà sensibles et, surtout, elle n'a montré aucune toxicité supplémentaire pour les cellules saines non transformées.

La médecine de précision vise à stratifier les patients pour un traitement basé sur la génétique, de manière à ce que les patients atteints de cancer reçoivent le traitement le plus adéquat72. Cependant, pour les chimiothérapies conventionnelles, telles que le 5-FU, cela a échoué, en partie en raison de la compréhension non résolue des mécanismes d'action2,19. L'accumulation de preuves indique que le 5-FU induit une cytotoxicité via l'ADN et l'ARN8,9,10,11,12,13,14,73. Ce mode d'action différentiel apparent pourrait provenir de la dose de 5-FU (allant de 1 à 1000 µM dans ces études), où des niveaux élevés de 5-FU ont été proposés pour cibler les cellules par la toxicité de l'ARN, alors qu'une exposition prolongée à de faibles doses est proposé d'être cytotoxique via des dommages à l'ADN induits par l'inhibition de la TS8,74,75,76. Chez les patients, les (faibles) concentrations de 5-FU dans le plasma et les tumeurs (8 µM et 45 µM/kg respectivement77), suggèrent que l'effet endommageant l'ADN provoque plus probablement une toxicité dans les tumeurs du CCR. Conformément à cela, l'expression de TS et la réponse du 5-FU sont corrélées, les tumeurs avec des niveaux élevés de TS étant généralement plus résistantes au traitement au 5-FU que les tumeurs avec de faibles niveaux de TS8,15,16,17,18. Dans les organoïdes du CRC, nous constatons que lors d'une déficience en p53, le 5-FU induit une cytotoxicité dans les cellules en cycle principalement via une accumulation de dommages à l'ADN induite par la synthèse de pyrimidine altérée. Bien que nous n'ayons pas observé de cytotoxicité induite par le 5-FU dans les cellules non cycliques, différentes concentrations ou moments de 5-FU pourraient révéler des mécanismes alternatifs de cytotoxicité induite par le 5-FU.

L'identification du rôle des mutations motrices spécifiques dans l'efficacité des médicaments est difficile2,35,36. Ici, nous constatons que l'activité déficiente de p53 assure systématiquement la toxicité du 5-FU par la mort cellulaire induite par les dommages à l'ADN. D'autre part, lorsque p53 est fonctionnel, p53 est stabilisé et induit p21, ce qui entraîne un arrêt du cycle cellulaire qui empêche les dommages à l'ADN induits par le 5-FU. Nous constatons que cette réponse est soit suffisante pour protéger contre le 5-FU et conduit à la survie, qui est observée dans le WT non transformé et dans les organoïdes AK, soit induit une mort cellulaire apoptotique rapide sans signe de dommage à l'ADN, comme dans le Organoïdes P7t et P14t. Des études antérieures ont montré deux scénarios pour p53 : un rôle protecteur dépendant de l'arrêt du cycle cellulaire contre le 5-FU56,78,79, mais aussi que p53 est nécessaire pour induire l'apoptose dépendante du 5-FU14,56,57,58,59,60 . Nos observations indiquent que l'apoptose induite par p53 est probablement indépendante des dommages à l'ADN et pourrait donc être causée par d'autres stress induits par le 5-FU tels que la toxicité de l'ARN8,9,10,11,12,13,14,73. L'équilibre entre l'arrêt du cycle cellulaire induit par p53 et l'apoptose pourrait dépendre de la dose de 5-FU, ou des facteurs intrinsèques de la tumeur (état épigénétique, voies de signalisation actives) et du contexte cellulaire (microenvironnement cellulaire)80,81,82,83, ou en ligne avec nos résultats, sur la présence de mutations supplémentaires. Par exemple, une étude récente montre que le HRAS oncogène peut réduire la réponse transcriptionnelle dépendante de p53 au stress de réplication84.

Les CSC ont été définis comme une sous-population de cellules au sein d'une tumeur qui ont une capacité d'initiation tumorale élevée. Par conséquent, à l'origine, il a été suggéré que les CSC sont responsables de la résistance au traitement et de la rechute tumorale21. Cependant, l'apparition d'une plasticité cellulaire par laquelle les non-CSC peuvent acquérir un phénotype CSC24,46 indique qu'il est peu probable que la résistance au traitement soit attribuée à un type de cellule spécifique. Dans les tumeurs CRC, la plupart des CSC présentent une signalisation Wnt élevée et une prolifération active23,24,25,46. Ici, nous constatons que les cellules cyclables sont efficacement ciblées par le 5-FU. Fait intéressant, nous avons observé une population de cellules souches dans G1 qui n'accumulent pas de dommages à l'ADN. Cela pourrait être conforme à la sous-population précédemment signalée de CSC à cycle lent/quiescent au sein de la sous-population de CSC montrant une résistance accrue et un potentiel de rechute dans les tumeurs du CCR85. Ensemble, ces résultats soulignent que le comportement cellulaire plutôt qu'un type de cellule spécifique détermine la sensibilité au 5-FU81.

Le métabolisme des cellules cancéreuses est modifié pour soutenir une prolifération incontrôlée (examiné dans les références 86, 87, 88, 89). Le rôle du métabolisme de Warburg (taux élevé de glycolyse vers le lactate en présence d'oxygène suffisant) a été récemment révisé et il est proposé que le lactate en tant que produit final équilibre l'état redox cellulaire pour favoriser les voies anaboliques (examiné dans les réf. 86, 87). Le DCA est un médicament approuvé par la FDA (avec des effets secondaires minimes) qui est actuellement utilisé pour le traitement des maladies métaboliques90,91. Une étude antérieure propose que le DCA pourrait restaurer la sensibilité à la chimiothérapie des cellules ayant acquis une résistance grâce à un mécanisme métabolique insaisissable92,93. Ici, nous montrons que lorsqu'il est appliqué en tant que prétraitement court au 5-FU, il modifie le métabolisme du glucose et améliore l'efficacité. Le DCA ne peut induire cet effet additif que dans les organoïdes qui présentent à la fois une perte de p53 fonctionnel et présentent l'effet Warburg. Nos résultats et les preuves antérieures94 suggèrent que la mutation de KRASG12D, plutôt que la perte de fonction de p53, entraîne les changements métaboliques appelés effet Warburg dans le CCR. Cela pointe vers un sous-groupe de tumeurs qui pourraient bénéficier de cette combinaison de traitement. Mécaniquement, nous montrons que le DCA améliore l'efficacité du 5-FU en abaissant les niveaux de nucléotides en conséquence de l'inhibition de l'effet Warburg, sans induire de cytostase. Il s'agit d'un mécanisme supplémentaire aux taux de croissance réduits précédemment observés lors d'un traitement prolongé au DCA92, qui pourrait être dû à des différences dans les processus de prolifération et de différenciation en aval des transitions métaboliques95,96. Sur la base de cette action du DCA, nous proposons que le recâblage du métabolisme du glucose améliore probablement également l'efficacité d'autres chimiothérapies ciblant la réplication de l'ADN.

Alors que la médecine de précision progresse, les chimiothérapies conventionnelles restent le cheval de bataille de l'oncologie. Une meilleure compréhension de leur mode d'action est essentielle pour trouver des stratégies « à faible coût et à faible toxicité » pour améliorer le traitement des patients. Considérant que le recâblage du métabolisme du glucose ne semble pas avoir d'effets indésirables sur les tissus sains, il apparaît comme une stratégie prometteuse pour améliorer les chimiothérapies conventionnelles.

Les organoïdes de progression tumorale étaient un don du laboratoire Clevers37. Les organoïdes dérivés de patients P7t, P9t, P14bt, P16t et P19bt ont été obtenus auprès de la biobanque HUB et ont été caractérisés précédemment27. Les organoïdes ont été cultivés à 37 °C et à 5 % de CO2. Un statut sans mycoplasme a été confirmé en routine. Le milieu de culture de base contenait du DMEM/F12 avancé additionné de pénicilline/streptomycine, HEPES 10 mM et Glutamax 20 mM. Pour les expériences, lors de la trypsination dans des cellules individuelles/petits amas de cellules, les cellules ont été cultivées dans du Matrigel (Corning, #356231) ou du BME (Bio-Techne, #3533-010-02) dans un milieu d'expansion (tableau 2), additionné de Rock l'inhibiteur Y-27632 (Gentaur, #607-A3008).

Après 7 jours, les organoïdes ont été dilués et replaqués dans des plaques à 24 puits (4 gouttelettes de 11 µl) et le milieu a été remplacé par du milieu de différenciation (tableau 3). Après 3 jours, le milieu de différenciation a été rafraîchi et après 20 h supplémentaires, du 5-FU (Sigma, #F6627) a été ajouté. Pour toutes les expériences, 100 uM de 5-FU ont été utilisés, sauf indication contraire. Le moment des traitements au 5-FU est indiqué dans les légendes des figures.

Les traitements avec l'inhibiteur d'ATR VE-821 (5 µM, Bioconnect, #S8007) et l'inhibiteur d'ATM KU-55933 (10 µM, Sigma, #SML1109) ont commencé 2 h avant l'administration de 5-FU. Des nucléosides (25 µM chacun, tous Sigma : adénosine #A4036, thymidine #T9250, guanine #G6264 et cytidine #C4654) ont été ajoutés avec du 5-FU. Les traitements au palbociclib (1 µM, selleckchem, #S1116)) ont été commencés 24 h avant l'ajout de 5-FU. Le DCA (20 mM, Sigma, #347795), le 2-DG (10 mM, Sigma #D8375) et le TEPP-46 (100 µM, Selleckchem, #S7302) ou les privations de glucose ont commencé 20 h avant le traitement au 5-FU. Le milieu de privation de glucose a été préparé avec SILAC Advanced DMEM/F-12 Flex Media (Gibco, #A2494301), additionné de pénicilline/streptomycine, HEPES 10 mM et Glutamax 20 mM, l-Arginine (147,5 mg/L, Sigma, #A6969), l-Lysine (91,25 mg/L, Sigma, L8662) et la concentration de glucose indiquée (Merck Millipore, #1.08337.1000). Pour l'analyse de l'incorporation d'EdU, 6 h avant la collecte, les organoïdes ont été incubés avec 1 µM d'EdU (Thermo fisher, #C10636). Les détails des concentrations de doxycycline (Sigma, #D9891) et de Nutlin-3 (Sanbio, #10004372) et du temps d'incubation sont indiqués dans les légendes des figures.

Le pInducer-mKate2-NLS-P2A-P53 était un cadeau du laboratoire Snippert. À partir du plasmide 48, 50 du journaliste ASCL2 de cellules souches (STAR), la séquence 8x STAR-sTomato-NLS a été clonée dans un vecteur lentiviral avec une cassette de résistance à la puromycine. Le pcDNA3.1 FLII12Pglu-700uDelta6 (plasmide Addgene #17866) était un cadeau de Wolf Frommer71. La séquence eCFP a été remplacée par une séquence eCFP optimisée en codons pour empêcher la recombinaison avec la séquence YFP. La nouvelle séquence capteur de glucose a été clonée dans un vecteur lentiviral sous le contrôle d'un promoteur Hef1 et avec une cassette de résistance à la puromycine. Ces constructions, ainsi que des vecteurs d'emballage de troisième génération, des cellules HEK293T et le concentrateur LentiX (Clontech) ont été utilisés pour générer et concentrer des particules lentivirales. Les organoïdes ont été transduits de manière lentivirale comme décrit dans la réf. 97). En bref, les organoïdes ont été trypsinisés et incubés avec du virus concentré (60 min tout en centrifugeant à 600 tr/min à température ambiante suivi de 4 h à 37 ° C). Ensuite, les organoïdes ont été étalés dans du Matrigel.

Les organoïdes ont été lavés une fois avec et collectés dans du PBS glacé, additionné de NaF 5 mM (Vwr, #1.06449.0350) et de NaVO3 1 mM (Sigma, #S6508). Les organoïdes ont été centrifugés et les culots ont été incubés dans une solution de récupération cellulaire, additionnée de NaF et de NaVO3 sur de la glace pendant 15 minutes. Lors de la centrifugation, les culots ont été lysés dans un tampon de lyse (50 mM Tris pH 7,0, 1 % TX-100, 15 µM MgCl2, 5 µM EDTA, 0,1 mM NaCl, 5 mM NaF, 1 mM NaVO3, 1 µg/mL Leupeptin (Sigma, # 11034626001) et 1 µg / ml d'aprotinine (Sigma, # 10981532001) et la teneur en protéines ont été déterminées par le test de protéines Biorad (# 500-0006). Les échantillons ont été ajustés pour la teneur en protéines et un tampon d'échantillon Laemli a été ajouté. Les protéines ont été analysées dans SDS -PAGE et transféré sur des membranes de transfert Immobilon Polyscreen PVDF (#IPVH00010, Merck Millipore) ou sur des membranes de nitrocellulose Amersham Protan (#10600001 GE Healthcare Life Sciences). Une analyse Western blot a été réalisée avec des anticorps primaires reconnaissant : la vinculine (1:10 000, Sigma, # V9131), Tubuline (1:5000, Merck Millipore, #CP06 OS), γH2AX (1:10 000, Sigma, #05-636), pChk1(S345) (1:2000, Cell Signaling, #2348, Chk1 (1 : 1000, Santa Cruz, #SC-8408), pChk2(T68) (1:1000, Cell Signaling, #2661), Chk2 (1:1000, Cell Signaling, #3440 et Santa Cruz, #SC-9064), pRb( S780) (1:2000, Signalisation cellulaire, #9307), Rb (1:1000, Santa Cruz, #SC-7905), p53 (1:1000, Santa Cruz, #SC-126), p21 (1:1000, BD Bioscience, #556430), pPDH(S293) (1:1000, Abcam, #ab92696) et PDH (1:1000, Invitrogen, #459400). Des anticorps secondaires conjugués à la HRP ciblant les IgG de souris et de lapin ont été achetés auprès de Biorad (1:10 000).

Les organoïdes ont été collectés dans un milieu DMEM/F12 glacé, additionné de pénicilline/streptomycine, HEPES 10 mM et 1x Glutamax (milieu DMEM/F12 +++) puis incubés avec de la trypsine (Sigma). Pour l'analyse de la viabilité cellulaire, les cellules ont été colorées avec du DAPI (Sigma-Aldrich, #D9564) sur de la glace pendant 5 min et immédiatement analysées par cytométrie en flux. La viabilité a été déterminée par coloration DAPI, où les cellules DAPI− étaient considérées comme vivantes et les cellules DAPI+ comme mortes.

Pour la coloration γH2AX, l'analyse du profil du cycle cellulaire et l'analyse de l'incorporation d'EdU, des cellules individuelles ont été fixées dans (PFA) (# 1004965000, Merck Millipore) à température ambiante pendant 10 min et perméabilisées pendant la nuit sur de la glace avec 70% d'EtOH. Pour la coloration γH2AX, l'analyse du profil du cycle cellulaire, les organoïdes ont été lavés une fois avec 10 ml de PBS + 1% de BSA et 0,02% de tween, incubés avec Phospho-Histone H2A.X (Ser 139) -Alexa Fluor 488 (eBioscience, # 53-9865- 82) pendant 30 min à TA, à l'abri de la lumière. Pour le profilage du cycle cellulaire, les organoïdes ont été incubés avec de la RNAse (100 µg/ml) dans du PBS pendant 20 min à température ambiante et avec du DAPI pendant 2 h, sur de la glace, à l'abri de la lumière. Pour la détection EdU, les cellules ont été colorées par le kit de test de cytométrie Click-iT Plus EdU Pacific Blue Flow (Thermo fisher, #C10636) conformément aux instructions du fabricant. La cytométrie en flux a été réalisée en utilisant un BD FACS Celesta #660345.

Les organoïdes ont été lavés une fois dans du PBS glacé, ont été collectés dans 1 ml de solution de récupération de cellules glacées (Corning, # 354253) et 1 ml de PBS glacé dans un tube de 15 ml, et ont été incubés sur de la glace pendant 10 minutes . Les organoïdes ont été lavés une fois avec du PBS glacé et ont été fixés par du PFA à 4 % (#1004965000, Merck Millipore) pendant 20 min à température ambiante et stockés dans du PBS à 4 °C. Pour la coloration, les organoïdes ont été transférés dans des tubes Eppendorf de 1,5 mL. Les organoïdes ont été perméabilisés avec du tampon PBS contenant 10 % de DMSO, 2 % de Triton X-100 et 10 g l-1 BSA pendant 4 h à 4 °C. Les organoïdes ont été colorés avec des anticorps primaires (γH2AX 1:400, Sigma, #05-636 et Ki67 1:200, Abcam, #ab15580) pendant la nuit, des anticorps secondaires conjugués à un fluorophore Alexa (Invitrogen) pendant 4 h et avec du DAPI pendant 1 h à 4 °C. L'imagerie a été réalisée à l'aide d'un microscope confocal SP8 (Leica Microsystems). La microscopie optique a été réalisée à l'aide du système d'imagerie EVOS M5000 (Invitrogen).

L'analyse d'image a été effectuée dans ImageJ. Pour l'analyse d'image, les images ont été converties en images 32 bits. Les noyaux ont été automatiquement détectés par la macro Stardist-2D basée sur la coloration DAPI. Au sein de ces ROI, les intensités de gH2AX, KI67 ou STAR ont été déterminées. Les cellules STAR- et STAR+ ont été identifiées comme les noyaux avec respectivement 20 % d'intensités STAR les plus basses et les plus élevées par organoïde. Pour la positivité de Ki67, un seuil d'intensité de 20 a été utilisé.

L'imagerie du capteur FRET de glucose FLII12Pglu-700uDelta6 a été réalisée dans 4 expériences indépendantes. L'analyse des données a été effectuée dans ImageJ. Les images des canaux YFP et CFP ont été converties en images 32 bits, un seuillage automatique a été effectué et le rapport YFP/CFP a été visualisé à l'aide de l'outil de calcul d'image. Les ratios YFP/YFP ont été quantifiés en mesurant la moyenne des ratios dans des organoïdes entiers.

7 jours après la trypsinisation, les organoïdes ont été replaqués dans une plaque à 96 puits (5 µL de BME/puits, 5 puits/condition). Après 3 jours d'incubation dans un milieu de différenciation (t = 0), du 5-FU a été administré et les organoïdes ont été imagés tous les 2 jours au système d'imagerie EVOS M5000. La taille des organoïdes a été analysée par analyse manuelle dans ImageJ.

7 jours après la trypsinisation, les organoïdes ont été replaqués dans une plaque à 96 puits (5 µL de Matrigel/puits, 3 puits/condition). Pour l'analyse de la viabilité cellulaire, les organoïdes ont été colorés avec le test CyQUANT Direct (Thermofisher, #C35011) selon les instructions du fabricant pour détecter les cellules vivantes et Hoechst (#H1399, Life Technologies) pour détecter toutes les cellules mortes et vivantes, pendant 1 h à 37 °C. Les organoïdes ont été imagés sur un Cell observer Z1 (Zeiss).

Dans imageJ, les images ont été converties en 32 bits et des projections maximales d'images C1 (CyQUANT) et C3 (Hoechst) ont été créées. Les organoïdes dans les deux canaux ont été automatiquement détectés par la macro Stardist-2D pour générer des régions d'intérêt (ROI) reflétant respectivement les parties vivantes (ROI vivantes) et les organoïdes totaux (ROI totaux). Dans les images C1, les ROI vivantes ont été masquées et converties en images binaires. Maintenant, dans les images C1 binaires, les retours sur investissement totaux ont été importés, et la zone en % des retours sur investissement vivants a été déterminée dans ces retours sur investissement totaux et utilisée comme score de viabilité par organoïde.

7 jours après la trypsinisation, les organoïdes ont été replaqués dans une plaque de 24 puits (4 gouttelettes de 11 µL) et cultivés sur un milieu de différenciation. Au bout de 3 jours, le milieu a été rafraîchi et du DCA (20 mM) a été ajouté. Après 20 h, du 5-FU (50 µM) a été administré et les organoïdes ont été cultivés pendant 48 h. Ensuite, les médicaments ont été lavés et les organoïdes ont été cultivés pendant 7 jours supplémentaires sur un milieu de différenciation. Après 7 jours, les organoïdes ont été trypsinisés en petits amas et replaqués dans du Matrigel dans une plaque à 24 puits et dans une plaque à 96 puits (5 µL de Matrigel/puits, 4 puits/condition). Après 4 jours, les organoïdes dans une plaque à 24 puits ont été imagés par EVOS. Les organoïdes dans une plaque à 96 puits ont été colorés avec le test CyQUANT Direct (Thermofisher, # C35011) conformément aux instructions du fabricant et Hoechst pendant 1 h à 37 ° C. Les organoïdes ont été imagés sur un Cell observer Z1 (Zeiss).

Dans imageJ, les images ont été converties en 32 bits et des projections maximales d'images C1 (CyQUANT) ont été créées. Les organoïdes vivants (particules) ont été automatiquement détectés par la macro Stardist-2D.

L'analyseur Seahorse Bioscience XFe24 a été utilisé pour mesurer les taux d'acidification extracellulaire (ECAR) en milli pH (mpH) par minute et les taux de consommation d'oxygène (OCR) en pmol O2 par minute, comme décrit précédemment67. En bref, les organoïdes ont été ensemencés dans 3 μL de Matrigel par puits dans des microplaques de culture cellulaire XF24 (Seahorse Bioscience). 1 h avant les mesures, le milieu de culture a été remplacé par du milieu de dosage et les organoïdes ont été incubés pendant 60 min à 37 °C. Pour les expériences avec du DCA, du DCA a également été ajouté au milieu de dosage. Pour le test de stress mitochondrial, le milieu de culture a été remplacé par le milieu Seahorse XF Base (Seahorse Bioscience), additionné de 10 mM de glucose (Sigma-Aldrich), 2 mM de l-glutamine (Sigma-Aldrich), 5 mM de pyruvate (Sigma-Aldrich) et 0,56 μL ml-1 NaOH (1 M). Au cours du test, 5 μM d'oligomycine, 2 μM de FCCP et 1 μM de roténone et d'antimycine A (tous Sigma-Aldrich) ont été injectés dans chaque puits après 18, 45 et 63 min, respectivement. Pour le test de stress de glycolyse, le milieu de culture a été remplacé par le milieu Seahorse XF Base, additionné de 2 mM de L-glutamine et de 0,52 μL mL-1 NaOH (1 M). Au cours du test, 10 mM de glucose, 5 μM d'oligomycine et 100 mM de 2-désoxyglucose (Sigma-Aldrich) ont été injectés dans chaque puits après 18, 36 et 65 min, respectivement. Après les injections, des mesures de 2 min ont été réalisées en triplo, précédées de 4 min de temps de mélange. Les premières mesures après les injections d'oligomycine ont été précédées d'un temps de mélange de 5 min, suivi d'un temps d'attente de 8 min pour le test de stress mitochondrial et d'un temps de mélange de 5 min suivi d'un temps d'attente de 10 min pour le test de stress de la glycolyse. Les valeurs OCR et ECAR par groupe ont été normalisées par rapport à la quantité totale d'ADN présente dans tous les puits du groupe correspondant.

Les solvants organiques étaient de qualité ULC-MS et achetés chez Biosolve (Valkenswaard, Pays-Bas). Les produits chimiques et les étalons étaient de qualité analytique et achetés auprès de Sigma-Aldrich (Zwijndrecht, Pays-Bas). L'eau a été obtenue le jour de l'utilisation à partir d'un instrument Milli Q (Merck Millipore, Amsterdam, Pays-Bas).

Pour la métabolomique, 3 puits avec 200 µL de Matrigel contenant des organoïdes ont été utilisés par condition. Pendant le traitement, le milieu et les médicaments ont été rafraîchis 7 h avant le prélèvement. Au moment de la collecte, de chaque puits, 500 ul de milieu par puits ont été recueillis, regroupés avec le milieu des autres puits de la même condition et congelés instantanément dans de l'azote liquide dans des tubes Eppendorf de 2 ml. Les organoïdes de la même condition ont été regroupés lors de la collecte. Les organoïdes ont été lavés une fois avec du PBS glacé, puis collectés dans du PBS glacé dans un tube Falcon de 15 mL. Après un autre lavage avec du PBS glacé, les organoïdes ont été transférés dans des tubes Eppendorf de 2 ml, centrifugés, remis en suspension dans du méthanol glacé à 80 % et congelés instantanément dans de l'azote liquide.

Les échantillons ont été évaporés à sec dans un Labconco Centrivap (VWR, Amsterdam, Pays-Bas). Au résidu, 350 ul d'eau, 10 ul d'étalon interne de ribitol 1 mM dans l'eau, 375 ul de méthanol et 750 ul de chloroforme ont été ajoutés. Après mélange au vortex puisé, les échantillons ont été incubés pendant 2 h dans un agitateur thermostaté VWR (900 tr/min, 37 °C). Après centrifugation à température ambiante (10 min, 15 000 × g), la phase aqueuse supérieure a été transférée quantitativement dans un tube Eppendorf propre de 1,5 µL et évaporée à sec pendant une nuit dans le Labconco Centrivap. Le résidu a été dissous dans 100 µL d'eau, transféré dans un flacon d'injection et maintenu à 6 °C pendant l'analyse LC-MS.

L'analyse LC-MS a été réalisée à l'aide d'une colonne Atlantis premier BEH-C18 AX de 2,1 × 100 mm (2,1 × 100, 2,5 µm) connectée à une colonne VanGuard, toutes deux achetées chez Waters (Etten-Leur, Pays-Bas). La configuration de la colonne a été installée dans un système Ultimate 3000 LC (Thermo Scientific, Breda, Pays-Bas). La sortie de la colonne a été couplée à un spectromètre de masse Thermo Scientific Q-Exactive FT équipé d'une source d'ions HESI. Le système UPLC fonctionnait à un débit de 250 μL min-1 et la colonne était maintenue à 30 °C. Les phases mobiles se composaient d'acétate d'ammonium 10 mM et d'hydroxyde d'ammonium 0,04 (v/v) dans l'eau, pH 9 (A) et d'acétonitrile (B), respectivement. Lors de l'injection d'échantillon de 5 µL, le système a été maintenu à 0 % de B pendant 1 min, suivi d'un gradient linéaire de 4 min de 0 à 30 % de B. Par la suite, le gradient a augmenté linéairement jusqu'à 95 % de B en 3 min et maintenu à 95 % pendant 2 min. La colonne a été régénérée à 0% B pendant 6 min avant une prochaine injection. Tous les échantillons ont été injectés trois fois (3 répétitions techniques). Les données de spectrométrie de masse ont été acquises sur une plage de balayage de m/z 72 à 900. Le système fonctionnait à -2,5 kV (mode négatif) et une résolution de masse de 120 000. Les autres réglages de la source étaient les suivants : température du tube de transfert et du vaporisateur à 350 °C et 300 °C, et pression du gaz gaine et du gaz auxiliaire à 35 et 10, respectivement. Pour une précision de masse élevée, un étalonnage de masse a été effectué avant chaque expérience. Les fichiers de données brutes ont été traités et analysés à l'aide du logiciel XCalibur Quan.

L'analyse statistique pour l'analyse d'image, la cytométrie en flux et les résultats de la métabolomique a été réalisée à l'aide de Graphpad Prism 8. La première distribution gaussienne des données a été testée par un test de Shapiro-Wilk pour ensuite appliquer des statistiques paramétriques ou non paramétriques. Les détails des statistiques sont décrits dans les légendes des figures.

Les tailles d'échantillon représentées dans les légendes des figures se réfèrent au nombre d'expériences indépendantes, sauf indication contraire. Lorsque la taille de l'échantillon fait référence à des répliques techniques, cela est expliqué dans les légendes des figures. Pour la métabolomique, les répétitions techniques provenaient de mesures répétées. Dans tous les autres cas, les répliques techniques provenaient d'échantillons distincts.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données générées au cours de cette étude sont incluses dans cet article. Les données sources sont fournies en tant que données supplémentaires 1 (chiffres principaux) et 2 (chiffres supplémentaires). Les images de transfert non recadrées et non éditées sont incluses dans la Fig. 7 supplémentaire.

Sung, H. et al. Statistiques mondiales sur le cancer 2020 : Estimations GLOBOCAN de l'incidence et de la mortalité dans le monde pour 36 cancers dans 185 pays. CA Cancer J. Clin. 71, 209–249 (2021).

Article PubMed Google Scholar

Punt, CJA, Koopman, M. & Vermeulen, L. De l'hétérogénéité tumorale aux progrès du traitement de précision du cancer colorectal. Nat. Rév. Clin. Oncol. 14, 235-246 (2017).

Article PubMed CAS Google Scholar

Giacchetti, S. et al. Essai randomisé multicentrique de phase III de l'oxaliplatine ajouté à la fluorouracile-leucovorine chronomodulée comme traitement de première ligne du cancer colorectal métastatique. J.Clin. Oncol. 18, 136-147 (2000).

Article PubMed CAS Google Scholar

Douillard, JY et al. L'irinotécan associé au fluorouracile comparé au fluorouracile seul en traitement de première ligne du cancer colorectal métastatique : un essai randomisé multicentrique. Lancette 355, 1041-1047 (2000).

Article PubMed CAS Google Scholar

Johnston, PG & Kaye, S. Capecitabine : un nouvel agent pour le traitement des tumeurs solides. Médicaments anticancéreux 12, 639–646 (2001).

Article PubMed CAS Google Scholar

André, T. et al. Adjuvant fluorouracile, leucovorine et oxaliplatine dans le cancer du côlon de stade II à III : survie à 10 ans et résultats actualisés en fonction de la mutation BRAF et de l'état de réparation des mésappariements de l'étude MOSAIC. J.Clin. Oncol. 33, 4176–4187 (2015).

Article PubMed Google Scholar

Pahlman, LA et al. Faut-il réévaluer le bénéfice de la chimiothérapie adjuvante dans le cancer du côlon ? J.Clin. Oncol. 34, 1297-1299 (2016).

Article PubMed Google Scholar

Vodenkova, S. et al. 5-fluorouracile et autres fluoropyrimidines dans le cancer colorectal : passé, présent et futur. Pharmacol. Là. 206, 107447 (2020).

Article PubMed CAS Google Scholar

Longley, DB, Harkin, DP & Johnston, PG 5-fluorouracile : mécanismes d'action et stratégies cliniques. Nat. Rev. Cancer 3, 330–338 (2003).

Article PubMed CAS Google Scholar

Hoskins, J. & Scott Butler, J. Preuve de mécanismes distincts basés sur l'ADN et l'ARN de la cytotoxicité du 5-fluorouracile chez Saccharomyces cerevisiae. Levure 24, 861–870 (2007).

Article PubMed CAS Google Scholar

Kufe, DW & Major, PP L'incorporation de 5-fluorouracile dans l'ARN du carcinome du sein humain est en corrélation avec la cytotoxicité. J. Biol. Chim. 256, 9802–9805 (1981).

Article PubMed CAS Google Scholar

Glazer, RI & Lloyd, LS Association de la létalité cellulaire avec incorporation de 5-fluorouracile et de 5-fluorouridine dans l'ARN nucléaire de cellules de carcinome du côlon humain en culture. Mol. Pharmacol. 21, 468–473 (1982).

PubMed CAS Google Scholar

Geoffroy, FJ, Allegra, CJ, Sinha, B. & Grem, JL Cytotoxicité accrue avec l'interleukine-1 alpha et le 5-fluorouracile dans les cellules cancéreuses du côlon HCT116. Oncol. Rés. 6, 581-591 (1994).

PubMed CAS Google Scholar

Pritchard, DM, Watson, AJ, Potten, CS, Jackman, AL & Hickman, JA Inhibition par l'uridine mais pas la thymidine de l'apoptose intestinale dépendante de p53 initiée par le 5-fluorouracile : preuve de l'implication d'une perturbation de l'ARN. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 94, 1795–1799 (1997).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Salonga, D. et al. Les tumeurs colorectales répondant au 5-fluorouracile ont de faibles niveaux d'expression génique de la dihydropyrimidine déshydrogénase, de la thymidylate synthase et de la thymidine phosphorylase. Clin. Cancer Rés. 6, 1322–1327 (2000).

PubMed CAS Google Scholar

Qiu, L.-X. et coll. Valeur prédictive de l'expression de la thymidylate synthase chez les patients atteints d'un cancer colorectal avancé recevant une chimiothérapie à base de fluoropyrimidine : preuves issues de 24 études. Int. J. Cancer 123, 2384–2389 (2008).

Article PubMed CAS Google Scholar

Lenz, HJ et al. Mutations ponctuelles de p53 et taux d'ARN messager de la thymidylate synthase dans le cancer colorectal disséminé : une analyse de la réponse et de la survie. Clin. Cancer Rés. 4, 1243-1250 (1998).

PubMed CAS Google Scholar

Iyevleva, AG et al. Mesure des transcrits DPD et TS visant à prédire le bénéfice clinique des fluoropyrimidines : confirmation de la tendance des séries russes de cancers colorectaux et mise en garde sur les gènes arbitres. Onkologie 30, 295–300 (2007).

PubMed CAS Google Scholar

Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, DB & Johnston, PG Résistance aux médicaments anticancéreux : un paradigme en évolution. Nat. Rev. Cancer 13, 714–726 (2013).

Article PubMed CAS Google Scholar

Burrell, RA, McGranahan, N., Bartek, J. & Swanton, C. Les causes et les conséquences de l'hétérogénéité génétique dans l'évolution du cancer. Nature 501, 338–345 (2013).

Article PubMed CAS Google Scholar

Vermeulen, L., de Sousa et Melo, F., Richel, DJ & Medema, JP Le développement du modèle des cellules souches cancéreuses : défis et opportunités cliniques. Lancette Oncol. 13, e83–e89 (2012).

Article PubMed Google Scholar

Pe'er, D. et al. Hétérogénéité tumorale. Cellule cancéreuse 39, 1015-1017 (2021).

Article PubMed Google Scholar

Cortina, C. et al. Une approche d'édition du génome pour étudier les cellules souches cancéreuses dans les tumeurs humaines. EMBO Mol. Méd. 9, 869–879 (2017).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Shimokawa, M. et al. Visualisation et ciblage des cellules souches humaines LGR5+ du cancer du côlon. Nature 545, 187-192 (2017).

Article PubMed CAS Google Scholar

Vermeulen, L. et al. L'activité Wnt définit les cellules souches du cancer du côlon et est régulée par le microenvironnement. Nat. Cell Biol. 12, 468–476 (2010).

Article PubMed CAS Google Scholar

Liu, C. et al. Le modèle de dépistage des drogues rencontre la technologie organoïde du cancer. Trad. Oncol. 13, 100840 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

van de Wetering, M. et al. Dérivation prospective d'une biobanque organoïde vivante de patients atteints de cancer colorectal. Cellule 161, 933–945 (2015).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Nagle, PW, Plukker, JTM, Muijs, CT, van Luijk, P. & Coppes, RP Organoïdes tumoraux dérivés du patient pour la prédiction de la réponse au traitement du cancer. Sémin. Cancer Biol. 53, 258-264 (2018).

Article PubMed CAS Google Scholar

Vlachogiannis, G. et al. Les organoïdes dérivés du patient modélisent la réponse au traitement des cancers gastro-intestinaux métastatiques. Sciences 359, 920–926 (2018).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Tiriac, H. et al. Le profilage organoïde identifie les répondeurs communs à la chimiothérapie dans le cancer du pancréas. Découverte du cancer. 8, 1112-1129 (2018).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Ooft, SN et al. Les organoïdes dérivés du patient peuvent prédire la réponse à la chimiothérapie chez les patients atteints d'un cancer colorectal métastatique. Sci. Trad. Méd. 11, eaay2574 (2019).

Yan, HHN et al. Une biobanque organoïde complète du cancer gastrique humain capture l'hétérogénéité des sous-types de tumeurs et permet le dépistage thérapeutique. Cellule souche cellulaire 23, 882–897.e11 (2018).

Article PubMed CAS Google Scholar

de Witte, CJ et al. Les organoïdes du cancer de l'ovaire dérivés du patient imitent la réponse clinique et présentent des réponses médicamenteuses hétérogènes inter et intra-patients. Cell Rep. 31, 107762 (2020).

Article PubMed Google Scholar

Costales-Carrera, A. et al. Plocabuline Affiche une forte activité cytotoxique dans un test organoïde 3D personnalisé dérivé d'un patient atteint d'un cancer du côlon. Mar. Drugs 17, 648 (2019).

Wood, LD et al. Les paysages génomiques des cancers du sein et colorectaux humains. Sciences 318, 1108-1113 (2007).

Article PubMed CAS Google Scholar

Réseau Atlas du génome du cancer. Caractérisation moléculaire complète du cancer du côlon et du rectum humain. Nature 487, 330–337 (2012).

Article Google Scholar

Drost, J. et al. Mutations cancéreuses séquentielles dans des cellules souches intestinales humaines cultivées. Nature 521, 43–47 (2015).

Article PubMed CAS Google Scholar

Fumagalli, A. et al. Dissection génétique de la progression du cancer colorectal par transplantation orthotopique d'organoïdes cancéreux modifiés. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 114, E2357–E2364 (2017).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Williams, AB & Schumacher, B. p53 dans le processus de réparation des dommages à l'ADN. Cold Spring Harb. Perspective. Méd. 6, a026070 (2016).

Liao, H., Ji, F., Helleday, T. & Ying, S. Mécanismes de stabilisation de la fourche de réplication bloquée : nouvelles cibles pour les stratégies de létalité synthétique dans les traitements contre le cancer. EMBO Rep. 19, e46263 (2018).

Ubhi, T. & Brown, GW Exploitation du stress de réplication de l'ADN pour le traitement du cancer. Cancer Rés. 79, 1730-1739 (2019).

Article PubMed CAS Google Scholar

Zeman, MK & Cimprich, KA Causes et conséquences du stress de réplication. Nat. Cell Biol. 16, 2–9 (2014).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Reaper, PM et al. Destruction sélective des cellules cancéreuses déficientes en ATM ou p53 par inhibition de l'ATR. Nat. Chim. Biol. 7, 428-430 (2011).

Article PubMed CAS Google Scholar

Lee, J.-H. & Paull, l'activation de TT ATM par l'ADN double brin traverse le complexe Mre11-Rad50-Nbs1. Sciences 308, 551-554 (2005).

Article PubMed CAS Google Scholar

Hickson, I. et al. Identification et caractérisation d'un nouvel inhibiteur spécifique de la kinase ATM mutée dans l'ataxie-télangiectasie. Cancer Rés. 64, 9152–9159 (2004).

Article PubMed CAS Google Scholar

de Sousa et Melo, F. et al. Un rôle distinct pour les cellules souches Lgr5 + dans le cancer du côlon primaire et métastatique. Nature 543, 676–680 (2017).

Article PubMed Google Scholar

Tammela, T. et al. Une niche productrice de Wnt stimule le potentiel prolifératif et la progression de l'adénocarcinome pulmonaire. Nature 545, 355–359 (2017).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Oost, KC et al. Marquage spécifique de l'activité des cellules souches dans les organoïdes colorectaux humains à l'aide d'un minigène sensible à l'ASCL2. Cell Rep. 22, 1600–1614 (2018).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Fumagalli, A. et al. La plasticité des cellules cancéreuses Lgr5 négatives entraîne des métastases dans le cancer colorectal. Cellule souche cellulaire 26, 569–578.e7 (2020).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Heinz, MC, Oost, KC & Snippert, HJG Présentation du reporter STAR de cellules souches ASCL2 dans les organoïdes intestinaux. Protocole STAR 1, 100126 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Lindeboom, RG et al. Analyse multi-omique intégrative de la différenciation des organoïdes intestinaux. Mol. Syst. Biol. 14, e8227 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Ahnen, DJ et al. La mutation Ki-ras et la surexpression de p53 prédisent le comportement clinique du cancer colorectal : une étude du Southwest Oncology Group. Cancer Rés. 58, 1149-1158 (1998).

PubMed CAS Google Scholar

Cascinu, S. et al. La détermination immunohistochimique de la protéine p53 ne prédit pas la réponse clinique dans le cancer colorectal avancé avec une faible expression de la thymidylate synthase recevant une combinaison bolus 5-fluorouracile-leucovorine. Ann. Oncol. 11, 1053-1056 (2000).

Article PubMed CAS Google Scholar

Liang, J.-T. et coll. La surexpression de P53 prédit une faible chimiosensibilité à la chimiothérapie à haute dose de 5-fluorouracile plus leucovorine pour les cancers colorectaux de stade IV après résection intestinale palliative. Int. J. Cancer 97, 451–457 (2002).

Article PubMed CAS Google Scholar

Paradiso, A. et al. Thymidilate synthase et expression tumorale primaire de p53 comme facteurs prédictifs pour les patients atteints de cancer colorectal avancé. Br. J. Cancer 82, 560-567 (2000).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Boyer, J. et al. Caractérisation de lignées cellulaires de cancer colorectal p53 sauvage et isogénique nulle résistantes au 5-fluorouracile, à l'oxaliplatine et à l'irinotécan. Clin. Cancer Rés. 10, 2158-2167 (2004).

Article PubMed CAS Google Scholar

Kaeser, MD, Pebernard, S. & Iggo, RD Régulation de la stabilité et de la fonction de p53 dans les cellules cancéreuses du côlon HCT116. J. Biol. Chim. 279, 7598–7605 (2004).

Article PubMed CAS Google Scholar

Bunz, F. et al. La perturbation de p53 dans les cellules cancéreuses humaines modifie les réponses aux agents thérapeutiques. J.Clin. Investir. 104, 263–269 (1999).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Lowe, SW, Ruley, HE, Jacks, T. & Housman, DE L'apoptose dépendante de p53 module la cytotoxicité des agents anticancéreux. Cellule 74, 957–967 (1993).

Article PubMed CAS Google Scholar

Longley, DB et al. Le rôle de l'induction de la thymidylate synthase dans la modulation de l'expression génique régulée par p53 en réponse au 5-fluorouracile et aux antifolates. Cancer Rés. 62, 2644–2649 (2002).

PubMed CAS Google Scholar

Elsaleh, H. et al. L'altération de P53 et l'instabilité des microsatellites ont une valeur prédictive pour le bénéfice de survie de la chimiothérapie dans le carcinome colorectal de stade III. Clin. Cancer Rés. 7, 1343–1349 (2001).

PubMed CAS Google Scholar

Chen, J. L'arrêt du cycle cellulaire et les fonctions apoptotiques de p53 dans l'initiation et la progression de la tumeur. Cold Spring Harb. Perspective. Méd. 6, a026104 (2016).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Frire, DW et al. Inhibition spécifique de la kinase cycline-dépendante 4/6 par PD 0332991 et activité antitumorale associée dans les xénogreffes tumorales humaines. Mol. Cancer Ther. 3, 1427-1438 (2004).

Article PubMed CAS Google Scholar

Vousden, KH & Prives, C. Aveuglé par la lumière : la complexité croissante de p53. Cellule 137, 413–431 (2009).

Article PubMed CAS Google Scholar

Jiménez, A. et al. La transcriptomique et la protéomique des séries chronologiques révèlent des modes alternatifs pour décoder les oscillations de p53. Mol. Syst. Biol. 18, e10588 (2022).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Ser, Z. et al. Cibler un métabolisme carboné avec un antimétabolite perturbe l'homéostasie des pyrimidines et induit un débordement de nucléotides. Cell Rep. 15, 2367–2376 (2016).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Ludikhuize, MC, Meerlo, M., Burgering, BMT et Rodríguez Colman, MJ Protocole pour profiler la bioénergétique des organoïdes à l'aide de Seahorse. Protocole STAR 2, 100386 (2021).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Pajak, B. et al. 2-Deoxy-d-Glucose et ses analogues : des agents diagnostiques aux agents thérapeutiques. Int. J. Mol. Sci. 21, 234 (2019).

Zahra, K., Dey, T., Ashish, Mishra, SP & Pandey, U. Pyruvate kinase M2 et cancer : le rôle de PKM2 dans la promotion de la tumorigenèse. Devant. Oncol. 10, 159 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Angiari, S. et al. L'activation pharmacologique de la pyruvate kinase M2 inhibe la pathogénicité des lymphocytes T CD4+ et supprime l'auto-immunité. Cellule Metab. 31, 391–405.e8 (2020).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Takanaga, H., Chaudhuri, B. & Frommer, WB GLUT1 et GLUT9 en tant que contributeurs majeurs à l'afflux de glucose dans les cellules HepG2 identifiées par un capteur de glucose FRET intramoléculaire à haute sensibilité. Biochim. Biophys. Acta 1778, 1091-1099 (2008).

Article PubMed CAS Google Scholar

Moscou, JA, Fojo, T. & Schilsky, RL Le cadre de preuves pour la médecine de précision contre le cancer. Nat. Rév. Clin. Oncol. 15, 183–192 (2018).

Article PubMed Google Scholar

Noordhuis, P. et al. Incorporation de 5-fluorouracile dans l'ARN et l'ADN en relation avec l'inhibition de la thymidylate synthase des cancers colorectaux humains. Ann. Oncol. 15, 1025-1032 (2004).

Article PubMed CAS Google Scholar

Aschele, C., Sobrero, A., Faderan, MA et Bertino, JR Nouveau(x) mécanisme(s) de résistance au 5-fluorouracile dans les sous-lignées du cancer du côlon humain (HCT-8) après exposition à deux schémas posologiques différents cliniquement pertinents. Cancer Rés. 52, 1855–1864 (1992).

PubMed CAS Google Scholar

Aschele, C. et al. L'expression de la protéine thymidylate synthase dans les métastases du cancer colorectal prédit le résultat clinique du bolus modulé par la leucovorine ou du 5-fluorouracile en perfusion, mais pas du bolus 5-fluorouracile modulé par le méthotrexate. Ann. Oncol. 13, 1882–1892 (2002).

Article PubMed CAS Google Scholar

Humeniuk, R. et al. Diminution des niveaux d'UMP kinase en tant que mécanisme de résistance à la fluoropyrimidine. Mol. Cancer Ther. 8, 1037-1044 (2009).

Article PubMed CAS Google Scholar

Zheng, J.-F. & Wang, H.-D. Concentration de 5-fluorouracile dans le sang, le foie et les tissus tumoraux et apoptose des cellules tumorales après 5'-désoxy-5-fluorouridine orale préopératoire chez des patients atteints de carcinome hépatocellulaire. Monde J. Gastroenterol. 11, 3944–3947 (2005).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Li, M.-H. et coll. Effet du 5-fluorouracile sur la régulation du cycle cellulaire en phase G1 dans les lignées cellulaires cancéreuses de la bouche. Oral. Oncol. 40, 63–70 (2004).

Article PubMed CAS Google Scholar

Sun, X.-X., Dai, M.-S. & Lu, H. L'activation de p53 par le 5-fluorouracile implique une interaction MDM2-protéine ribosomique. J. Biol. Chim. 282, 8052–8059 (2007).

Article PubMed CAS Google Scholar

Hernández-Vargas, H. et al. Profilage transcriptionnel des cellules cancéreuses du sein MCF7 en réponse au 5-fluorouracile : relation avec les modifications du cycle cellulaire et l'apoptose, et identification de nouvelles cibles de p53. Int. J. Cancer 119, 1164-1175 (2006).

Article PubMed Google Scholar

Park, SR et al. Analyse du transcriptome unicellulaire de la réponse des cellules cancéreuses du côlon aux dommages à l'ADN induits par le 5-fluorouracile. Cell Rep. 32, 108077 (2020).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Beckerman, R. & Prives, C. Régulation transcriptionnelle par p53. Cold Spring Harb. Perspective. Biol. 2, a000935 (2010).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Kastenhuber, ER & Lowe, SW Mise en contexte de la p53. Cellule 170, 1062-1078 (2017).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Segeren, HA, van Liere, EA, Riemers, FM, de Bruin, A. & Westendorp, B. Le RAS oncogénique sensibilise les cellules au stress de réplication induit par les médicaments via le silence transcriptionnel de P53. Oncogène https://doi.org/10.1038/s41388-022-02291-0 (2022).

Francescangeli, F. et al. Une population préexistante de cellules quiescentes ZEB2 + avec des caractéristiques souches et mésenchymateuses dicte la chimiorésistance dans le cancer colorectal. J. Exp. Clin. Cancer Rés. 39, 2 (2020).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Vander Heiden, MG, Cantley, LC & Thompson, CB Comprendre l'effet Warburg : les exigences métaboliques de la prolifération cellulaire. Sciences 324, 1029-1033 (2009).

Article Google Scholar

Villa, E., Ali, ES, Sahu, U. & Ben-Sahra, I. Les cellules cancéreuses règlent les voies de signalisation pour permettre la synthèse de novo des nucléotides. Cancers 11, 688 (2019).

Yun, J. et al. La privation de glucose contribue au développement de mutations de la voie KRAS dans les cellules tumorales. Sciences 325, 1555-1559 (2009).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Hutton, JE et al. Le KRAS et le BRAF oncogéniques entraînent une reprogrammation métabolique dans le cancer colorectal. Mol. Protéine cellulaire. 15, 2924-2938 (2016).

Article CAS Google Scholar

Tataranni, T. & Piccoli, C. Dichloroacétate (DCA) et cancer : un aperçu vers les applications cliniques. Oxyde. Méd. Cellule. Longev. 2019, 8201079 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

James, MO et al. Applications thérapeutiques du dichloroacétate et rôle de la glutathion transférase zeta-1. Pharmacol. Là. 170, 166-180 (2017).

Article PubMed CAS Google Scholar

Liang, Y. et al. Le dichloroacétate restaure la chimiosensibilité du cancer colorectal par la voie métabolique du glucose médiée par p53/miR-149-3p/PDK2. Oncogène 39, 469–485 (2020).

Article PubMed CAS Google Scholar

Liang, Y. et al. Le dichloroacétate surmonte la chimiorésistance à l'oxaliplatine dans le cancer colorectal par la voie miR-543/PTEN/Akt/mTOR. J. Cancer 10, 6037–6047 (2019).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Kawada, K., Toda, K. & Sakai, Y. Cibler la reprogrammation métabolique dans les cancers induits par KRAS. Int. J.Clin. Oncol. Rév. 22, 651–659 (2017).

Article PubMed CAS Google Scholar

Dahan, P., Lu, V., Nguyen, RMT, Kennedy, SAL & Teitell, MA Métabolisme en pluripotence : à la fois conducteur et passager ? J. Biol. Chim. 294, 5420–5429 (2019).

Article PubMed CAS Google Scholar

Ludikhuize, MC & Rodríguez Colman, MJ Régulation métabolique des cellules souches et différenciation : une perspective de facteur de transcription en boîte à fourche O. Antioxydant. Signal redox. 34, 1004-1024 (2021).

Article PubMed CAS Google Scholar

Van Lidth de Jeude, JF, Vermeulen, JLM, Montenegro-Miranda, PS, Van den Brink, GR & Heijmans, J. Un protocole pour la transduction lentivirale et l'analyse en aval des organoïdes intestinaux. J.Vis. Exp. https://doi.org/10.3791/52531 (2015).

Télécharger les références

Nous remercions HJG Snippert (UMC Utrecht) pour le partage du plasmide rapporteur de l'activité des cellules souches ; SEM van der Horst et HJG Snippert (UMC Utrecht) pour avoir partagé la construction de surexpression de P53 ; W. Frommer (Heinrich-Heine-University) pour avoir partagé le plasmide du capteur de glucose FRET ; I. Verlaan (UMC Utrecht) pour la préparation du milieu conditionné R-spondin et Noggin ; et A. Janssen et J. Lehman pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu financièrement par la Dutch Cancer Society (KWF 2016-I 10471, KWF 2017-II 11315).

Recherche moléculaire sur le cancer, Centre de médecine moléculaire, Centre médical universitaire d'Utrecht, 3584 CG, Utrecht, Pays-Bas

Marlies C. Ludikhuize, Sira Gevers, Nguyen TB Nguyen, Maaike Meerlo, S. Khadijeh Shafiei Roudbari, M. Can Gulersonmez, Edwin CA Stigter, Boudewijn MT Burgering & Maria J. Rodríguez Colman

Centre d'oncologie pédiatrique Princess Máxima, 3584 CS, Utrecht, Pays-Bas

Jarno Drost et Hans Clevers

Institut Oncode, Utrecht, Pays-Bas

Jarno Drost et Hans Clevers

Institut Hubrecht, Académie royale des arts et des sciences des Pays-Bas, 3584 CT, Utrecht, Pays-Bas

Hans Clevers & Boudewijn MT Burgering

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Conceptualisation, MJRC, MCL et BMTB ; méthodologie et enquête, MJRC, MCL, MM, SG, NTBN et SKSR ; métabolomique : MCG et ECAS ; développement du modèle organoïde de progression tumorale : JD et HC ; rédaction de manuscrits, MJRC et MCL; révision et édition, MJRC et BMTB ; acquisition de financement, MJRC et BMTB

Correspondance à Maria J. Rodríguez Colman.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Ozgur Sahin et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédactrices en chef de la manipulation principale : Maralice Conacci Sorrell et Eve Rogers. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Ludikhuize, MC, Gevers, S., Nguyen, NTB et al. Le recâblage du métabolisme du glucose améliore l'efficacité du 5-FU dans les tumeurs colorectales glycolytiques déficientes en p53/KRASG12D. Commun Biol 5, 1159 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04055-8

Télécharger la citation

Reçu : 26 novembre 2021

Accepté : 30 septembre 2022

Publié: 31 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04055-8

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.